细胞总蛋白提取方法
Trizol法提取细胞总蛋白
0.3M盐酸胍95%乙醇溶液：2.866g盐酸胍，加100ml95%乙醇。
1%SDS溶液：1gSDS溶解于100ml去离子水。
5.用2ml含有0．3mol／L盐酸胍的95％乙醇洗涤蛋白质沉淀，室温放置20min，4℃，7500rpm离心5min；重复洗涤三次；
6.无水乙醇洗涤一次沉淀，室温放置20min；
7.4℃，7500rpm，离心5min；
8.真空干燥沉淀，加入适量l％SDS，55℃振荡溶解3h；
9.不溶物再以4℃，10000rpm离心10min，取上清即为细胞总蛋白溶液，分装后于-80℃保存待用。
Trizol法提取细胞总蛋白
1.提取细胞总RNA吸去上清后，按0.3ml乙醇/1mlTrizol加入中间层和下层有机相，混匀，室温静置3min；
2.4℃，2000rpm，离心5min，取上清转移至新的EP管中（约0.8ml）；
3.加ห้องสมุดไป่ตู้1．5ml异丙醇沉淀蛋白质，室温放置10min；
4.4℃，12000rpm，离心10min，弃上清；
总蛋白的提取
1.单层贴壁细胞总蛋白的提取：（1）倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。
（2）每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。
平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。
重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。
将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
（3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100mM），摇匀置于冰上。
（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。
）（4 ）每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
（5 ）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。
（整个操作尽量在冰上进行。
）（6 ）于4℃下12000rpm离心5min。
（提前开离心机预冷）（7 ）将离心后的上清分装转移到0.5ml的离心管中放于－20℃保存。
2. 组织中总蛋白的提取：（1 ）将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。
（2）加400 μL单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。
然后置于冰上。
（3 ）几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。
（4）裂解30 min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。
3. 加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取：由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（一）操作外还应收集培养液中的细胞。
以下是培养液中细胞总蛋白的提取：（1 ）将培养液倒至15ml离心管中，于2500rpm离心5min。
（2 ）弃上清，加入4ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。
弃上清后用PBS重复洗涤一次。
（3）用枪洗干上清后，加100 μL裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。
WB实验步骤
Western Blotting操作步骤一、蛋白样品制备（1）细胞总蛋白的提取：1、倒掉培养液，PBS洗涤一次，用细胞刮刀或胰酶消化细胞后转移至1.5ml EP管中（悬浮细胞直接转移至EP管），1000r离心5min收集细胞，PBS洗涤两次。
2、加入200ul（25cm2培养瓶）含蛋白酶抑制剂的细胞蛋白裂解液（M-PER），置于冰上间歇反复吹打30min，必要时可以超声破碎。
（整个操作尽量在冰上进行，保持低温。
）3、4℃下12000rpm离心15min。
（提前开离心机预冷）4、收集离心后的上清，分装于-80℃保存。
（2）组织总蛋白的提取：1、称取适量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。
2、200ul含蛋白酶抑制剂的组织蛋白裂解液（T-PER），冰上间歇匀浆30min，使组织尽量碾碎至无明显组织碎块。
3、将混合液移至1.5ml离心管中，4℃下12000rpm离心15min，取上清分装，-80℃保存。
二、蛋白含量的测定1、取0.8ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准（20mg BSA）中，充分溶解后配制成25mg/ml的蛋白标准溶液，-200C可长期保存。
2、取25mg/ml蛋白标准，用0.9%NaCl或PBS稀释至终浓度0.5mg/ml，-200C可长期保存。
3、按50:1的比例混匀BCA试剂A和B制成BCA工作液，工作液24h内稳定。
4、将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20ul加到96孔板中，加标准品稀释液补至20ul。
5、加适当体积待测样品到96孔板中，加标准品稀释液至20ul。
6、各孔加入200ul BCA工作液，370C孵育20—30min或室温放置2h。
7、酶标仪测定A562（540-595nm也可行），根据标准曲线计算样品蛋白浓度。
三、SDS－PAGE电泳（1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸洗洁剂或肥皂用试管刷轻轻擦洗（注意切勿让试管刷的金属把手刮花玻璃板，尽量不要使用洗衣粉，因其含固体颗粒容易损伤玻璃板）。
真核细胞裂解和总蛋白提取试验的标准操作规程
真核细胞裂解和总蛋白提取试验的标准操作规程（编号：032）1、目的及适用范围该SOP用来规范真核细胞裂解以及细胞中总蛋白提取的操作。
2、主要仪器细胞刮刀、冰盒、冷冻台式高速离心机、垂直混匀仪、微量移液器3、试剂及配制方法3.1 PBS（pH7.4）：NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HPO4·12H2O 3.58g、 KH2PO4 0.24g，定容至1L。
3.2细胞裂解液：1% NP40、150mM NaCl、20mM Hepes pH7.5、10% glycerol、mM EDTA；使用时在每40mL细胞裂解液中加入1片蛋白酶抑制剂cocktail，保存于-20℃。
4、相关器皿的预处理所有相关容器和器具均需要预冷5、操作步骤5.1 吸出要收获的细胞的培养基。
5.2 用PBS洗细胞2次，以完全除去培养基，置于冰上。
5.3 加入合适体积的细胞裂解液（具体加入的量可参照问题向导2），用细胞刮刀将细胞刮下后用移液器将细胞裂解液收集至离心管中。
5.4 将离心管置于冰上10min。
5.5 将离心管放入垂直混匀仪，于4℃中快速垂直混匀30min，以使细胞充分裂解。
5.6 30min后，将离心管拿出，于4℃下12000rpm离心15min。
5.7 吸取上清于新的离心管中，上清即为收获的细胞总蛋白；弃去沉淀，沉淀为细胞核和未破碎的细胞。
6、问题向导6.1如果要收取的蛋白为核内蛋白，可以在细胞裂解液里加入0.1%-0.5% 的Triton-100，以裂解核膜，释放核蛋白。
6.2加入的细胞裂解液的量根据收获细胞的培养皿规格以及想要获得的目的蛋白的浓度来决定，正常情况下的比例为：100mm 皿：1.0mL-1.2mL63。
蛋白提取实验步骤
蛋白提取实验步骤:1、细胞总蛋白提取A对于悬浮细胞：离心收集细胞，每106细胞加250 Ul RlPA （在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），振荡。
如果需要提高蛋白浓度，可以适当减少细胞总蛋白提取试剂体积。
B对于贴壁细胞：a用TBS冲洗细胞2-3次。
最后一次彻底吸干残留液。
b加入适当体积的RIPA （使用前数分内加入蛋白酶抑制剂）于培养板、瓶内3-5分钟。
期间反复晃动培养板、瓶，使试剂与细胞充分接触。
c、用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5ml离心管中。
C冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
D 12000g离心5min,收集上清，即为总蛋白溶液。
2、组织蛋白提取：A组织块用冷TBS洗涤2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器。
加入10倍组织体积本试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）冰上彻底匀浆。
如果需要提高蛋白浓度，可以适量减少该试剂体积。
B将匀浆液转移至1.5ml离心管中，振荡。
冰浴30min,期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
C 12000g离心5min,收集上清，即为总蛋白溶液。
1、组织尽可能新鲜，若不能及时提蛋白，组织标本应保存在-80 C 冰箱，并避免反复冻融。
2、全程必须在冰上进行，避免蛋白降解。
3、蛋白酶抑制剂在水溶液中不稳定，需在RIPA使用前数分钟加入蛋白酶抑制剂。
4、裂解过程中如有溶液粘稠现象可用移液器（200 μ l ）反复吹打，或再加入适量裂解液以保证充分裂解。
5、总蛋白溶液不稳定（蛋白酶依旧有活性）可在-80 C短时间保存，建议立即加入蛋白上样缓冲液变性后与-20 C保存，避免反复精品佳作，安心下载，放心使用冻融。
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细胞组织裂解(提蛋白)方法
细胞组织裂解(提蛋白)方法编辑整理：尊敬的读者朋友们：这里是精品文档编辑中心，本文档内容是由我和我的同事精心编辑整理后发布的，发布之前我们对文中内容进行仔细校对，但是难免会有疏漏的地方，但是任然希望（细胞组织裂解(提蛋白)方法）的内容能够给您的工作和学习带来便利。
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蛋白匀浆缓冲液：50 mM Tris—HCl (pH7。
5) 150 mM NaCl 5 mM EDTA 1 % NP-40 1 mM PMSF操作步骤直接用这个进行组织匀浆然后于10000 rpm 离心20分钟收集上清作SDS－PAGE电泳从染色的情况来看所得到的总蛋白纯度都不错条带比较清晰。
我是作的小鼠八种常规组织也包括肾脏在内.将抽提好的蛋白分装后直接放在负八十保存。
上样大概3~8ul每孔都可以的具体看个人需要。
70v 浓缩,150v分离第二种方法裂解液配方: 尿素：8M CHAPS：4％DTT：65mM(现加) PMSF：1mM(现加）MiliQ 水操作步骤：取300mg样品在液氮环境下研磨，加入1ml裂解液混匀，室温静置1小时（实验证明改为匀浆更好，蛋白降解轻），15000g离心1小时，取上清测定蛋白质浓度。
在裂解液中加IPG buffer有两个作用:1，增强蛋白质的溶解性2,可以结合核酸，在沉淀的时候予以除去。
建议最好加,浓度从0。
5—2％不等（这取决于您样品蛋白质的难溶程度）。
IPG buffer 是载体两性电解质，IPG buffer另外一个作用是促进蛋白质溶解的，所以IEF前一定要加,裂解液中没有IPG buffer可以么？（可以的，最后上胶条的时候可以再加）不过，我觉得液氮研磨以后，最好是粗离心一下,把一些结缔组织给离心掉（150g既可)然后再加裂解液。
细胞蛋白提取方法
单层贴壁细胞总蛋白的提取1. 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。
2. 每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。
平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。
重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。
将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
3. 【配制裂解试剂，现用现配制】按1ml RIPA + 25μl PMSF（100mM）+ 110μl Pi（PhosSTOP磷酸酶抑制剂），摇匀置于冰上。
（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。
）4. 每瓶细胞加100 μl的裂解液，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
5. 裂解完后，然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。
（整个操作尽量在冰上进行）6. 于4℃下12000rpm离心15 min。
（提前开离心机预冷）7. 将离心后的上清分装转移倒0.6ml的离心管中放于-80℃保存。
PhosSTOP磷酸酶抑制剂（stock solution）配制方法：1片PhosSTOP+1ml RIPA，充分溶解后按110ul封装9管。
-20℃保存有效期6月，4℃保存有效期1月。
BCA法测定蛋白浓度检测试剂准备：1．BCA工作液（室温）2．RIPA（1ml）（4℃）3．蛋白工作液（0.5mg/ml）（4℃）4．96-Well板5．冰盒6．待测样品（4℃）操作步骤：1. 根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。
2. 标准孔加样3. 待测样品稀释20倍，19μl RIPA + 1μl（待测样品）4. 测定本底，20μl RIPA加3孔，取平均值。
5. 各孔加入200μl BCA工作液，37℃放置20分钟。
WB操作步骤-自己整理
Western Blot 相关实验方法与试剂（湿转法）人工肝实验室学习姚瑶（一）目的蛋白提取：（1）单层贴壁细胞总蛋白的提取：1、倒掉细胞培养液，加入Hanks液洗涤一次后倒掉，根据所用细胞决定是否用胰酶消化，加入适量（约5ml）新鲜细胞培养液后，将贴壁细胞吹起，并转移至4支离心管内，配平后，1500转离心10min。
2、倒掉上清，用4度预冷PBS溶液洗涤沉淀，1500转离心10min。
共洗三次，每次十分钟。
3、倒掉上清，吸净，每管加入50ul 细胞裂解液RIPA，吹散，加入后由于DNA的释放可迅速变粘稠，故应尽快转移至1.5ml EP 管内，-20℃裂解30min。
4、超声波细胞裂解仪上将各管裂解15s。
（可不做）5、4℃，12000转离心10min。
6、将上清转移至0.5ml EP管中，每管100ul，冰浴待用。
（2）组织中总蛋白的提取：1、取约100mg肝组织于研磨器内，加入500ul 细胞裂解液RIPA，研磨后吸出于1.5ml EP管内，再加入500ul RIPA，研磨后吸出于上EP管内。
冰上裂解30min。
2、配平后，4℃，14000转离心10min。
3、将上清分装于0.5ml EP管内，每管100ul，冰浴待用（二）蛋白含量的测定：1、稀释标准品：10ul标准品C液+90ul PBS溶液，混匀。
2、按0、1、2、4、8、12、16、20ul将稀释后的标准品加入于96孔板内，并用PBS将各孔补足20ul。
3、将第2、3排96孔板分别加入样品1ul、0.5ul，（可采用倍比稀释法），并用PBS将各孔补足20ul。
4、配制工作液：按A液：B液=50：1配制适量工作液，每孔加入200ul。
5、37℃水浴30min。
6、酶标仪测定各孔OD值（A570，Mode1）。
7、绘制标准曲线，计算样品蛋白浓度。
（三）SDS-PAGE电泳：（1）清洗玻璃板（2）灌胶与上样：1、配胶：根据目的蛋白的大小，决定分离胶的浓度。
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细胞总蛋白提取方法
一、溶液配制
1.100mM NaF (NaF MW=41.99) 10ml
称取NaF 41.99mg，超纯水8ml溶解后定容至10ml。
2.100 mM PMSF
3.RIPA溶液100ml
成分分子量终浓度
Tris 121.14 0.6 g 5.0 mM (pH 7.4)
NaCl 58.44 0.87 g 150 mM
EDTA 372.24 37.22 mg 1 mM
NP-40 1 ml 1%
SDS 0.1 g 0.1% 脱氧胆酸钠0.5 g 0.5% 溶解于80 ml超纯水中，待溶解后加入HCl调pH值至7.4，定容至100 ml。
※使用前加入
成分储存浓度加入量终浓度
PMSF 100 mM 10μl/1ml 1 mM
NaF 100 mM 10μl/1ml 1 mM Aprotinin 10μg/μl0.2μl/1ml 2μg/μl
Leupetin 10μg/μl0.2μl/1ml 2μg/μl
二、方法
1.细胞收取
1)细胞传代至60mm培养皿中，待细胞融合约100%，收集细胞
2)弃培养基，加入PBS 2ml清洗培养皿一次，弃PBS。
3)加入0.05%胰酶2ml，37℃温育1min。
4)待细胞变形后，将细胞吹下转移至一个1.5ml
ependorf 管中，10,000rpm×3min，4℃
5)弃上清，1ml预冷的PBS清洗沉淀，10,000rpm×
6)重复PBS清洗一次
7)弃上清，-80℃冻存待裂解
2.蛋白提取
1)向细胞沉淀中加入200μl RIPA缓冲液(含1mM PMS
1mM NaF、2μg/ml Aprotinin、2μg/ml Leupetin)
后冰上放置40mins
2)10,000rpm×15min，4℃
将上清转移至一个新的ependorf 管中（约250μl）。