免疫组织化学注意事项
细胞免疫组织化学实验流程及注意事项
九、细胞免疫组化实验
1. 细胞爬片的制作
(1) 细胞用消化液消化后，用完全培养基重悬细胞，调整细胞浓度为2-5×10^5ml ；
(2) 在无菌培养皿中铺上3 块细胞爬片（圆片），圆片间不要重叠；
(3) 取细胞悬液分别滴到圆片或载玻片上，注意不要滴到片外，让细胞贴片30min 左右;
(4) 30min后，在培养皿中补加完全培养液（轻微的加入，以免冲力将贴壁的细胞打下来），放于37°C，5%CO2培养箱中培养3h左右（让其贴壁更牢)
2. 组化前处理
(1) 取出培养皿，用PBS 漂洗3 次×2min （PBS 可以不灭菌）；
(2) 4%多聚甲醛处理（室温）10-30min ；
(3) PBS 漂洗，3 次×2min ；
(4) 0.2%Txiton X-100 处理（室温）10-15min ；
(5) PBS 漂洗，3×2min；
(6) 3%H2 O2 处理（室温）10min ，以消除过氧化物酶；
(7) PBS 漂洗，3 次×2min ；
3. 组化（同免疫组化）。
贴壁细胞需要做免疫组化时，可以在培养皿里放入盖玻片，让细胞长在上面后，在取出来进行实验。
需要注意的是：取出培养好细胞的盖玻片后，PBS洗两次后，室温晾干用PFA或丙酮室温或4度固定都可以，10～15分钟。
之后可按组化常规方法进行。
封片时将有细胞的面向下盖在载玻片上即可。
另外，用丙酮固定细胞的同时即对细胞膜进行了打孔的步骤，如果用PFA进行固定，则需要再使用打孔剂打孔（细胞内表达）。
使用过氧化氢去除内源性过氧化物酶时，细胞要比石蜡切片的组织反应强烈，偶尔会掉片。
免疫组化操作规程及操作流程
免疫组化操作规程一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。
二、实验器材微波炉、吹风机、组化笔、湿盒、烤箱、振荡器、染缸、光学显微镜、纯木浆卫生纸、计时器和通风橱等。
三、试剂配制1. 0.01 M PBS(pH 7.34 )：9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB 加双蒸水至1000 ml；1000 ml0.2M PB (pH 7.4)＝5.93 g NaH 2 PO 4 ·2H 2 O＋58.02 g Na 2 HPO 4 ·12H 2 O in 1000 ml 双蒸水或＝190 ml A + 810 ml B（A. 0.2 M NaH 2 PO 4 ·2H 2 O：15.6 g in 500 ml ddH 2 O；B. 0.2M Na 2 HPO 4 ·12H 2 O：71.632 g in 1000 ml dH 2 O）。
2. Citrate Buffered Saline（0.01 M 柠檬酸缓冲液，PH6.0）：28 ml A + 72 ml B + 200 ml ddH 2 O（A.Citrate acid（柠檬酸）：10.5 g 加双蒸水至1000 ml；B.Citrate sodium（柠檬酸钠）：29.41 g 加双蒸水至1000 ml）。
3. 细胞通透液：由终浓度分别为0.3%双氧水和0.3%Triton X-100 混合而成。
配制方法是先用微波加热的36 ml PBS，再接着加120 ul TritonX-100，并加热一会儿，冷却至临用前加0.4 ml 30％H 2 O 2 。
免疫组织化学的一般注意事项有
免疫组织化学中的注意事项
免疫组织化学是一项重要的实验技术，在生命科学研究中有着广
泛的应用。
然而，进行免疫组织化学实验需要注意一些细节和技巧，
以确保实验结果的准确性和可重复性。
以下是一些免疫组织化学中的
注意事项。
1. 标本预处理：标本的质量对结果影响很大。
在进行组织染色前，需要对标本进行处理，如切割、固定、脱水等。
标本中的脂类和胆固
醇会干扰标本的染色过程，因此需要彻底去除。
2. 抗体和抗原的配对：在进行免疫组织化学染色时，抗体和抗原
的配对至关重要。
不同的抗体可能对同一抗原具有不同的亲和力和特
异性，因此需要根据实验需要选择适当的抗体。
3. 免疫染色的条件：免疫染色条件也需要严格控制。
温度、时间
和缓冲液的组成都可以影响染色效果。
一些组织样本可能会对染色条
件很敏感，因此需要在实验过程中不断优化条件。
4. 染色结果的评估：染色结果需要准确评估，包括染色强度、特
异性和位置等。
这需要使用显微镜进行观察和分析，并需要有足够的
经验来检验染色结果的可靠性。
综上所述，免疫组织化学实验需要严格控制各项细节，并需要有
充足的实验经验和科学思维能力。
只有这样，才能获得可靠的实验结
果并推动生命科学的发展。
免疫组化的原理及操作规程
免疫组化的原理及操作规程免疫组化，即免疫组织化学染色技术，是一种利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（如荧光素、酶、金属离子、同位素等）显色，从而确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质）的定位、定性及相对定量的研究方法。
该技术广泛应用于临床病理诊断、生物医学研究以及药物开发等领域。
本文将详细介绍免疫组化的原理及操作规程。
一、免疫组化的原理免疫组化的基本原理是抗原与抗体的特异性结合。
抗原是指能够刺激机体产生免疫应答，并能与免疫应答产物（抗体或致敏淋巴细胞）发生特异性结合的物质。
抗体是机体的免疫细胞在抗原刺激下产生的具有特异性识别能力的免疫球蛋白。
在免疫组化中，通常将目标抗原（如某种蛋白质或多肽）作为待检测物，通过特定的抗体与之结合，再利用标记技术使抗体可视化，从而实现对目标抗原的定位、定性和定量研究。
免疫组化的标记技术主要有直接法和间接法两种。
直接法是将标记物（如荧光素、酶等）直接标记在抗体上，使其与目标抗原结合后直接显色。
间接法则是利用未标记的抗体（一抗）先与目标抗原结合，然后再通过标记的二抗（与一抗特异性结合的抗体）与一抗结合，最终实现显色。
间接法具有更高的灵敏度和灵活性，因此在实际应用中更为常见。
二、免疫组化的操作规程免疫组化的操作规程主要包括以下几个步骤：1. 标本处理：根据实验需求选择合适的组织标本，并进行固定、脱水、包埋等处理，制备成组织切片或细胞涂片。
固定是为了保持组织或细胞的形态结构，防止抗原丢失；脱水则是为了去除组织中的水分，便于后续操作；包埋则是将组织块包裹在支持物（如石蜡）中，便于切片。
2. 抗原修复：由于固定和脱水等处理过程可能导致抗原表位的遮蔽或改变，因此在进行免疫组化染色前，需要对抗原进行修复。
常用的修复方法包括热修复、酶修复和酸修复等。
具体方法应根据实验需求和抗原性质进行选择。
3. 阻断内源性酶活性：为了避免组织内源性酶对后续显色反应的干扰，需要使用相应的阻断剂（如过氧化氢）对内源性酶活性进行阻断。
免疫组化需要注意事项
免疫组化需注意的问题一、为达到免疫组织化学技术的要求，组织固定越新鲜越好。
为达到免疫组织化学染色的要求，对于离体的组织尽量快的进行固定，有条件的应将其剖开，早取材，早固定。
二、组织脱水必须彻底干净组织块取材不能太大过厚，才能较好地完成脱水的过程。
如果取材太厚，在较短的时间内脱水不完全，将可引起一系列的问题，比如浸蜡不彻底，切片不好完成，切不完整。
由于先天不足，导致后来切片染色的脱落，造成染色的失败，或者由此反复操作，造成人力物力的浪费，造成病理报告的延期发出等。
因此，对取材的要求是除了要求要有艺术性外，即平整、外观好看，还要求适中。
三、切片必须完整、均匀、平展、无邹折应用于免疫组织化学染色的切片，对切片的质量要求较高，切片必须完整，平展、无汽泡，无邹折，这样有利在染色时的冲洗，有利于切片的牢固附贴。
如果切片不平展，免疫组化染色后，可出现染色不均匀的现象，颜色深浅不一，不平。
如果切片有汽泡切片在烘烤时，由于汽泡的破裂影响了汽泡周围的组织，在其周围可观察到深浅不一的染色。
如果切片有邹折，免疫组化染色后，在邹折的地方有深浅不一的颜色，这是一种假阳性，容易引走混淆。
四、切片的附贴必须牢固，必须使用合适的粘贴剂。
免疫组织化学染色前的前期准备工作，就是必须对新的载玻片进行处理，新的载玻片表面看起来很干净，有人认为不需要进行任何的处理，都能够适合使用，这是一种错误的想法。
新出厂的载玻片，表面复盖着开一层油脂样的物质，如果不加以处理，对切片的附贴是极为不利的。
我们的做法是：新的载玻片，放于玻璃清洗液中浸泡4小时甚至过夜，然后取出，经自来水彻底冲洗后，浸入酒精中达2小时以上，取出擦干备用或烘干也可。
然后再将载玻片浸入了－氨基－三乙氧基－硅烷（3－Aminopropyl triethoxy-silane）的稀释液（1：50用丙酮或无水乙醇稀释都可以）中硅化10分钟，后经无水乙醇洗2次，烘干即可使用。
五、切片必须烘烤附贴牢固，既要经得起抗原修复时高温的作用而不使轻易脱片，又不至于破坏抗原。
免疫组化原理、步骤及要注意的事项
免疫组化原理、步骤及要注意的事项免疫组化一，免疫组织化学简介免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应炕原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。
二，免疫组化技术的基本原理免疫组化技术是一种综合定性、定位和定量；形态、机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。
在原位检测出病原的同时，还能观察到组织病变与该病原的关系，确认受染细胞类型，从而有助于了解疾病的发病机理和病理过程。
免疫酶组化技术是通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于普通显微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位，根据酶标记的部位可将其分为直接法（一步法）、间接法（二步法）、桥联法（多步法）等，用于标记的抗体可以是用免疫动物制备的多克隆抗体或特异性单克隆抗体，最好是特异性强的高效价的单克隆抗体。
直接法是将酶直接标记在第一抗体上，间接法是将酶标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。
目前通常选用免疫酶组化间接染色法。
三，免疫组化步骤1，切片，烤片60℃，1h；2，脱蜡及复水二甲苯10min，100％乙醇5min，95％乙醇5min，90％乙醇5min，85％乙醇5min，80％乙醇5min， 75％乙醇5min，60％乙醇5min，50％乙醇5min，30％乙醇5min，自来水1min，双氧水1min；3，1份30％H2O2加10份蒸馏水，室温10min，蒸馏水洗3次，每次3min；4，微波修复将切片浸入0.01M枸橼酸缓冲液，微波中最大火力（98℃-100℃）加热至沸腾，冷却（约5-10min），反复两次；5，将切片自然冷却至室温，PBS洗涤3次，每次5min；6，封闭，5％BSA，室温20min，甩去多余液体；7，滴加一抗，37℃，1h，或者4℃过夜；8，PBS洗涤3次，每次3min；9，滴加二抗，37℃，15-30min；10，PBS洗涤3次，每次3min；11，滴加SABC，37℃， 30min；12，PBS洗涤3次，每次5min；13，1ml蒸馏水中分别滴加显色剂，混匀；14，DAB显色剂配置好后，滴加于切片，室温，镜下检测反应时间（约5min）；15，自来水冲洗干净，过蒸馏水；16，苏木素复染2min，自来水冲洗；17，脱水30％乙醇3min，50％乙醇3min，70％乙醇3min，80％乙醇3min，90％乙醇3min，95％乙醇3min，100％乙醇3min，二甲苯20min；18，树胶封片，镜检。
免疫组织化学技术中抗体的选择方法和注意事项
免疫组织化学技术中抗体的选择方法和注意事项免疫组织化学技术是一种用于检测组织中特定蛋白质表达的方法，通过使用抗体来实现。
在进行免疫组织化学技术时，选择合适的抗体至关重要，因为抗体的质量直接影响到结果的准确性和可靠性。
在选择抗体时，需要考虑许多因素，包括特异性、灵敏度、特异性和重现性等。
需要注意一些实验中的常见问题，比如非特异性结合、交叉反应和背景信号等。
下面就关于免疫组织化学技术中抗体的选择方法和注意事项做一些介绍。
一、抗体的选择方法1. 确定目标蛋白：在选择抗体之前，首先需要明确目标蛋白的特性和表达模式，比如它的亚细胞定位、分布情况和表达水平等。
2. 搜索合适的抗体：可以通过文献检索、商业抗体数据库、生产商提供的数据和其他实验室的经验等渠道来获得相关信息，然后筛选出合适的抗体。
3. 考虑实验条件：在选择抗体时需要考虑实验所需的条件，比如实验类型（免疫组化、免疫沉淀、免疫印迹等）、样本类型和处理方法等。
二、抗体的注意事项1. 抗体的特异性：选择具有较高特异性的抗体是十分重要的，避免出现与非目标蛋白的结合。
2. 抗体的灵敏度：选择具有较高灵敏度的抗体有助于检测低表达水平的蛋白。
3. 抗体的特异性验证：在使用抗体之前，最好通过Western blotting、siRNA敲低等方法对抗体进行特异性验证。
4. 购买抗体时需要关注生产商提供的抗体性能数据，如免疫组织化学应用图片、抗体的批次一致性以及使用文献等。
免疫组织化学技术中选择合适的抗体是影响实验成败的关键因素之一。
在选择抗体时需要全面考虑各种因素，严格控制实验条件并加强抗体的验证工作，以确保实验结果的准确性和可靠性。
也需要不断总结实验中的经验，加强与其他实验室的交流与分享，以提高免疫组织化学技术中抗体的选择水平和实验技术水平。
免疫组化
免疫组织化学技术制片的规范和质量控制随着免疫组织化学技术的不断发展，该技术在组织学研究和病理诊断尤其是在肿瘤鉴别诊断的应用越来越广泛。
科学地规范免疫组化技术的操作对保证免疫组化制片质量，提高临床病理诊断水平，促进病理学研究工作的发展有着重要的意义。
影响免疫组化染色结果的因素很多，除了免疫组化染色操作因素外，还包括组织切片制备各个环节的因素。
因此，免疫组化技术的操作规范也要包括组织切片技术的规范。
一、免疫组织化学技术对组织切片的要求免疫组织化学技术适用于冰冻切片和石蜡切片，部分抗体只能用于冰冻切片，大部分抗体可用于石蜡切片，适用于石蜡切片的抗体也适用于冰冻切片。
冰冻切片能很好地保存组织抗原，抗原丢失少，但形态结构差，定位不很清晰；石蜡切片组织形态结构好，定位清晰，但在组织的固定、脱水、包埋等过程中容易破坏组织抗原，使抗原的免疫活性有所降低。
因此在检测石蜡切片组织抗原时，尽可能保存组织抗原的免疫活性十分重要。
二、组织的固定组织离体以后应及时取材固定，组织经过固定后可保存组织原有的形态结构，防止组织抗原弥散。
常用的固定液为10％福尔马林液(4%甲醛液)，最好选用10％中性福尔马林液，固定时间为4-6小时，一般不超过24小时。
固定时间不足，组织结构不佳，组织抗原弥散；固定时间过长，可封闭或破坏组织抗原。
冰冻切片常用的固定液为无水丙酮或4%多聚甲醛，固定时间为10-20min。
三、载玻片的处理组织切片贴在载玻片上进行免疫组织化学染色，由于染色过程操作步骤及冲洗次数较多，容易出现脱片现象，因此将载玻片涂胶或硅化是必要的。
较常用效果较好的是硅化玻片。
硅化玻片的制备：1. 载玻片经酸洗，冲洗干净后烤干。
2. 2％APES丙酮溶液浸1-2min。
3. 无水丙酮液浸1-2min。
3. 蒸馏水浸洗1-2min。
4. 烤干备用。
可用无水酒精代替无水丙酮，也可以直接配成APES水溶液使用。
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免疫组织化学注意事项
1、为达到免疫组织化学技术的要求，组织固定越新鲜越好。
2、组织脱水必须彻底干净。
3、切片必须完整、均匀、平展、无皱折。
4、切片的附贴必须牢固，必须使用合适的粘贴剂。
新的载玻片，放于玻璃清洗液中浸泡4小时甚至过夜，然后取出，经自来水彻底冲洗后，浸入酒精中达2小时以上，取出擦干备用或烘干也可。
然后再将载玻片浸入3－氨基－三乙氧基－硅烷（3－Aminopropyl triethoxy- silane）的稀释液（1：50用丙酮或无水乙醇稀释都可以）中硅化10分钟，后经无水乙醇洗2次，烘干即可使用。
5、切片必须烘烤附贴牢固，既要经得起抗原修复时高温的作用而不使轻易脱片，又不至于破坏抗原，切片在60℃的恒温干燥箱中烘烤2-5小时最为合适。
6、切片脱蜡必须干净，否则将会影响免疫组化染色的最后结果。
7、必须彻底抑制内源性过氧化物酶的活性，才能降低背景的染色。
H2O2
甲醇较适合于大多数的情况，因为除了H2O2外，甲醇对各种酶，都有钝化的作用，因此H2O2甲醇的双重作用效果较好。
8、抗体的加入须注意的问题：①当PBS冲洗完毕后，在加入抗体，如一抗，二抗或三抗。
必须将存留于切片上的多余的PBS摔干，但不能让切片干涸，切片干涸，往往可产生非特异性染色，切片上PBS存留过多，将会稀释加入的抗体，影响加入抗体的浓度，同时也将影响最后的结果，如假阴性等。
②加入的抗体以一滴为佳。
当擦干组织块周边多余的PBS后，切片保持着一定的湿润度，此时加入另外的抗体为最佳时候，滴入抗体以一滴50μl为好，加入后，轻微地摇匀地覆盖于切片上，使最后的结果稳定均衡，不至于有的地方有反应，有的地方无反应。
③切片没擦好将会影响加入抗体的质量。
当加入抗体后，它可缩于切片的一边，此时你为了使加入的抗体能够完全地覆盖整个切片，便会使劲地加入抗体，此时的结果是，抗体依然滑向一边，或者完全露出，这不光没达到目的，还浪费抗体，正确的做法就是彻底地用PBS冲洗，摔干切片擦干切片周边的PBS，再滴入一滴抗体轻轻摇匀即可。