细胞总蛋白的制备,SDS-PAGE,WesternBlot
[英语学习]westernblot流程-经典版
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1培养细胞总蛋白的抽提1)将代测细胞标准条件下培养48h，PBS洗涤2次，用细胞刮匙轻轻将细胞从培养瓶中刮下，收集细胞总量1×107个。
1500rpm离心10min，弃上清。
2)PBS洗涤2min×3，每次1500rpm 离心10min，弃去上清。
3)150μl三去污细胞裂解液重悬细胞，冰上静置30min。
15000rpm离心30min弃去沉淀，细胞总蛋白即在上清液中。
三去污细胞裂解液的成分：50mM tris-HCl, pH 8.0,150 mM NaCl,0.5% 去氧胆酸钠1% NP-400.1% SDS1 mM EDTA100 μg/ml苯甲基磺酰氟(PMSF) （临用前配制）10U/ml aprotinin（临用前配制）4)将蛋白定量、分装。
细胞总蛋白经BCA Protein Assay ReagentKit定量后分装保存。
Western blot检测（ECL法）1）SDS-PAGE（凝胶）电泳：配制12%的分离胶和5%的浓缩胶。
取15μl样品液和3μl 6×加样缓冲液，混匀。
煮沸5min使蛋白变性后上样，每孔上样量约为30μg。
110V恒压电泳约90min，至溴酚蓝完全消失。
SDS-PAGE的配制成分分离胶(12%) 浓缩胶(5%)去离子水 1.6ml 1.8ml3%AA母液 2.0ml 0.3ml1.5M Tris-HCl (PH8.8) 1.3ml --1 M Tris-HCl (PH6.8) -- 0.75ml10% SDS 50μl 30μl10%过硫酸胺(APS) 50μl 50μlTEMED 5μl 5μl总体积5ml 3ml2）转膜：电泳完毕后，切去浓缩胶，将胶浸于蛋白转移缓冲液中平衡10-20min。
用湿转的方法将蛋白条带转移至硝酸纤维素膜上( SDS-凝胶位于负极，硝酸纤维素膜位于正极)，0.3A 恒流电泳80min。
3）封闭：转膜结束后，取下硝酸纤维素膜，PBS浸泡5 min后将膜浸于含5%脱脂奶粉的PBS(MPBS)中1 h。
Westernblot实验操作步骤
Western blot实验步骤一、制备蛋白样品（单层贴壁细胞总蛋白提取）1.倒掉细胞培养液,加3ml预冷的PBS洗涤细胞，重复两次，弃掉PBS后将细胞培养瓶置于冰上。
2.裂解液RIPA(强)1ml +PMSF10ul(100:1),两者混匀后加入培养瓶中裂解细胞，冰上裂解30min,为使细胞充分裂解,培养瓶要经常来回摇动。
3.裂解完后，用细胞刮将细胞刮于一侧（动作要快），转移至ep管中.4.4度，12000rpm,离心5min.离心后取上清至新的ep管中，用于后续实验（-80保存）常用蛋白收样：倒掉细胞培养基后，预冷PBS洗涤细胞2次，弃去，再加入1ml PBS，用细胞刮轻轻刮取细胞，转移至1.5ml ep管中，12000rpm，离心5min，尽量吸净上清，沉淀于-80保存，用于后续实验。
融化蛋白样品，加入RIPA+PMSF细胞裂解液（200ul/ep管），充分混匀，冰上裂解20min，4度离心，5min ，12000rpm，小心吸取上清至新的ep管中。
二、蛋白浓度测定(BCA法)BCA(碧云天)蛋白浓度测定试剂盒灵敏度高，检测浓度下限达到25ug/ml，最小检测蛋白量达到0.5ug，待测样品体积为1-20ul。
在50-2000ug/ml浓度范围内有较好的线性关系。
标准蛋白BSA浓度：5mg/ml (-20保存) ,完全溶解蛋白标准品，取10ul稀释至100ul，使终浓度为0.5mg/ml(ug/ul)。
蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。
但为了简便起见，也可以用0.9%NaCl或PBS稀释标准品。
1. 配置BCA工作液A液： B液= 50 : 1 ，混匀 A液+B液=200ul (每个样本)样本数量： 7个标准品 + N 个待测蛋白样本2. 先将每孔加入200ul BCA工作液，再加入蛋白样本。
（96孔板）,总体积为10ul.待测蛋白样本先10倍稀释。
3.37度，温箱中孵育30min。
Western blot详细操作过程
Western BlotWestern Blot 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE 分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄（NC ）膜或聚偏二氟乙烯（PVDF ）膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。
流程：蛋白样品的提取→蛋白样品定量与变性→PAGE 凝胶电泳→转膜→丽春红染色→封闭→抗体孵育→底物显色。
实验器材和试剂：一． 蛋白提取试剂1.10% SDS 裂解液：称取10g SDS 粉末加入双蒸水至90mL ，充分溶解，定容至100ml 室温保存。
2.RIPA 裂解液1ml 裂解液工作液配方： 10ul 100mmol/L PMSF (1mM) 0.2ul 10mg/ml Aprotinin (2ug/ml) 5.0ul 1mg/ml Leupeptin (5ug/ml)0.9848ml 裂解液0.5ml 裂解液工作液配方： 5ul 100mmol/L PMSF (1mM) 0.1ul 10mg/ml Aprotinin (2ug/ml) 2.5ul 1mg/ml Leupeptin (5ug/ml)0.4924ml 裂解液 PMSF 必须摇匀至无结晶时才可与裂解液混合3．蛋白酶抑制剂：100mmol/L PMSF ：17.4mg PMSF 粉末溶于1ml 异丙醇(AR)，分装250ul 每管后－20℃保存。
使用终浓度为1 mmol/L 。
【PMSF ：在溶液中不稳定，应在临用前从储存液中现加于裂解液中。
PMSF 剧毒，严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险一旦眼睛或皮肤接触了PMSF ，应立即用大量的水冲洗。
westernblot原理及步骤
一、western blot 的定义：即蛋白免疫印迹( Western Blot) 是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。
二、western blot 的原理先制备蛋白质样品，再利用SDS-PAGE原理，分离不同的蛋白质，再将分离的蛋白质进行转膜，以便固定在新膜上进行抗原-抗体结合。
用固定在膜上的蛋白质作为抗原与对应的非标记抗体（一抗）结合。
由于此过程中，可能有未结合到抗原的抗体遗留，故需要清洗，以便保存特异性结合的抗原-抗体结合物。
抗原抗体结合物暴露出一个Fc片段，相应的二抗可以结合到这个片段上，形成抗原-一抗-二抗结合物，再用相应的过氧化物酶或碱性磷酸酯酶标记到二抗上，由于加入的标记物相对质量分子很大，可以用离心作用将其沉淀下来，如果抗原与抗体结合，便可以一起沉淀下来，最后通过显色反应或放射自显影法便可检测凝胶中的蛋白成分了。
三、Westernblot法操作步骤是：Westernblot第一步将被分析的蛋白样品做SDS—PAGE凝胶电泳，使样品中的蛋白质按分子量大小在凝胶中分成条带。
Westernblot法第二步把凝胶中的蛋白转移到膜上(所谓印迹)，其中用得最多的材料是硝酸纤维素膜(NC膜)和PVDF膜。
蛋白转移的方法多采用电转移，也有用吸印法转移的(原理与Southern blotting类似)电转移又有半干法和湿法之分，本实验采用后者。
bio-rad专家还提到Westernblot法最后一步是用特异性的抗体检测，看印迹膜上是否存在相应抗原。
免疫检测的方法可以是直接或间接的，现在一般都是采用间接免疫配标的方法。
在用特异性的第一抗体染色后，再用酶标的第二抗体(辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)标记的抗第一抗体的抗体)染色，再加酶的底物显色，通过膜上显现出的颜色或经化学发光在x光底片上出现的曙光条带来显示抗原的存在。
westernblot原理及过程
westernblot原理及过程
1、Western Blot的原理是：蛋白质是带电的，在聚丙烯酰胺凝胶中通过SDS-PAGE分离蛋白质后，蛋白质被固定在凝胶中。
当凝胶被转移到支持物（例如NC膜或PVDF膜）上时，蛋白质在膜上保留其电荷。
通过针对特定氨基酸序列的特异性抗体作为探针检测蛋白质的位置。
这种技术的作用是对细胞或组织提取的蛋白混合物中的某一特异蛋白进行鉴别和半定量分析。
2、Western Blot的过程大致分为以下几步：
蛋白提取：从细胞或组织中提取总蛋白质混合物。
蛋白定量：确定凝胶中蛋白质的浓度。
SDS-PAGE电泳：通过SDS-PAGE分离蛋白质混合物。
电转印：将分离的蛋白质从凝胶转移到支持物（例如NC膜或PVDF 膜）上。
封闭：用含有去污剂和牛血清白蛋白的溶液处理膜，以封闭膜上的任何未结合位点。
抗原-抗体免疫反应：使用特异性抗体检测目标蛋白质的位置。
蛋白检测：使用化学发光剂检测膜上的目标蛋白质。
westernblotting蛋白质印迹实验的流程
细胞总蛋白的提取（1）离心后，弃去上清液，将收集的细胞用手指轻弹重悬于剩余的少量上清液中，转移至1.5ml离心管内，用1×PBS溶液洗涤2次，每次加入1mL PBS溶液，1000r/min，4℃离心5min，弃上层液体。
洗涤两次后，将上清液完全去除，用手指轻弹细胞团，使其分散重悬（若不分散，则无法与裂解液充分混匀）。
（2）每管加入细胞团等体积的含蛋白酶抑制剂cocktail的RIPA细胞裂解液；如需检测磷酸化蛋白，则需另加入磷酸酶抑制剂。
使细胞裂解液与细胞充分混匀，冰上裂解30min。
如暂不提取蛋白，也可在洗涤细胞2次后加入含蛋白酶抑制剂cocktail和磷酸酶抑制剂的1×PBS约100μL，1000r/min，4℃离心5min后，完全弃上层液体，置于-80℃冰箱保存备用。
（3）冰上超声处理细胞，每次超声2s，间隔3s，约10-20次。
（4）13000r/min，4℃离心15min，收集上清溶液至另一干净并预冷的1.5mL离心管中，于-80℃冰箱保存备用。
2. BCA法测定蛋白质浓度（1）配制工作液根据标准品及待测样品的个数，按BCA试剂A和试剂B体积比为50:1配制足量BCA 工作液，充分混匀，置于常温备用。
（2）配制标准品取原标准品BSA（2mg/mL）约100μL，取出50μL，用ddH2O按对数法稀释成如下浓度：1mg/mL、0.5mg/mL、0.25 mg/mL、0.125 mg/mL、0.0625 mg/mL；设置96孔板第一横排第一孔为空白孔，第二横排第一、二孔加入20μL 1×PBS，从第三横排起，按浓度梯度由低到高依次取20μL标准品至96孔板中，每一浓度做2个平行孔。
（3）稀释待测样品取5μl待测蛋白样品，用ddH2O稀释到50μL，分别取20μL至96孔板中，每一浓度做2个平行孔；（4）分别加入200μL BCA工作液到蛋白标准品及待测样品中，轻轻混匀，并去掉每孔中的气泡，置于温箱37℃孵育30min。
westernblot电泳原理
westernblot电泳原理Western blot电泳是一种分离和鉴定蛋白质的方法，它基于电泳原理，可以将蛋白质按照分子量大小分离并定位到膜上，然后通过染色、显影等方式检测目标蛋白质的存在和数量。
Western blot电泳主要分为4个步骤：样品制备、SDS-PAGE电泳、蛋白印迹，以及染色、显影。
下面将对每个步骤进行详细介绍。
第一步：样品制备在进行Western blot电泳之前，需要对样品进行制备。
一般来说需要采用还原剂和蛋白酶抑制剂等化学试剂处理样品，以避免蛋白质被氧化或降解，保证电泳结果的准确性。
常见的还原剂有DTT和β-mercaptoethanol等。
另外，还需选用相应的溶解液处理样品，使蛋白质完全溶解并不附着于膜上。
第二步：SDS-PAGE电泳在样品制备完成后，需要将蛋白质进行分离。
SDS-PAGE电泳就是最常用的蛋白质分离方法之一。
它利用SDS与蛋白质的作用，使得蛋白质的形态发生改变，变为线性构象。
同时SDS还赋予蛋白质等电性，可以使得蛋白质按照分子量大小进行迁移。
在SDS-PAGE电泳，要将样品加入凝胶槽中，施加电场，使蛋白质向电极迁移。
随着时间的推移，蛋白质会按照分子量大小被分离到不同位置。
经过电泳，蛋白质带会形成。
第三步：蛋白印迹蛋白印迹是Western blot电泳的核心步骤，它将已经分离好的蛋白质转移到膜上，并固定在膜上以方便后续的染色和检测。
常用的膜包括尼龙膜、nitrocellulose膜和PVDF膜等。
在印迹过程中，需要将SDS-PAGE凝胶与膜叠在一起，并由电流进行迁移，使蛋白质分子也迁移至膜上，形成同样的蛋白质带。
通过此步骤，可以在膜上确定蛋白质的位置和分子量。
第四步：染色、显影蛋白印迹完成后，即可进行染色、显影。
通常的做法是利用特殊的染料如蛋白质染料Ponceau S染色检测蛋白质是否在膜上，并调整印迹的质量。
对于染色后的膜，可以通过荧光素着色、成像的方式直接观察目标蛋白的含量。
蛋白提取及Western blot 原理及步骤
蛋白质提取原理：使用机械法破坏细胞膜，将细胞内的蛋白质释放到溶液中，然后通过离心或过滤的方法去除细胞碎片、细胞核和细胞碎片等杂质，以得到较为纯净的蛋白质上清液→通过加入盐或有机溶剂等物质，使蛋白质发生沉淀，然后通过离心将沉淀的蛋白质分离出来→通过柱层析、电泳、凝胶过滤等方法进一步纯化蛋白质，去除其他蛋白质、核酸、小分子物质等杂质，使目标蛋白质得到更高纯度。
方法：组织液氮冷冻，研磨成粉末状→加入适量蛋白提取液，冰上放置20 min→4℃，12000 rpm离心10 min→吸上清，在通风橱加入5×Loading Buffer，99 ℃加热10 min，冰上冷却用于Western bolt 或-20℃保存。
5×Loading Buffer配方：①Tris-HCl (250 mM)：Tris-HCl 是一种缓冲盐，用于维持溶液的酸碱平衡，常用于蛋白质提取过程中调节pH 值的作用；②SDS (10%)：SDS （十二烷基硫酸钠）是一种离子型表面活性剂，具有溶解蛋白质和破坏细胞膜的作用，常用于蛋白质提取和电泳分析中；③BPB (0.5%)：BPB（溴酚蓝）是一种染色剂，常用于帮助观察蛋白质电泳分析结果，以检测样品前进方向和监测蛋白质迁移速度；④甘油(50%)：甘油是一种保护剂，可以增加蛋白质提取液的粘度和稳定性，有利于蛋白质的溶解和保存；⑤β-巯基乙醇(5%)：β-巯基乙醇（巯基乙醇）是一种还原剂，可以断裂蛋白质之间的二硫键，有助于蛋白质的还原和解聚。
Western bolt原理及步骤原理：Western Blot是一种常用的蛋白质检测技术，它能够检测复杂蛋白混合物中的某个蛋白的存在，还可以确定其大致分子量，检测其表达水平变化等。
WB以组织或细胞中的蛋白质为研究对象，经过SDS-PAGE分离蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
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医学生物学研究技术与实验实验报告实验名称：细胞总蛋白的制备,SDS-PAGE，Western Blot一、实验目的1. 掌握SDS直接裂解细胞法提取蛋白质2. 掌握Lowry法测定蛋白质浓度的原理3. 掌握SDS-PAGE分离蛋白质的原理和技术4. 掌握半干转移的操作和Western Blot 的原理和技术二、实验原理1. 蛋白质提取常见裂解方法极其原理。
蛋白质的抽提是指破碎过程中，将生物材料在水，缓冲液或稀盐溶液等适当溶剂中浸泡，使胞内的蛋白质等内容物释放到溶剂中。
血浆，消化液和分泌液等体液中可溶性蛋白质，可不经抽提，直接进行分离。
细胞内一般蛋白质的抽提，应先将细胞膜或细胞壁破碎，然后用适当溶剂将蛋白质溶出，再用离心法除去不溶物，得到出抽提液。
膜蛋白的抽提比较复杂。
膜蛋白按其所在位置分为外周蛋白和固有蛋白。
外周蛋白通过次级键和膜外侧脂质的性头部鳌和在一起，应选则适当离子强度及PH的缓冲液，其中要好友EDTA，将其抽出。
固有蛋白嵌和在膜脂质双层中，通过疏水键于膜内侧脂质层的疏水性尾部结合。
在抽提固有蛋白时，要减弱器与膜脂的疏水性结合，又要使其保持部分疏水基暴露在外的天然状态，这一过程叫增溶作用。
较为理想的增溶剂是去垢剂。
目前用的去垢剂分为阴离子型，阳离子型，两性离子型，非离子型。
增溶后的膜蛋白抽提剂有较好的均一性，便于进一步纯化。
纯化后的膜蛋白，可通过透析法去除去垢剂，进行膜蛋白重组。
抽提蛋白质的理想条件是尽可能促进蛋白质在溶剂中溶解，而减弱蛋白水解酶活力，以减少细胞的自溶过程。
主要是通过选择适当PH，温度，或溶剂，以及加适当蛋白水解酶抑制剂。
常见裂解方法有：1 低渗裂解，2 冻融法，3 Triton100或者NP-40等非离子去污剂（比较温柔），4 脱氧胆酸钠、SDS、Triton100 （强烈），5 上样缓冲液（含SDS）＋细胞沸水浴5 min，6 匀浆器。
2. Lowry法测定蛋白质浓度1. 蛋白质与碱性铜试剂产生双缩脲反应，形成紫红色蛋白质-铜复合物；2. 紫红色复合物中的酪氨酸和色氨酸残基还原磷钼酸和磷钨酸，产生深蓝色，呈色强度与蛋白质浓度呈正相关，分光光度计测A750吸光度，做标准曲线3.SDS-PAGE分离蛋白质SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是蛋白分析中最经常使用的一种方法.它是将蛋白样品同离子型去垢剂十二烷基硫酸钠(SDS）及巯基乙醇一起加热，使蛋白变性，多肽链内部及肽键之间的二硫键被还原，肽键被打开，打开的肽键靠疏水作用与SDS结合而带负电荷，电泳时在电场作用下，肽链在凝胶中向正极迁移。
不同大小的肽链由于在迁移时受到的阻力不同，在迁移过程中逐渐分开，其相对迁移率与分子量的对数间成线形关系。
4. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)是在不加入SDS 疏基乙醇等变性剂的条件下，对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于同工酶的鉴定和提纯。
未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷，它们的分离是依据其电泳迁移率的不同和凝胶的分子筛作用，因而可以得到较高的分辨率，尤其是在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物活性，对于生物大分子的鉴定有重要意义，其方法是在凝胶上进行两份相同样品的电泳，电泳后将凝胶切成两半，一半用于活性染色，对某个特定的生物大分子进行鉴定，另一半用于所有样品的染色，以分析样品中各种生物大分子的种类和含量。
5. 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳基本原理不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳包含了两种以上的缓冲液成分、pH值和凝胶孔径，而且在电泳过程中形成的电位梯度亦不均匀。
由此产生的浓缩效应、电荷效应和分子筛效应。
（1）浓缩效应样品在电泳开始时，通过浓缩胶被浓缩成高浓度的样品薄层(一般能浓缩几百倍)，然后再被分离。
当通电后，在样品胶和浓缩胶中，解离度最大的Cl—有效迁移率最大，被称为快离子，解离度次之的蛋白质则尾随其后，解离度最小的甘氨酸离子(PI=6．0)泳动速度最慢，被称为慢离子。
由于快离子的迅速移动，在其后边形成了低离子浓度区域，即低电导区。
电导与电势梯度成反比，因而可产生较高的电势梯度。
这种高电势梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。
因而在高电势梯度和低电势梯度之间形成一个迅速移动的界面，由于样品中蛋白质的有效迁移率恰好介于快、慢离子之间，所以，也就聚集在这个移动的界面附近，逐渐被浓缩，在到达小孔径的分离胶时，已形成一薄层。
（2）电荷效应当各种离子进入pH8．9的小孔径分离胶后，甘氨酸离子的电泳迁移率很快超过蛋白质，高电势梯度也随之消失，在均一电势梯度和pH的分离胶中，由于各种蛋白质的等电点不同，所带电荷量不同，在电场中所受引力亦不同，经过一定时间电泳，各种蛋白质就以一定顺序排列成一条条蛋白质区带。
（3）分子筛效应由于分离胶的孔径较小，分子量大小或分子形状不同的蛋白质通过分离胶时，所受阻滞的程度不同，因而；迁移率不同而被分离。
此处分子筛效应是指样品通过一定孔径的凝胶时，受阻滞的程度不同，小分子走在前面，大分子走在后面，各种蛋白质按分子大小顺序排列成相应的区带。
图1 电泳操作示意图表1凝胶浓度与蛋白质分离范围的相关联系。
6. 转膜(半干转移)法蛋白质带负电，电场中会向正极移动，而PVDF膜在凝胶和正极之间，将蛋白质拦截在膜上，PVDF膜可以牢固吸附蛋白质，使蛋白质保留在膜上。
将凝胶和固相基质象三明治一样夹在用缓冲液湿润滤纸间：－|纸|胶|膜|纸|＋，如图2所示。
图2转膜(半干转移)法示意图三、实验步骤1. 制胶:玻璃板上做好标记（加样孔位置和分离胶位置）→配制分离胶溶液，一旦加入TEMEM就立即灌胶，上加水饱和正丁醇，待凝→弃去正丁醇，蒸馏水冲洗，滤纸吸干多余水分→配制浓缩胶溶液并灌胶，插梳子，待凝→取下制胶器，插入电泳槽中，上槽加电泳缓冲液，没过小玻璃板，下槽加一半量的电泳缓冲液（TGS），拔梳子2. 细胞总蛋白的制备：收集1管细胞，3000rpm 离心5分钟弃上清，沉淀以10mLPBS垂悬洗涤，同上离心，再次以1mLPBS垂悬沉淀并移入1.5mL离心管，再次离心，弃上清→加入5倍体积的4%SDS溶液垂悬，用枪吹打搅匀，沸水浴中加热5分钟→以黄色枪头反复吹打搅匀数十次，以使溶液不再粘稠，10000rpm离心10min→准备2个EP管，分别取上清液15μL，加入5μL 4×上样缓冲液，混匀后沸水加热3分钟，冷却到室温，混匀并短暂离心即可用于上样。
3. 转膜：准备好2.5 ×7cm大小的厚滤纸2张和膜1张，其中膜先用甲醇处理2~3分钟，再浸泡于转移缓冲液中→取下胶，滴加转移缓冲液以起到固定作用，切取相应大小的胶，浸泡于转移缓冲液中平衡15min→转膜条件：200mA，1h；稳流：0.8mA/cm2膜面积。
4. 封闭保存：转移结束，取下胶和膜，胶置于染液中染色；膜做好标记，封闭液中保存于4℃冰箱。
5. 考马斯亮蓝染液检查条带情况：凝胶放入考马斯亮蓝染液中，加盖，在摇床上染色2小时以上→弃染液（可回收重复用），换脱色液慢摇，脱色液变成蓝色的时候更换新的脱色液。
直到凝胶背景无色，蛋白质条带呈清楚的蓝色为止。
6. 抗原抗体反应以及膜的反应性检测：4 ℃封闭过夜，取出预温至室温→将兔抗人c-Myc单抗2.0ml（用封闭液1:1000稀释）加入塑料袋，放入PVDF膜，赶走气泡，用封口机封口，室温平缓摇动1.5小时→PBST洗膜三次，每次10min→将AKP标记的羊抗兔IgG抗体2ml （用封闭液以1:2000稀释）加入塑料袋，放入PVDF膜，赶走气泡，用封口机封口，室温平缓摇动1小时→PBST洗膜三次，每次10min→将PVDF膜放入检测缓冲液中平衡5分钟→将2 ml的检测缓冲液加入新塑料袋中，加入40微升NBT/BCIP浓贮备液，混匀→将2 ml的检测缓冲液加入新塑料袋中，加入40微升NBT/BCIP浓贮备液，混匀→弃去显色液，水冲洗。
四、实验结果A Ba b图3A：电泳结果检查图3B：转膜后转膜情况及抗体标记后检测1. 电泳结果和转膜结果检查：经SDS-PAGE分离得到的蛋白质，经不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳后，取下凝胶，其中一半胶经切割，使用考马斯亮蓝染液在培养皿染色，另一半经过半干转移后的胶经过考马斯亮蓝染液染色后的结果在图3显示。
其中可以看到：经过考马斯亮蓝染色的胶（图3Aa）的左边形成蛋白梯度，右边为marker经过染色形成的条带。
经过转膜后的凝胶经过考马斯亮蓝染色后，如图3Ab所示，大部分蛋白和marker都被转到膜上，只剩下一些大分子蛋白残留。
2. 转膜后转膜情况及抗体标记后检测：转膜后，PVDF膜后经一抗、二抗结合后过夜，显色，经过约20min，显色情况如图3B 所示。
可见PVDF经显色后背景呈淡红色，右条带为Markers，左条带未有显示。
五、实验注意事项1. 蛋白质样品制备过程中需要注意：（1）制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰。
（2）样品处理中使蛋白质充分变性，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键。
（3）样品建议分装冻存，避免反复冻融。
2. SDS-PAGE电泳过程中需要注意：（1）加入试剂后摇匀，防止部分胶块聚合不均匀，摇动溶液时不要过于剧烈以免引入过多氧气。
（2）温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀。
（3）加样前样品应先离心，尤其是长时间放置的样品，以减少蛋白质带的拖尾现象。
（4）为避免边缘效应，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液。
（5）低电压短时间的预电泳（恒压10-20V，20-30min），清除凝胶内的杂质。
3. 转膜过程中需要注意：（1）滤纸、胶、膜之间不能有气泡。
（2）滤纸、胶、膜的大小和摆放顺序。
胶和膜上要做好标记，识别正反面和上下。
（4）PVDF膜需要100%甲醇预处理，后续操作中膜必须保持湿润。
4. 影响抗原抗体反应的因素：（1）电解质：电解质可促进抗原抗体复合物的形成，因此常选用各种缓冲液做为抗体的稀释液。
（2）酸碱度：抗原抗体反应需要适宜的pH值环境，一般为pH6.0~8.0。
（3）温度：温度升高可使反应加速，但温度高于56℃时，可导致抗原抗体的解离，甚至变性。
六、实验讨论此次讨论重点为：本次试验结果无条带原因：转膜后，经过一抗二抗标记和染色，理论上55-80kDa之间应当显示c-Myc的蛋白条带（图4）。
图4：理论上应该出现的转膜后条带需要考虑的原因有以下几个方面：（1）蛋白样品制备（2）检查胶：考马斯亮蓝染胶（3）检查膜：丽春红S染色（4）抗体滴度太低（5）显色过程中有问题（6）试剂放置太久或存放条件不正确。
从直接考马斯亮染色的未经转膜的胶上可以看出，我们是分离出蛋白质的，和邵红霞老师所做实验相对比，本组条带颜色较浅，在蛋白质提取方面可能出现了问题，使得提取的蛋白量减少，浓度下降。