第四章_反向遗传学及其相关技术
表观遗传学
表观遗传学
❖ 经典遗传学以研究基因序列影响生物学功能为核心相比， ❖ 表观遗传学主要研究这些“表观遗传现象”的建立和维持
的机制。
多少年来，基因一直被认为是生物有机体一代代相传的一个 并且仅有的一个遗传载体。越来越多的生物学家发现了一 个被称为表观遗传的现象------生物有机体后天获得的非遗 传变异有时可以被遗传下去。有详细记录的100个关于代 间表观遗传的例子，提示非基因遗传要比科学家们以前想 象的多得多。
其他例子 Rats whose agouti gene is unmethylated (i.e., expressed) have a yellow-ish coat color and are
正向遗传学
正向遗传学正向遗传学，又称正向遗传分析或正向遗传学方法，是一种遗传学研究方法，用来确定哪些基因对于生物个体的正常生理功能和特定表型最为重要。
正向遗传学方法和常规的反向遗传学方法不同，后者是通过研究具有特定表型但未知基因的突变体来识别和定位基因。
正向遗传学的基本原理是从一个正常的生物体中识别关键基因，通过表达量分析、功能敲除、转基因等方法进行验证和确认。
这种方法可以用来鉴定为特定功能负责的基因，例如发育、代谢、免疫反应等。
正向遗传学关注的是一个个体或种群中实际起作用的基因和基因互作效应，因此可以提供更为深入的基因功能和表型机制的了解。
正向遗传学的应用作为一种高通量技术，正向遗传学方法在许多领域得到了广泛应用。
以下是几个典型的应用领域：发育学正向遗传学方法是发育生物学的重要工具，用于鉴定调控发育过程的基因。
例如，通过分析胚胎发育中基因的表达模式来揭示发育调控网络的构建过程。
代谢学正向遗传学方法也被用于代谢通路研究。
通过表达限制或失活特定代谢途径中的一个或多个基因，研究人员可以确定哪些基因对代谢通路的正常运行尤为关键。
免疫学正向遗传学方法也可用于免疫学研究，探究特定免疫反应与哪些基因相关。
例如，通过敲除或重组免疫系统中的基因，确定免疫系统如何响应外部刺激和入侵病原体。
肿瘤学正向遗传学也被广泛用于肿瘤学研究中。
通过分析肿瘤细胞与正常细胞基因组的差异，鉴定哪些基因发生了变异或表达异常，从而研究肿瘤的发生和发展。
正向遗传学的挑战正向遗传学技术虽然有很多优点，但在实践中也面临着一些挑战。
主要包括：表型分析的复杂性要识别特定基因与表型之间的关系，需要对基因和表型进行深入的分析。
在许多情况下，这种分析需要有专业的技能和经验。
因此，正向遗传学的结果需要进行跨领域验证和分析。
难以进行高通量筛选试验相比反向遗传学方法，正向遗传学通常需要更大的样本量，并且每个样品都需要进行操作和筛选。
这导致了实验成本和时间的增加，也增加了试验的复杂性。
反向遗传技术在禽流感发病机制研究中的应用
辑和 自发重组与诱导重组 、病毒与宿主 间的相互作 用关系 、抗病 毒力增加 。在裂 解位点第 ４位将赖氨 酸替换为精氨酸能够增 加毒 毒策略 、基 因治疗研究 ，以及 构建新型病毒载体来 表达外源基 因 力 。Ｌ ｕ等 ［ 利用反 向遗传 技术获得 了三个 突变株 ，它们 的 Ｈ ６ １ Ａ 和进行疫苗 的研制等 ［ １ １ 。流感 病毒 为分节段 、单股 负链 Ｒ Ａ病 来 自于中国分离株的 Ｈ Ｎ Ｎ ９ ２和 Ｈ Ｎ１ ５ 亚型 ．其他基 因来 自 ＡＷＳ ／ ／ Ｎ 毒 ，对其分子生 物学方面深入 的研究 ，是 在 １８ ９ ９年 由 Ｌ ｙ ｅ 等 ３ ｕ０ｓ ３分离 株 ：结 果表 明 ，突变株 不在 缺乏胰 蛋 白酶的 Ｍ Ｃ Ｄ Ｋ细胞
人创立 了流感病毒反基 因操作 技术 之后才得 以实现 的。流感病毒 上产生 细胞病变 ，而在鸡 蛋传 递的过程 中呈现蛋适应 性和 Ｈ ／ Ａ ＡＮ
反基 因操作 技术 的突破性进 展完成 于 １９ ９ ９年 。Ｎ ｕ ａ ｎ等 圆满 稳定性 。而 ｒＨ Ｎ 呈 现对鸡胚 和鸡 的低致病性 。卢建红等 Ｉ 选 ｅｍ ｎ ｇ５ １ ７ １ 地完成 了对流感 病毒 的反基 因操作 工作 ，他 们完全 用质粒 Ｄ Ａ Ｎ 择一 株鹅源 Ｈ Ｎ１亚型禽 流感病毒 （ Ｉ ） ５ Ａ Ｖ ，缺失其 Ｈ 基因裂解 Ａ 转 染细胞 。利用 细胞 中 的转录 和翻译 机 制 。得 到 了具 有感 染性 序列 的 ４个 碱性氨基 酸 、使 ＨＡ裂解模 式 由高致病 性突变为低致 的 、完整 的流感病 毒。在 Ｌ ｙ ｅ 等 人首次 对流感 病 毒进行 基 因 病性 的，将修饰 的 Ｈ ｕＯ ｓ Ａ基 因克隆入转录表达载体 ｐ Ｗ２ ０ ，构建 Ｈ ００ 组操作 近 ｌ ０年之 后。 毒学家最终 获得 了对 流感 病毒进行 复杂而 质粒 ｐ Ｗ５ ４ Ｈ 病 Ｈ ２ 一 Ａ，将该 毒株 和 Ｈ９ ２亚 型毒株 的 Ｎ Ｎ Ａ全基 因分 深入研 究的有利 工具 ，可 以研究 流感病毒 蛋 白和 Ｒ Ａ 因子 在病 别克 隆人 ｐ Ｗ２ ０ ，构 建质粒 ｐ Ｗ５ ６ Ｎ Ｎ Ｈ ００ Ｈ ０ 一 Ａ和 ｐ ＨＷ２６ Ｎ ０ 一 Ａ。将 毒复制和致病性方面的各 种特性 。
生理心理学PPT课件
周围神经系统（二）
内脏神经指分布于心肌、平滑肌和腺体的神 经。它们在大脑皮层、下丘脑、延髓、脊髓等 中枢神经的调节下，支配内脏器官的活动，又 可分为交感神经和副交感神经。当机体处于应 激状态或进行比较强烈的运动时交感神经的兴 奋优势，它使机体产生心跳加快加强、血管收 缩、血压上升、支气管的平滑肌舒张、血糖升 高、汗腺分泌、立毛肌收缩等生理反应，为机 体的消耗提供能量。反之，副交感神经的兴奋 占优势时机体会有相反的反应。
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中枢神经系统
中枢神经系统包括脊髓和脑，脑包 括大脑、间脑、脑干和小脑，脑干自 上而下又分为中脑、脑桥和延髓。年 轻男性的脑平均约重1380克，年轻女 性则为1280克。脊髓位于椎管内。
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脊 髓部位， 上端接延髓，下端止于终丝。形态上呈长柱状。 与脑相比是分化较少，功能较低级的部分，保 留着明显的节段性。内部中央有一条很细的中 央管，围绕中央管周围则是H形的灰质，在灰 质的外面由白质组成。脊髓与31对脊神经相连， 后者分布到躯干和四肢，脊髓是周围神经系统 和脑之间上、下行传导路径的中继站和许多简 单反射活动的中枢。
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分子遗传学技术（一）
动物和人的心理行为是遗传和环境相互作用的 结果。基因携带了所有机体能表达的蛋白质的氨 基酸序列的信息，通过复制传递这些信息，给下 一代提供自身的复制品，并在细胞内表达而产生 特异的蛋白质，从而决定细胞的结构、功能及其 他生物学特性。 某种行为可能明显地受到遗传的控制，但并不 知道哪些基因参与这种行为的控制，或者知道有 哪些基因参与，但这些基因并没有被克隆。在此 情况下，必须用正向遗传学方法．即从表型到基 因的手段来研究这种行为的遗传学基础。
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脑研究法（三）
反向遗传操作技术在禽流感研究中的应用
安徽农 业科 学 ， ｕｎｌ ｆ ｎｕ Ａ ． ｃ ２０ ， ４ １）２６— ０ １ Ｊ ｒａ ｏ ｈｉ Ｓｉ ０６ ３ （Ｏ ：０９ ２７ ｏ Ａ ．
责 任编辑 曹淑 华 责任 校对 曹淑 华
反 向遗传操作技术在禽流感研究 中的应用
２０ ０ ０年 ， 流感 病毒 反 基 因操 作技 术方 面 又取 得 了重 在
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
２ 病毒粒子的拯救 ． １
石 火 英 等 应 用 反 向遗 传 技 术 将 含
有 １９ ９ ８年 中 国 大 陆 分 离 株 Ｈ Ｎ 亚 型 禽 流 感 病 毒 ９２
（ ｖ ｎ ｕｎａｉ ｓＡＶ）的 ８个 基 因片 段 的质 粒 共 转 染 Ａ ｉ ｉ ｅｚｖ ｕ ，Ｉ ａｎ ｌ ｆ ｒ
１ 流 感病 毒反 向遗 传技 术发 展概 况
ｐｌ ｏⅡ启动 子 和 ｐｌＡ序列 。这 ２套转 录单 位就 使得 从 一个 ｏ ｙ 病毒 ｃＮ Ｄ Ａ模 板 上 可 以 同 时 合 成 负 链 病 毒 Ｒ Ａ 和 正 链 Ｎ ｍ Ｎ ， 以此 为基 础 ， Ｒ Ａ并 利用 宿 主细 胞 的 复制 、 录机 制 ， 转 产 生并 释放 出具 有感 染 性 的流感 病毒 颗粒 。
崭庆功 ｌ 丰红 ２（ 阳 业 学 牧 医 院辽 沈 ｌ６２ 南 技 院 物 学 院河 新 ５ｏ ， 色 崔 １ 农 大 畜 兽 学 ，宁 阳ｌｌ； 科 学 动 科 学 ，南 乡４０） ． 沈 ０ｌ． 河 ３３
摘要 反 向遗传 操 作技 术的 建立 为 负链 Ｒ Ａ病毒 的研 究开创 了新 的 途 径 ， 负链 Ｒ Ａ病 毒 的许 多特 性 得 以深入 认 识 ， Ｎ 使 Ｎ 目前 此技 术 已广 泛应 用 于 多种 负链 Ｒ Ａ病 毒 的研 究 中。禽流 感近 几年在 全球 的 广泛 爆发 ， Ｎ 使得 对 流感病 毒 的深入 研 究 更加迫 切 ， 向遗传操 作 反 技术 的应 用 ， 禽流 感病 毒 的基 因结构 、 使 致病 机理 、 宿主 细胞 的相 互 关 系等 各 方面 的研 究工 作都取 得 了 巨大进 步 。 者就 国 内近几 与 笔 年取得 的进 展做 一 综述 。 关键词 反 向遗 传技 术 ； 禽流 感 ： 用 应 中图 分类 号 Ｑ １＋ 文 献标 识码 Ａ ３ １８ ． 文章 编号 ０ １—６ １２０ ）０ ２６ — ３ ５７ ６ １ （０６ １—０ ９０
研究植物基因功能的策略和方法_3110
研究植物基因功能的策略和方法研究植物基因功能主要有两种策略：正向遗传学（forward genetics）和反向遗传学（reverse genetics）策略。
正向遗传学即通过生物个体或细胞基因组的自发突变或人工诱变，寻找相关表型或性状改变，然后通过图位克隆并结合一些基因差异表达筛选技术（如差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析等）从这些特定性状变化的个体或细胞中找到对应的突变基因，并揭示其功能，例如遗传病基因的克隆。
反向遗传学的原理正好相反，人们首先是改变某个特定的基因或蛋白质，然后再去寻找与之有关的表型变化，例如基因剔除技术或转基因研究。
简单地说，正向遗传学是从表型变化研究基因变化，而反向遗传学则是从基因变化研究表型变化。
研究植物体内基因功能的方法主要有以下几种：（1）基因功能丧失或减少，即筛选目的基因功能部分丧失或全部丧失的突变体，比较其与野生型的表型差异来确定该基因功能；（2）基因功能增加或获得，即筛选目的基因高水平表达的植株，比较其与相应对照植株（野生型植株，功能丧失突变体或模式植物植株）差异，观察其表型性状变化来鉴定基因功能；（3）基因异位表达（Ectopic expression），通过定向调控靶基因的时空表达模式来研究基因功能；（4）微阵列（Microarray）是一种在全基因组水平对基因表达进行高通量检测的技术；（5）酵母双杂交技术（Yeast two-hybrid system）用于分析基因产物即蛋白质之间的互作。
1 基因功能丧失或减少以前，通常通过筛选自然突变体来获得基因功能部分或全部丧失的突变体，但概率较低；现在一般通过各种人工方法来获得合适突变体。
人工产生基因功能丧失的方法有插入突变、反义抑制（antisense suppression）、共抑制（cosuppression）、双链RNA干扰（double-stranded RNA interference, dsRNAi）。
圆环病毒反向遗传学研究系统的建立
第三节 圆环病毒科的繁殖与复制 一、吸附与穿入 Misinzo等[9]的研究结果表明硫酸乙酰肝素(HS)、硫酸软骨素B(CS-B)参与了PCV-2的吸附，而细胞表面的蛋白聚糖可能是与PCV-2相互作用的第一个配体受体，它是病毒进入宿主细胞所必需的。此外，通过PCV-2感染缺少氨基葡萄糖(GAG)的CHO细胞研究发现，PCV-2可能还需另一个受体进入细胞。这一点与单纯性疱疹病毒、猪动脉炎病毒、腺病毒2型和腺联病毒2型等病毒很相似。对于这些病毒而言，蛋白聚糖是介导病毒吸附和聚集细胞表面抗原的复合受体。此外，用肝素琼脂糖层析技术研究发现PCV-2和PCV-2的病毒样颗粒(VLP)直接与肝素相互作用。Bratanich等[10]利用DDRT-PCR技术对感染PCV-2的猪与健康猪的淋巴结组织进行差异性比较分析，发现有两种基因的转录本丰度显著增高，其序列与人的RNA剪接因子和透明质酸介导的细胞运动受体基因有一定同源性，提示细胞在感染PCV-2过程中，它们可能参与了病毒的吸附过程。
二、基因组复制与转录 圆环病毒的基因组是采取滚环复制(rolling circle replication，RCR)的方式进行复制的。在复制过程中，病毒首先产生双链的复制型中间体(dsDNA)，该复制型中间体2条DNA链都能进行基因转录和蛋白质的表达。PCV最小的DNA复制起始区(ori)位于大小约111bp的基因片段内，包含基因间隔区及rep基因和cap基因的不同翻译起始元件。PCV-1和PCV-2基因间隔区同源性约为75％，而切割位点侧翼的60个核苷酸序列同源性大于90％，并具有相似的功能基序。ori呈茎一环样结构，PCV-1环包含12核苷酸序列(CTGTAGTATTAC)，PCV-2环包含10核苷酸序列(TAAGTATTAC)，二者存在共同的8核苷酸序列(AGTATTAC)，其他圆环病毒、微病毒和双粒病毒基因组均存在相似序列。环的侧翼序列为包含11个核苷酸的倒置重复序列，形成回文结构。茎一环右臂存在4个保守的6核苷酸序列：CGGCAG(H1、H2、H3和H4)，其中，H1与H2相连、H3与H4相连，二者间隔5个核苷酸。 PCV-1基因组的复制依赖于Rep蛋白。Rep蛋白转录子中有一段内含子，如果此内含子被剪掉，则翻译出一个较短的蛋白质，即Rep′蛋白。Rep蛋白单独不能启动病毒复制，必须与Rep′蛋白共同作用，才能启动PCV-1的复制。研究发现，复制起始蛋白的启动子P基因位于rep基因的上游，并与PCV-1的复制起始点重叠；结构蛋白的启动子P基因则位于rep编码区内部。Rep、Rep′蛋白都可结合包括P启动子在蛋白质结合位点。此外，位于病毒复制起始处有一段111bp DNA片段内具有一个环内保守的九聚体(5′TAGTATTAC-3′)的特征性茎-环结构。由于在这段序列中2次出现CGGCAGCGGTCAG序列，因而推测这可能是启动滚环复制的Rep蛋白结合位点。 PCV-1共有12种RNA，包括1个病毒衣壳蛋白RNA(CR)，8种与复制相关的RNA(ReP、Rep′、Rep3a、Rep3b、Rep3c-1、Rep3c-2、Rep3c-3和Rep3c-4和3个与NS相关RNA(NS462、NS642、NS0)。8个与Rep相关RNA都有相同的5′端和3′端核苷酸序列，同时和3个与NS相关RNA都有相同的3′端核苷酸序列。Rep蛋白是引起其他7种与Rep相关RNA剪接的前转录物，而3个与NS相关RNA则是由位于ORFl内部、独立于Rep启动子的3个不同启动子转录的。 PCV-2在PKl5细胞中复制时共检测到9种RNA，包括1个核衣壳蛋白RNA、5个与复制相关的RNA(Rep、Rep′、Rep3a、Rep3b、Rep3c)和3个与NS相关的RNA(NS515、NS672、NS0)。运用突变技术分析研究PCV-2蛋白合成及DNA复制过程中所涉及的PCV-2的每个转录单位。结果表明，在CR的5′端引入一个终止子不能影响Rep相关抗原或病毒DNA的合成，改变其他RNA的剪接位点附近的序列或者在NS0 RNA中引入终止子对病毒蛋白或DNA的复制也没有任何影响。然而，突变能产生截短的Rep或Rep′蛋白，导致蛋白质的合成减少99％，并完全关闭DNA的复制。这些结果表明Rep和Rep′是PCV-2复制所必需的基因，它们一起构成了PCV-2的功能性复制起始因子。 CIAV基因组的复制方式也很特殊，目前还没有一种动物病毒模式适用于它复制的情况。研究发现在感染CIAV后发病的鸡体内，病毒DNA主要以单链环状形式存在于内脏器官中，其中，胸腺、脾脏中含量较高。体外细胞培养方面的研究表明，CIAV感染细胞中存在3种DNA主带，即开环dsDNA、线性和闭合环状dsDNA、闭合环状ssDNA。研究者在CIAV感染的细胞中鉴定出了闭环复制型中间体和开环复制型中间体的存在。根据复制中间体DNA的存在，推测CIAV复制模式类似于大肠杆菌噬菌体ФX174和M13噬菌体一样的滚环式复制。 据报道，用斑点杂交法在感染后8h即可检测到CIAV，其水平在感染后32h迅速上升，48h达到最高。Myrna等对CIAV cux-1株的研究表明[11]，其转录的主要产物为一个长约2.1kb含poly(A)的mRNA。核酸杂交分析结果表明，2.1kb的转录物为编码1个蛋白质的多顺反子mRNA，没有经过任何拼接。除5′近端的起始密码子外，另外两个基因内部的AUG也被用作起始密码子，这对于DNA病毒来说是独特的。据推测，在翻译过程中，核糖体扫描CIAV mRNA并交替在3个ORF的起始密码子处开始翻译。S1核酶酶切图谱、引物延伸试验、克隆和序列分析结果表明，CIAV从1个单一位点起始转录，且仅有1个转录终止位点。对CIAV cux-1株基因组的分析表明，其转录起始点位于第324位碱基TATA盒下游30nt和第一个ORF的起始密码子上游的第26位碱基处。在转录起始位点上游存在一套完整的启动子(增强子元件，它以324nt处的TATA盒为起始。在TATA盒上游，存在1个SPl结合位点和CCAATTE结合位点)。在其上游，有一非转录区，该区含有一组4或5个(与不同的毒株相关)近乎完全的21nt直接重复序列，被1个12bp的插入序列所间断，终止于CCAAT盒上游的第3位碱基。试验证明，该非转录区有许多起调控作用的基元序列，具有启动子活性。
RNA病毒反向遗传学的研究方法和应用
相比， 体外转录法最大的缺点是病毒拯救效率低。 ２．３ 感染性克隆的产生与鉴定
体外转录反应后可直接进行转染， 但有些情况下， 必须 去除 ｃＤＮＡ 模板和其他反应成分， 以提高转染效率。虽然有 研 究 者 将 病 毒 ＲＮＡ 转 录 体 直 接 上 动 物 试 验 以 验 证 其 感 染 性， 但绝大多数采用的方法仍然是转染敏感的宿主细胞， 以 确定 ＲＮＡ 转 录 体 感 染 性 ， 然 而 所 用 的 细 胞 类 型 和 转 染 条 件 主要根据经验确定。而用于增强 ＤＮＡ 转染效率的方法亦可 用 于 ＲＮＡ 的 转 染 ， 如 ＤＥＡＥ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ 和 电 激 法 ， 电 激 法 往 往能 获 得 很 高 的 转 化 效 率 。 大 多 数 的 传 代 细 胞 可 以 用 ＲＮＡ 转录 体 获 得 有 效 的 转 染 。 一 般 来 说 ， 获 得 的 ＲＮＡ 病 毒 其 感 染性 克 隆 的 感 染 性 应 该 以 病 毒 母 本 的 ＲＮＡ 作 为 对 照 ， 以 确 定感染性克隆的质量， 包括效率和特异性。ＲＮＡ 转染后， 可 以 通 过 蚀 斑 或 免 疫 染 色 斑 、细 胞 病 变 和 其 他 一 些 特 异 性 指 标 来早期评价其感染性。尤其重要的是， 必须证明所获得的感 染性 克 隆 确 实 来 源 于 ＤＮＡ 克 隆 ， 采 用 的 方 法 包 括 在 转 录 过 程中设立各种对照， 如转录前后 ＤＮＡ 和 ＲＮＡ 酶的处理。此 外， 也可以在模板中引入遗传标记并且在感染性克隆中证实 其 存 在 。进 一 步 的 分 析 应 该 检 测 对 于 将 来 遗 传 学 研 究 非 常 重 要的一些特性 ， 如细胞培养中的复制、对实验动物的致病性、 宿主谱的变化和在动物模型上的病理作用， 一般都应与其母 本病毒相比较。 ３ 反向遗传的应用与展望 ３．１ 病毒基因功能方面