反向化学遗传学方法筛选NF-kB实验设计

反向化学遗传学方法筛选NF-kB通路抑制剂实验设计

摘要：目的：NF-κB信号通路在微循环障碍，肿瘤的发展等病理过程中都有重要的作用，抑制NF-κB信号通路可能成为抑制这些病理过程的新方法。本文目的是探索能够筛选NF-κB信号通路抑制剂的方法。方法：通过化学遗传学方法，通过化合物对TRAF2和TRAF5靶蛋白的作用，筛选出能够同时抑制这两种靶蛋白的化合物，再将其作用于细胞，通过RT-PCR技术检测化合物导致的靶蛋白的表达量，进而筛选出有效的靶蛋白抑制剂，再将化合物作用于动物模型，筛选出能抑制NF-κB信号通路的化合物，用于抑制NF-κB信号通路介导的微循环障碍等病理过程。

关键词：NF-κB信号通路; 化学遗传学; RT-PCR; NF-kB通路抑制剂;

主要内容

1.NF-KB的概述`````````````````````````````````````````````````2

1.1 NF-KB/Rel蛋白家族及结构````````````````````````````````2

1.2 IκB蛋白家族``````````````````````````````````````````2

1.3 NF-KB的活化信号转导途径````````````````````````````````2

2. NF-κB信号通路介导的病理过程```````````````````````````````3

2.1. NF-κB信号通路激活对肿瘤发生发展的促进作用````````````3

2.2. NF-KB介导的微管内皮细胞的损伤`````````````````````````3

2.3 NF-KB活化影响凝溶的平动态衡，促微血栓形成 `````````````3

3. NF-KB信号途径抑制剂````````````````````````````````````````3

4.实验方法

4.1化学遗传学`````````````````````````````````````````````4

4.2靶蛋白的选择```````````````````````````````````````````5

4.3实验流程图```````````````````````````````````````````` 7

5.讨论````````````````````````````````````````````````````````8

6.参考文献````````````````````````````````````````````````````8

核因子－KB（nuclear factor-kappa B,NF-KB)•蛋白家族是一种多效性的转

录因子，可以与多种基启动子部位的KB位点发生特异性的结合从而促进其转录表达。其受氧化应激、细菌脂多糖，细胞因子等多种刺激而活化后，能调控前炎症性细胞因子、细胞表面受体、转录因子、粘附分子等的生成。而这些刺激因素及其调控的因子与微循环障碍的发生、发展均有着密切的关系。通过反向遗传学方法筛选NF-KB信号途径中的TAK1的抑制剂，从而阻断NF-KB信号途径，抑制NF-KB信号途径的激活，达到治疗NF-KB信号途径诱导的微循环障碍，抑制肿瘤的发展的目的。

1.NF-KB的概述

1.1NF-KB/Rel蛋白家族及结构

1986年，Sen 等首次从鼠B淋巴细胞核提取物中，发现一种能与免疫球蛋白K轻链基因增强子KB序列(GGGACTTTCC)特异结合，调节其基因表达的核蛋白因子，•称之为NF-KB。随后大量的研究又陆续发现了NF-KB•家族的其它成员，•其构成亚基分别是NF-•KB1 (P50)、NF-KB2(P52)、P65（RelA）、c-Rel（Rel)、RelB等，因这些亚基的N-末端均崐有约300个氨基酸残基的Rel同源区（rel homology domain ,RHD)•，•故统称为NF-KB/Rel蛋白家族。其RHD内含DNA结合区，二聚体化区和核定位序列，分别具有与DNA KB序列结合、与同源或异源亚基二聚体化以及与NF-KB抑制蛋白（IKB）家族成员相互作用并携带核定位信号（NLS），参与活化的NF-KB由细胞质向细胞核的迅速移动等功能。

1.2 IκB蛋白家族

IKB蛋白家族成员有IKBα(MAD-3,pp40)、IKBβ、IKBγ/p105、IKBδ/p100、IKBε、Bcl-3以及果蝇属的Cactus等。•其家族结构特点是均有多个约33•个氨基酸的重复序列，•称为崐SWI6/锚蛋白重复序列，主要参与与Rel蛋白的RHD 相互作用。IKB•蛋白主要有以下三个部分构成：1.与蛋白降解有关的N-末端区；

2.能与NF-KB•相互作用的内部区（区内含有锚蛋白重复序列）；

3.称为PEST的C•－端区，•主要参与“囚禁”NF-KB在细胞浆中。IκB蛋白家族作用：在细胞质中与NF-κB二聚体结合，并对信号应答具有重要作用。

1.3 NF-KB的活化信号转导途径

非活化状态的NF-KB以与IKB聚合的三聚体形式或与前体蛋白聚合的二聚体的形式存在于细胞浆中，在多种因素的刺激作用下，通过多种信号转导途径使

IKB磷酸化，再在蛋白水解酶作用下发生降解，从而使NF-KB得以活化而转核发挥其调控作用。最基本的NF-κB信号通路，包括受体和受体近端信号衔接蛋白，

IκB激酶复合物， IκB蛋白和NF-κB二聚体。当细胞受到各种胞内外刺激后，

IκB激酶被激活，从而导致IκB蛋白磷酸化，泛素化，然后IκB蛋白被降解，NF-κB二聚体得到释放。然后NF-κB二聚体通过各种翻译后的修饰作用而被进一步激活，并转移到细胞核中。在细胞核里，它与目的基因结合，以促进目的基因的转录。

NF-κB有经典信号通路和非经典信号通路，二者主要区别在于：在NF-κB 的经典信号通路中， IκB蛋白的降解使NF-κB二聚体得到释放。而在NF-κB 非经典信号通路中，则是通过P100到P52的加工处理，使信号通路激活。

2. NF-κB信号通路介导的病理过程

2.1. NF-κB信号通路激活对肿瘤发生发展的促进作用。

NF-κ B 所致的GADD45α和γ（生长抑制DNA损伤基因）联合表达下调是很多肿瘤细胞逃逸凋亡机制的关键步骤。NF-κ B 还可上调CyclinD1（CCNDI）等基因的表达, 促进细胞生长。此外，NF-κ B 激活对肿瘤的转移具有明显的促进作用。

2..2. NF-KB介导的微管内皮细胞的损伤

2.2.1.炎症性浸润引发的损伤

已知ICAM-1基因启动子上有１个基本的NF-KB位点，VCAM-1基因有2个NF-KB位点，E-sel基因有3个NF-KB位点。在TNF、IL-1、LPS•及活性氧作用下，能在30min内使NF-KB活化升高，并且持续很长时间，•然后单独或与其它因子协同作用下，使ICAM-1、VCAM-1、E-sel在2-4小时内表达增加，6-12小时内达到峰值，而且其表达升高与刺激物质呈时间、剂量依赖的方式。不同途径抑制NF-KB•的活化或清除刺激来源后，均能相应地抑制这种活化和表达。ICAM-1、VCAM-1、E-sel能与白细胞表面的配体相应地结合，介导白细胞的贴壁粘附，致白细胞聚集、浸润，从而导致局部炎症的发生，微血管内皮细胞损伤，表现为微血管通透性增加、组织水肿等，微循环障碍发生。

2.2.2 NF-KB活化后促内皮细胞的凋亡，致微血管损伤。

NF-KB的活化能诱导内皮细胞的凋亡，主要有以下几种方面的证据：⑴在许