蛋白质定向进化的高通量筛选方法
研究蛋白质筛选的新技术
研究蛋白质筛选的新技术研究蛋白质筛选的新技术引言：蛋白质是生命体中最基本的宏大分子，参与了几乎所有的生物活动。
因此，研究蛋白质的结构和功能对于理解生命的本质以及发现新的药物治疗方法具有重要意义。
然而，由于蛋白质结构复杂、功能多样且常常相互作用，导致蛋白质筛选的过程变得十分困难。
为了克服传统方法在蛋白质筛选中面临的挑战，科学家们不断研究和开发新的技术和方法。
本文将介绍一些研究蛋白质筛选的新技术及其在蛋白质研究和应用中的潜力。
一、质谱技术质谱技术是一种高效、灵敏的方法，可以用于分析蛋白质的结构和功能。
质谱技术通过分析蛋白质样本中的质量-电荷比，可以推断出蛋白质的分子量和氨基酸序列。
同时，质谱技术还可以用于分析蛋白质的修饰情况，如糖基化、磷酸化等。
近年来，科学家们不断改进质谱技术的灵敏度和分辨率，使得其在蛋白质筛选中的应用变得更加广泛。
二、蛋白质芯片技术蛋白质芯片技术是一种高通量的蛋白质筛选方法，它可以同时测试多个蛋白质样本与特定分子的相互作用。
蛋白质芯片通常包含数千种不同的蛋白质，并以一种特定的方式排列在芯片上。
当样本中的蛋白质与芯片上的蛋白质发生特异性相互作用时，可以通过检测技术快速准确地识别出来。
蛋白质芯片技术极大地提高了蛋白质筛选的速度和效率，为蛋白质研究和药物开发提供了有力的工具。
三、单细胞分析技术传统的蛋白质研究方法往往是在整个细胞或组织水平上进行的，这会掩盖住个体细胞之间的差异。
而单细胞分析技术则可以对个别细胞进行蛋白质分析，从而揭示出不同个体细胞之间的差异。
单细胞分析技术可以通过流式细胞术和质谱技术等方法实现。
这些新技术的出现使得蛋白质筛选更加精确和准确，有望为疾病的诊断和治疗带来重大突破。
四、人工智能技术随着人工智能技术的快速发展，其在蛋白质筛选中的应用也越来越广泛。
人工智能可以快速处理和分析大量的蛋白质数据，从中发现模式和规律。
利用机器学习和深度学习算法，人工智能可以预测蛋白质的结构和功能，从而加速蛋白质筛选的过程。
基于蛋白质芯片技术的新型分子筛选方法
基于蛋白质芯片技术的新型分子筛选方法新型分子筛选方法一直是生物化学领域研究的前沿之一。
其中，蛋白质芯片技术的应用日益普及。
它是一种基于蛋白质相互作用的高通量筛选方法，主要用于发现新的生物分子相互作用网络。
本文将为你介绍这种方法，并探讨其在生物领域中的应用和前景。
蛋白质芯片是一种将纯化的蛋白质修饰到芯片上的技术。
这些芯片非常小，通常仅为几毫米大小。
蛋白质芯片中通常包含数百种蛋白质。
这些蛋白质是以高度阵列的方式固定在芯片的表面上。
利用蛋白质芯片技术，可以将新的生物分子（如药物分子）与这些蛋白质相互作用，并通过仪器读取反应信号，从而实现筛选。
利用这种方法，可以快速地鉴定出与蛋白质相互作用的生物分子，其中包括新的药物候选分子。
蛋白质芯片技术的背景可以追溯到20世纪80年代，当时研究人员首次报道了一种将多肽固定到聚合物表面上的方法。
1994年，一组研究人员在研究肿瘤标志物的相互作用中发现了蛋白质芯片技术的潜力。
此后，该技术发展迅速。
蛋白质芯片可以用于发现多种生物分子之间的相互作用。
这些相互作用包括蛋白质-蛋白质相互作用、酶-底物相互作用和抗体-抗原相互作用等。
这意味着蛋白质芯片技术可以帮助研究人员发现新药物、了解基因调节和细胞信号传递的机制，并开发新型的诊断工具等。
近年来，蛋白质芯片技术已经广泛应用于生命科学领域。
一项使用蛋白质芯片技术研究肝癌的研究表明，该技术可以用于鉴定潜在的血清生物标志物。
同时，蛋白质芯片技术还被用于筛选新型抗病毒药物。
例如，一项应用蛋白质芯片技术筛选抗人类乙型肝炎病毒药物的研究表明，该技术可以用于发现对传统疗法不敏感的新型药物。
总的来说，蛋白质芯片技术是一种十分有效的新型分子筛选方法。
通过应用这种技术，生命科学研究人员不仅可发现新药物和新的生物标志物，还可了解基因调节和细胞信号传递机制。
同时，蛋白质芯片技术还将推动生命科学研究领域的进一步发展，使我们能更好地了解生命的奥秘。
蛋白质稳态技术的靶向筛选方法
蛋白质稳态技术的靶向筛选方法随着生物医学研究的不断发展，蛋白质稳态技术成为了现代生物科学领域中一项重要的研究工具。
蛋白质是生物体内功能最为复杂和多样的分子，研究蛋白质在生理状况下的稳定状态对于理解细胞功能和疾病机制具有重要意义。
为了实现对特定蛋白质稳态的靶向筛选，科学家们开发了多种方法和技术，本文将重点介绍几种常用的蛋白质稳态靶向筛选方法。
1. 亲和层析法亲和层析法是一种常见的蛋白质稳态筛选方法。
该方法基于目标蛋白质与特定配体的高亲和力相互作用，通过将配体固定在亲和层析树脂上，然后将混合溶液与树脂接触，使目标蛋白质与配体发生特异性结合。
通过洗脱和分离步骤，最终得到目标蛋白质纯化和筛选。
亲和层析法在药物开发、蛋白质结构研究等领域有着广泛的应用。
2. 亲和质谱法亲和质谱法结合了质谱技术和亲和层析法，用于筛选蛋白质的靶向分析。
这种方法首先利用亲和层析法将目标蛋白质与配体结合，然后通过质谱仪进行检测和分析。
亲和质谱法凭借其高灵敏度和高精确度，在蛋白质相互作用、定量和鉴定等方面具有广泛应用。
3. RNAi筛选法RNA干扰技术（RNAi）是一种利用小分子RNA干扰靶标基因表达的方法。
RNAi筛选法通过引入特定的小分子RNA到细胞中，沉默或抑制目标蛋白质的表达。
通过观察沉默基因后的细胞变化或功能损失，可以筛选出与目标蛋白质相关的稳态调控通路。
RNAi筛选法具有高通量、高效率的特点，在抗癌药物开发和疾病机制研究方面具有重要作用。
4. 蛋白质芯片技术蛋白质芯片技术是一种高通量的蛋白质筛选方法。
该方法通过将大量的蛋白质固定在玻璃片或硅片上，然后与样品中的目标蛋白质进行特异性结合，最后利用荧光或质谱等技术进行检测和分析。
蛋白质芯片技术具有高通量、高灵敏度和高选择性的特点，广泛应用于蛋白质-蛋白质相互作用、药物筛选和疾病标志物发现等领域。
5. 蛋白质结合域筛选法蛋白质结合域筛选法是一种基于蛋白质结合域特异性结合的筛选技术。
蛋白质分子定向进化其他方法
蛋白质分子定向进化其他方法自然界在长期的进化过程中．产生了许多具有重要功能的符合人们需要的理想蛋白质，然而，当它们处于复杂的化学反应体系时，则往往不能满足人们的需要。
为此，必须不断推出新的方法来改造现有的蛋白质，以满足工业的需要。
自然进化是有机体在长期的进化过程中自发出现的非常缓慢的过程。
自然选择往往是朝着有利于机体的方向进行的。
大量定点基因突变实验表明，蛋白质功能和性质的改变来自于许多小的内部修饰的积累，这些小的修饰或突变分布于较大的序列空间内，人们试图利用已有的结构生物学信息对蛋白质进行合理设计（rational design），但蛋白质结构的复杂性极大地增加了合理设计的难度，更何况，对于大多数要改造的蛋白质来说，我们并不清楚其三维结构信息，不能进行合理设计，而近年来发展的分子定向进化（molecular directed evolution）策略属于蛋白质的非合理设计范畴，它不需要事先了解蛋白质的三维结构信息和作用机制，而是在体外模拟自然进化的过程（随机突变、重组和选择），使基因发生大量变异，并定向选择出所需性质或功能，从而在几天或几周内实现自然界需数百万年才能完成的事情。
定向进化第一步是由一个靶基因或一群相关的家族基因起始创建分子多样性（突变和／或重组）；然后对该多样性文库的基因产物进行筛选，那些编码改进功能产物的基因被利用来继续下一轮进化；重复这个过程直到达到目标。
该进化策略有以下三个显著特征：a.进化的每一关键步骤都受到严密控制；b.除修饰改善蛋白质已有特性和功能外，还可引入一个全新的功能，来执行从不被生物体所要求的反应；甚至为生物体策划一个新的代谢途径；c.能从进化结果中探索蛋白质结构和功能的基本特征。
蛋白质定向进化通常分三步进行：基因随机诱变、体外重组和筛选。
每一步都可以有多种方法。
常见的定向进化方法有：①易错PCR技术②DNA改组技术③外显子改组④交错延伸重组⑤随机引物体外重组法（RPR）。
蛋白质定向进化的高通量筛选方法
蛋 白质 定 向进 化 的高 通 量 筛 选 方 法
黄 春 晓 ， 学 军 段
（ 中原工学院能源与环境学院 ， 河南郑州 ４ １９ ） ５ １１
摘 要 ： 向进化是改造蛋 白质分子 的有效新 策略。创建突变库 的方法 已经有很 多而且 比较 通用 ， 定 而建 立有效 的 高通量 的筛 选方 法是 蛋 白质定 向进化成功 的关键 。本文综 述 了近几 年发展起 来 的用 于定 向进化 的高通 量的 文
库 筛 选 方 法 ， 绍 了各 种 展 示 技 术 及 流式 细胞 分选 技 术 的原 理 及 其 在 文 库 筛 选 中 的应 用 ， 析 了 存 在 的 问 题 及 介 分 发展趋势 。 关 键 词 ： 向进 化 ； 通 量 筛 选 方 法 ； 示 技 术 ； 式 细 胞 分 选 技 术 定 高 展 流
ＨＵ Ｎ ｈ ｎ— ｉ ， Ｕ Ｎ Ｘ ｅ— ｕ Ａ Ｇ Ｃ ｕ ｘａ Ｄ Ａ ｕ ｊｎ ｏ
（ ｏ ｅｅ ｆ ｎｒ ＆ Ｅ ｖ ｏ ｍ ｎ ｏ Ｚ ｏｇｕｎＵ ｉ ｒ ｔ ｏ Ｔ ｃ ｎｌ ， ｈｎ ｚ ｕ ５０ ７ Ｃ ｉ ） Ｃ ｌ ｇ ｅ ｙ ｎ ｉ ｎ ｅｔ ｆ ｈｎ ａ ｎ ｅ ｉ ｅ ｏ ｇ Ｚ ｅｇ ｏ ００ ，ｈｎ ｌ ｏ Ｅ ｇ ｒ ｙ ｖ ｓｙ ｆ ｈ ｏ ｙ ｈ ４ ａ Ａｂ ｔ ａ ｔ Ｄｉ ｃｅ ｖ ｌ ｔ ｎ ｉ ｅ ｏ ｒ ｌ ｔ ｔ ｇ ｒｅ ｇｎ ｅ ｎ ｒ ｔｉ ｓ ｓｒ ｃ ： ｒ ｔ ｄ ｅ ｏｕ ｉ ｓ ａ ｎ ｗ ｐ ｗｅｆ ｒ ｅ ｙ ｆ ｎ ｉ ｅ ｒ ｇ ｐ ｏ ｅｎ ．Ｍａ ｙ ｆ ａ ｉ ｌ ｔ ｏ ｓｆｒｇ ｎ ｅ ｏ ｕ ｓａ ｏ ｉ ｎ ｅ ｓｂ ｅ ｍｅ ｈ ｄ ｏ ｅ －
定 向进 化技 术 可 以将 自然 界 漫长 的蛋 白质 改造 过程 缩短 到数 年 、 月 、 至数天 。蛋 白质 体 外定 向进 数 甚 化技术 已成功地 应用 于 酶活 力 的提高 、 药物 蛋 白特性 的改进 、 代 谢 途径 的获 取 等众 多 领 域 ， 工农 业 生 新 对 产、 医药卫 生 、 境工 程等 行业 有重 要 的意义 。蛋 白质定 向进 化 的关键 步骤 包括 （ ）建 立随着定 向进 化 的不 断发 展和 广泛 应用 ， 创建 基 因突 变库 的方 法 已有 很 多 ¨ ， 儿 已不 再是 阻 碍定 向进 化速度 的关键 。 目 前定 向进化 的最 大瓶 颈是 缺乏 高通 量 的筛选 方法 ， 多 研究 者 致力 于寻 找灵 敏 度 高 、 速 、 便 的筛 选 方 很 快 简
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Gathering and processing of information
Experimental problem Generation of the work list
Preparation of samples Loading of the bio-chips Fabrication of the specimen
Incubation Detection Analysis and reporing
Inspection by means of software
Preparation of data and dissemination of information
图 1 高通量筛选示意图
图 2 高通量筛选系统15年的发展情况
较复杂和困难；另一局限在于供体和受体的选择范围
有限。
荧光报告系统 利用基因融合可以很容易地检测到受 具有较好的特异性和稳定性。荧光激活细胞分选技术
体或配体门控性离子通道的激活对大 促进了带有特异序列的核酸内切酶快速有效的筛选。
量基因在转录水平上的影响。报告基 然而，除非绿色荧光蛋白是非常高表达或密集的本底
3、高通量筛选的应用
❖ 3.1 药物筛选
G（e3n）er加at入ion特o异f▪t性he蛋3w白o.r1与k l.其is1t结反合；酵母双杂交系统药物筛选模型
表达的蛋白质缺乏翻译后修饰，结果存在假阳性和假阴性
研研2（、究究3）高周 周通不期期量同短短筛结，，选构操操▪▪常和作作用官33简简技能..便便11术 团、、..的23快快小速速基 基分子于于化合细动物从胞物固体的的载体药药释物物放以筛筛后必选选须能模模够位型型点专一地连接到修饰的是 础表面在上。酵发母展选双起方杂来法交的技药术物基筛
蛋白质的高通量鉴定的技术手段
百泰派克生物科技
蛋白质的高通量鉴定的技术手段
蛋白质组学诞生至今衍生了许多不同的研究方法，如酵母双杂交系统、抗体芯片技术、凝胶电泳技术和表面离子共振技术等，这些方法在通量、灵敏度以及准确性等方面都差强人意，直到生物质谱技术的出现才让蛋白质组学研究迎来了高光时刻。
生物质谱技术同时满足了高通量、高分辨率和高准确性的需求，已成为当前蛋白质组学研究的强有力工具。
基于质谱的技术通过“自下而上”分析策略可以尽可能多的鉴定复杂样品中的全部蛋白质，同时实现成百上千种蛋白质的鉴定，在高通量的基础上也保证了鉴定结果的准确性。
基于高通量质谱的蛋白质鉴定方法大致流程为先将蛋白样品酶解消化为小分子肽段，再对经色谱技术分离的肽段进行质谱检测，扫描并采集所有肽段母离子的碎片信息，根据肽指纹图谱即肽段的质谱数据结合理论数据库软件以及生物信息学分析方法可以确定肽段的分子质量等信息，再通过肽段拼接实现完整蛋白质的鉴定，包括定性定量鉴定、结构鉴定和翻译后修饰情况鉴定等。
百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Q ExactiveHF质谱平台结合Nano-LC色谱，提供快速高效的蛋白质高通量鉴定服务技术包裹，可同时准确鉴定成百上千种蛋白质，适用于各种大样本量以及复杂混合蛋白样本的鉴定分析，欢迎免费咨询。
生物学中的蛋白质高通量筛选技术
生物学中的蛋白质高通量筛选技术蛋白质是生命活动的关键分子之一，它们广泛存在于生物体内，并且起着重要的生理和生化作用。
因此，准确地鉴定、分离和研究蛋白质对于生命科学的研究至关重要。
在前期的研究中，一般使用手动分离、纯化和鉴定的方法。
但是，这种方法效率极低且繁琐，不能满足当今高通量、快速和精确的科学研究需求。
因此，高通量的蛋白质筛选技术应运而生。
蛋白质高通量筛选技术是指从大量复杂的蛋白质样品中快速、准确、高通量地分离和鉴定目标蛋白质的方法和技术。
这种技术具有快速、准确、高通量、大规模和自动化的特点，是生命科学领域中的一个重要的分析工具。
下面我们来介绍几种常见的高通量蛋白质筛选技术。
1. 质谱分析质谱分析是一种现代生命科学研究中常用的高通量分析技术。
它可以鉴定和分析蛋白质的分子量、序列、结构和功能。
利用质谱分析技术可以在较短的时间内大规模地鉴定和分析蛋白质样品中的目标蛋白质，并能进行高通量分析和自动化，适用于大规模样品的鉴定和分析。
2. 蛋白质芯片蛋白质芯片可用于高通量的蛋白质筛选和分析。
蛋白质芯片是一种微阵列技术，与DNA芯片类似。
它能够同时检测大量的蛋白质分子，并能够通过几种方式进行分析，如质量谱分析、激光捕获等。
与质谱分析相比，蛋白质芯片具有较高的灵敏度和更高的通量。
3. 亲和层析技术亲和层析技术是一种高效的蛋白质分离技术，可以从复杂的混合物中分离出特定的蛋白质。
这种技术基于相互作用的原理，利用化学手段将目标蛋白质与亲和基质结合，通过洗脱、纯化等过程将目标蛋白质分离出来。
亲和层析技术具有快速、准确、高通量和自动化等优点。
总之，高通量的蛋白质筛选技术有助于快速、准确和精确地鉴定、分离和研究复杂的蛋白质样品。
这些技术的不断改进和创新，将极大地促进生命科学领域的研究和发展。
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山东农业大学学报(自然科学版),2008,39(4):653-656Journal of Shandong Agricultural University (Natural Science ) 蛋白质定向进化的高通量筛选方法黄春晓,段学军(中原工学院能源与环境学院,河南郑州 451191)摘要:定向进化是改造蛋白质分子的有效新策略。
创建突变库的方法已经有很多而且比较通用,而建立有效的高通量的筛选方法是蛋白质定向进化成功的关键。
本文综述了近几年发展起来的用于定向进化的高通量的文库筛选方法,介绍了各种展示技术及流式细胞分选技术的原理及其在文库筛选中的应用,分析了存在的问题及发展趋势。
关键词:定向进化;高通量筛选方法;展示技术;流式细胞分选技术中图分类号:Q 93 文献标识码:A 文章编号:1000-2324(2008)04-0653-04收稿日期:2006-07-27基金项目:河南省教育厅自然科学基金作者简介:黃春晓(1968-),女,汉族,河南叶县人,副教授,硕士,主要从事环境生物技术的研究。
HI GH -THR OUGHPUT SCREENI NG M ETH ODS I N THE D I RECTE D EV OLUTI O N OF PR OTEI NSHUANG Chun -xiao,DUAN Xue -jun(College of Energy &Envir onment of Zhongyuan University of Technol ogy ,Zhengzhou 450007,China )Abstract:D irected evoluti on is a ne w po werful strategy f or engineering p r oteins .Many feasible methods f or gen 2erating gene libraries are devel oped .Therefore devel op ing the high -thr oughput screening methods f or desired mutants is the key t o the success in directed evoluti on .I n this article,we summarize the high -thr oughput screening methods devel oped resent years such as F ACS (Fluorescence -activated cell s orting )and the dis p lay technol ogy including phage dis p lay,cell -surface dis p lay,ribos o me dis p lay and mRNA -pep tide fusi on .Their p rinci p les and app licati on in screening for desired mutants fr om mutant libraries are intr oduced .W ediscuss the unres olved questi ons and p r om ising p r os pect in the screening methods .Key words:D irected evoluti on;high -thr oughput screening;method;dis p lay technol ogy;F ACS 定向进化技术可以将自然界漫长的蛋白质改造过程缩短到数年、数月、甚至数天。
蛋白质体外定向进化技术已成功地应用于酶活力的提高、药物蛋白特性的改进、新代谢途径的获取等众多领域,对工农业生产、医药卫生、环境工程等行业有重要的意义。
蛋白质定向进化的关键步骤包括(1)建立目的蛋白质基因的突变体文库;(2)通过合适的筛选系统,快速地从突变体文库中筛选出符合目标的蛋白质。
随着定向进化的不断发展和广泛应用,创建基因突变库的方法已有很多[1][2],已不再是阻碍定向进化速度的关键。
目前定向进化的最大瓶颈是缺乏高通量的筛选方法,很多研究者致力于寻找灵敏度高、快速、简便的筛选方法。
1传统筛选方法及其局限性当突变体酶可赋予宿主细胞生长或存活的优势时,很容易搜寻含有106以上个蛋白质突变体的文库。
然而,这类情况并不多见[3]。
目前,对于酶活的筛选传统方法大多是利用琼脂平板克隆筛选或检测粗酶裂解液的酶活。
琼脂平板克隆筛选主要是针对表达蛋白特殊化学性质的筛选方法,包括利用固体平板上底物产生的颜色变化或菌落周围产生的水解圈进行筛选等。
如用含有淀粉和锥虫蓝的LBSP 的固体平板可以对产淀粉酶的克隆进行筛选,菌落周围淀粉水解圈的大小与淀粉酶活性呈正相关[4]。
琼脂平板克隆筛选简单易行,但是非定量的,而且经常对性状的微小变化不灵敏,一般用于初步筛选。
对粗酶裂解液进行酶活检测是一种普遍使用的方法,但是筛选效率相对较低,如果不使用自动化的仪器辅助,很难达到高通量筛选的目的。
传统的筛选方法在很大程度上限制了突变库容及筛选能达到的通量。
近几年新发展起来的各种展示技术和流式细胞分选技术克服了传统方法的缺点,特别适用于高通量筛选,在蛋白质定向进化中有广阔的应用前景。
2蛋白质定向进化的高通量筛选方法2.1各种展示技术2.1.1噬菌体展示技术 噬菌体展示技术是一种用于筛选和改造功能性多肽的生物技术,编码外源多肽的DNA 片段插入噬菌体或噬菌粒的基因组中,以融合形式与噬菌体的外壳蛋白共同表达于噬菌体表面,经过“吸附—洗脱—扩增”过程筛选并富集外源肽。
这是一种表型与基因型的统一。
噬菌体展示技术最初是以M13噬菌体为载体,以大肠杆菌为宿主的展示系统还有λ噬菌体和T4噬菌体等展示系统。
这些展示系统各有各的优势,但最常用的仍是M13噬菌体表达系统。
噬菌粒展示系统需要辅助噬菌体提供P Ⅷ蛋白以维持噬菌体衣壳蛋白的完整性[5]。
噬菌体展示系统在对酶活进行筛选时主要的问题在于如何将酶与催化所得的产物联系起来。
有一种策略是将底物连接到表达目的酶的噬菌体上,有活性的突变体转化底物成为产物,而产物依然连接在噬菌体表面,再通过能够特异吸附产物的层析柱,带有活性酶的噬菌体被分离出来[6]。
噬菌体展示技术实现了物质的基因型和表现型之间的转化,使人们容易对其进行一系列的生化和遗传操作,与传统方法相比它具备库容量大、表达无偏差、筛选简便等优点[7]。
2.1.2微生物细胞表面展示技术 微生物细胞表面展示技术的原理是:通过靶蛋白(外源蛋白)基因序列与载体蛋白基因序列(定位序列)融合后导入宿主细胞,从而使靶蛋白表达并定位于细胞表面。
革兰氏阴性菌展示系统的主要宿主细胞是大肠杆菌,要在细胞表面实现外源蛋白的功能展示,必须具有分泌和定位到细胞表面的机制,且不干扰细胞的正常功能,所以载体蛋白大部分是外膜蛋白。
另外,鞭毛和菌毛的亚蛋白也可作为蛋白载体。
革兰氏阳性菌的主要宿主是葡萄球菌,在葡萄球菌表达系统中,借助葡萄球菌蛋白A (SpA )的信号肽和细胞表面结合区,可将外源肽输送到细胞表面。
大肠杆菌因缺乏在内质网内对蛋白质有效折叠所需的折叠酶和分子伴侣,表达含有二硫键的哺乳动物蛋白的能力很有限[8]。
而酵母的蛋白质折叠和分泌机制与哺乳动物细胞非常相似,对人的蛋白质表达和展示更具优越性,所以酵母表面展示系统是常用的真核展示系统。
目前已报道的酵母表面展示系统有两种,目的蛋白分别与α或a 凝集素融合,展示于酵母细胞表面。
酵母表面展示系统用于蛋白质亲和力、稳定性及酶活性的定向进化已有成功报道。
Shiraga [9]等利用酵母展示系统构建了一种脂肪酶表达活性中心的基因突变库,在脂肪酶基因和α-凝集素C 端插入一段丝氨酸/甘氨酸的重复序列,使融合蛋白中的脂肪酶活性中心能够更好地与底物作用,增强了脂肪酶的水解活性,获得了底物特异性改变的突变体。
虽然,近年来细胞表面展示表达体系发展很快,但也存在一些问题如表达体系仅能表达单链多肽,对多个亚单位的蛋白不适合,融合目的蛋白常伴随着细胞表面变化等。
2.1.3核糖体展示 噬菌体展示系统和细胞表面展示系统等都需要生物活细胞的参与,由于受转化效率的限制,每次转化都会造成突变库多样性的损失。
而且在表达某些候选蛋白质分子时,宿主菌的生长被抑制或者由于其毒性作用而不能生长,导致亲和筛选的偏差,一些候选分子会有丢失。
核糖体展示技术完全在体外进行,弥补了细胞表面展示的不足。
因此,能显著增加库容量及分子多样性,其中库容量可达1013～1015,比噬菌体展示文库(约109)提高了104～106倍[10],而且可以应用于任何有细胞毒性分子的筛选与研究,显示出了诱人的发展前景。
1997年,Pluckthun 实验室在早期多肽多聚核糖体展示技术的基础上建立了体外筛选完整功能蛋白的新技术—核糖体展示技术(ribos ome dis p lay )[11]。
其基本原理是:编码蛋白的DNA 在体外进行转录与翻译,由于对DNA 进行了特殊的加工与修饰,去掉了3′末端终止密码子,翻译过程中核糖体会停留在mRNA・456・山东农业大学学报(自然科学版) 第39卷的3′末端,从而形成以非共价键连接的“mRNA -核糖体-蛋白质”三元复合体,然后即可进行体外目标蛋白筛选,最后利用mRNA 的可复制性,使靶基因(蛋白)得到有效富集。
Jer mutus [12]等利用核糖体展示技术筛选到1.1n mol 高亲和力的ScFv 单链抗体。
由于受核糖体展示体表面与大小的影响,在核糖体大分子和被展示的小分子之间可能会发生一些不可预测的变化,而导致一些高亲和力的目标分子丢失[13]。
2.1.4 mRNA -多肽融合技术 为克服早期建立的核糖体展示技术的缺陷,Roberts [14]等设计了mRNA -多肽融合技术,该技术与核糖体展示技术相似,也是在体外进行。
在mRNA 的3′末端连入一个嘌呤霉素标记的DNA linker 片段,嘌呤霉素是一种模拟t RNA 末端氨酰基的抗生素,它通过进入核糖体A 位点,接纳由核糖体的肽酰转移酶作用产生的新生肽,从而抑制蛋白质的翻译,形成含有稳定的酰胺键的肽酰嘌呤霉素复合物。
所以,体外翻译时核糖体会停在DNA linker 与mRNA 之间的连接处。
多肽-嘌呤霉素-mRNA 复合物与核糖体解离后,直接用于筛选。
该技术利用嘌呤霉素将mRNA 与多肽以共价键的形式联系起来,从而避免了核糖体展示中因缺少稳定的共价键使得核糖体三元复合物不够稳定的问题,更适合于严谨条件下靶标分子的筛选。