反向遗传学及其相关技术

也可以利用PCR的方法扩增转座子的侧翼序列，进而 得到完整的基因信息。
转座子插入特点：
①插入的是完整的元件，便于分析。 ②可从插入位点切除，产生回复突变，因此不仅可以
据此确认真正由转座子引起的突变，还可以进一步
验证突变基因的功能。
③转座子倾向于插入转座子的临近区域，可以用来研
究基因组某一局部区域的结构。 ④通过不断跳动产生新的突变，相对较少的起始转化 系就可以获得整个基因组的饱和突变，大大减少了 工作量。
3. 后成修饰作用导致的基因沉默：指转基因的序列和碱基组 成不发生改变，但是其功能却在个体发育的某一阶段受到 细胞内因子的修饰作用后而关闭。这种修饰作用所造成的 转基因沉默是可以随着修饰作用的解除而被消除。后成修 饰作用导致的转基因沉默与受体植物的核型构成有关。 4. 重复序列：外源基因如果以多拷贝形式整合到同一位点上， 形成首尾相连的正向重复或头对头、尾对尾的反向重复， 则不能表达，而且拷贝数越多，基因沉默现象越严重。这 种重复序列诱导的基因沉默可能是重复序列间自发配对， 甲基化酶特异性识别这种配对结构而使其甲基化，从而抑 制其表达。
第四章 反向遗传学及其相关技术
一、概述
（一）遗传研究的二条途径
1、表→里：正向遗传学研究
杂交或诱变→表型观察→遗传规律→确定存在 的基因及数目→基因的功能及作用性质。 这一途径是从生物体的性状、表型变化来研究 遗传物质的组成、分布与传递规律，属于正向 遗传学采用的研究方法。
2、里→表：反向遗传学研究
B. 转座子插入突变
利用某些能随机插入基因序列的转座子，在目标细胞 基因组中进行随机插入突变，建立一个携带随机插入 突变的细胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相 应的基因敲除细胞。
由转座子引起的突变可以转座子术
I. 反义RNA
II. RNA干扰（RNAi）
I. 反义RNA技术
反义RNA技术是根据RNA序列人工合成的互补 RNA。根据反义RNA的作用机制可将其分为三类：
1、反义RNA是直接作用于靶 mRNA的核蛋白体结合位点
或 与 靶 mRNA 直 接 结 合 形 成 双 链 RNA ， 从 而 直 接 抑 制
2）随机插入突变
A. T-DNA插入突变 以农杆菌介导的转化为基础的一种插入突变研究 方法，根据插入位点的基因序列与植物表型变异 等的相互关系可以从基因组中分离出相应的基因 并鉴定其功能。 构建T-DNA载体→转化→突变体的筛选及遗传分 析→分离T-DNA 插入位点的侧翼序列→基因的 定位、结构与功能分析。
b) Cre催化重组不需要任何辅助因子的参与
Cre-Loxp gene knockout system
4) 高等动物基因敲除技术
► 真核生物基因敲除的技术路线主要包括构建重组基
因载体，用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA导 入胚胎干细胞纯系中，使外源DNA与胚胎干细胞基 因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的 DNA序列整合到内源基因组中并得以表达。
↓ 重组DNA转入受体 细胞核内
↓ 筛选目的细胞
↓
转基因生物
用替换型（a）或插入型（b）载体进行完全基因敲除 实验
2）Res同源重组系 统
——源于λ噬菌体 Res重组酶的重组系 统
Ha 和Hb: 同源重组区域 Pa 和Pb: 引物位点 sm: 筛选标记
Red 同源重组技术用于基因打靶
3）Cre-LoxP同源重组系统
— 定向诱导基因组局部突变，是一种快速有效地从由化学诱 变剂(EMS)诱变过的突变群体中鉴定出点突变的方法。
先用化学诱变剂 (甲基磺酸乙酯， EMS) 诱发产生 一系列的点突变，再用设计的特异性引物进行 PCR 扩增，然后将 PCR 扩增产物变性和退火形成 异源双链核酸分子，再用特异切割错配的内切酶 CELl 酶切，最后变性处理后采用双色聚丙烯酰胺 凝胶(PAGE)电泳检测分析。
II.Mu转座子系统
转 座 子 打 靶 载 体 是 以 两 种 噬 菌 体 Mu 为 基 础 的 mini-Mu转座子，每个转座子上都携带标记基因。 可以在拟删除基因两侧各插入一个mini-Mu转座 子，然后在两个插入位点之间制造缺失。 这种缺失可以使两个转座子加上靶区之间的部分 基因转移。 特点： 不需要知道基因组序列，仅已知外显子即可 载体构建迅速，技术简单 载体可以携带多种不同抗性基因，可以同时处理 多基因。
mRNA的翻译或被RNA酶Ⅲ识别降解。 2、反义RNA是与mRNA的非编码区结合，引起mRNA构
象的变化，从而抑制其翻译。
3、反义RNA是作用于基因的启动子，直接抑制靶mRNA 的转录。
II.RNA干扰
（一）概念
RNA干扰(RNA interference，RNAi)：
与靶基因序列同源的双链RNA所诱导的
能够拯救病毒的遗传材料称为感染性克隆，一般是 在细菌质粒中含有整个病毒基因组的 cDNA拷贝， 使得 cDNA 本身或从 cDNA 体外转录所得的 RNA 具 有感染性。
RNA病毒的反向遗传系统通过定向修饰病毒的基因 组序列，检测被拯救的人工改造病毒的表型，可以 在体内 (in vivo) 有效地研究病毒基因结构、功能 和病毒-宿主相互作用。
⑤可以应用于转化效率不高的植物。
转座子系统 I. Ac/ Ds 系统
由自主性元件（Ac）和非自主性元件（Ds）构成。 Ds 元件能够在 Ac 编码的转座酶的作用下移动， 去除Ac元件可使其自身不能转座。 通过遗传杂交引入自主性元件，转座子插入序列 可以重新移动。因此，Ac/Ds 转座子插入系统只 需要少量的转基因品系（启动品系）作为转座源 即可。
一种序列特异性转录后基因沉默现象。
基因沉默
转录水平的基因沉默 (Transcriptional Gene Silencing, TGS) 转录后水平的基因沉默(Posttranscriptional Gene Silencing, PTGS)
基因沉默
转录水平的基因沉默（TGS）是指基因在细胞核内RNA
RNA病毒的反向遗传操作
RT-PCR构建RNA病毒的全长cDNA，并进行遗传修饰 ↓ 与RNA聚合酶启动子结合 体外转录病毒RNA ↓ 转录物RNA感染哺乳动物细胞 ↓ 拯救到活病毒 ↓ 拯救病毒的表型变化 ↓ 病毒基因组的表达、调控、致病机理、 病毒与宿主细胞互作、疫苗制造等
单正股RNA病毒： 正股RNA与负股RNA病毒、逆转录病毒?
增强子陷阱( enhancer trap )：转座子含 有一个具弱小启动子驱动的报告基因。报告 基因的表达只有在转座发生在内源增强子附 近时才能获得。 启动子陷阱(promoter trap)：转座子带有 一个无启动子的报告基因，这个基因只有在 转座子插入一个植物活跃的内源启动子下游 时才能表达。
利用基因敲除或基因沉默而产生的功能变化 研究基因功能是主要的反向遗传学技术。
二、反向遗传学相关技术 1、基因的同源重组 2、基因的位点突变 3、基因沉默 基因敲除
1、基因的同源重组
利用DNA转化技术，将含有目的基因和靶基因 同源片段的重组载体导入靶细胞，通过载体与 靶细胞染色体上同源序列间的重组，将外源基 因整合入内源基因组内，使外源基因得以表达。 通过研究靶细胞或者个体在目的基因插入前后 遗传特性的改变，达到研究基因功能的目的。
合成受到了阻止而导致基因沉默。转录水平基因沉默可以 通过有性世代传递，表现为减数分裂的可遗传性。
引起转录水平基因沉默的机制主要有以下几种：
1. 基因及其启动子甲基化：通常发生在DNA的CG序列的碱基上， 该区域碱基甲基化往往导致转录受抑制。 2. 同源基因间的反式失活：拥有同源序列的沉默位点和其他 位点的DNA的相互作用而引起的基因沉默。甲基化并失活的 基因能作为一种“沉默子”，对其他具有同源性的靶基因 施加一种反式作用，使具有同源序列的靶基因发生甲基化 并导致失活。反式失活的靶基因既可以与沉默基因是等位 基因，也可以是非等位基因。
（建池）
TILLING特点：
TILLING技术属于高频率点突变和PCR筛选相结 合的技术，可发现基因的错义突变、基因截短型 损伤等突变类型。 可获得大量的等位基因系列，对长度很小基因， 复等位基因等具有独特的技术优势。 可诱导产生高频率的点突变，筛选目的基因需要 较小的突变群体。
不依赖于农杆菌介导转化或内源标签系统，无需 耗时的转基因和复杂的组织培养。 需要知道所研究基因的序列。
T-DNA 法敲除植物基因 及源自变体筛选：a. 引 物 设 计 。 LP 和 RP 分别代表插入基因两端的引 物， LB 是指载体上的一段 引物。旁邻序列是经测序后 获得的DNA序列。 b. PCR 产物电泳结果。 分别代表野生型、杂合子和 纯合子PCR条带。
T-DNA插入特点：
不能控制其在生物体基因组中的插入位点。在植物 中用T-DNA 插入来敲除一个特定基因仍需要运气。 隐性突变与显性突变：隐性——表型的变化只能在 转化体的部分后代中体现出来（基因敲除）；显 性——可以在转化体中直接观察到（基因激活）。 某些特定基因，由于其特性在基因敲除后并不体现 出功能的丧失。原因：重要的功能基因突变致死和 冗余基因。 染色体重排：突变体表型与T-DNA 插入无关。 效率不高，工作量大。建立饱和的突变体库。
RNA聚合酶
+
结构蛋白
+
+ mRNA
–
子代正股RNA –+ 中间型 +
单负股RNA病毒：
RNA聚合酶 – +
–
结构蛋白 子代负股RNA
逆转录病毒：
逆转录酶 ＋＋ RNA RNA/DNA 中间体
DNA/DNA
宿主
＋＋ 子代RNA
（三）真核生物的反向遗传学
采用反向遗传学鉴定基因功能是真核生物功 能基因组学的主要内容。 研究手段包括基因的互补实验、超表达、反 义抑制、基因敲除 / 基因打靶、基因陷阱、 基因激活等手段。