高效液相色谱仪
超高效液相色谱仪原理
超高效液相色谱仪原理超高效液相色谱仪（Ultra Performance Liquid Chromatography, UPLC）是一种用于物质分离和分析的先进仪器。
其原理基于液相色谱技术，通过快速高效的液相流动和较小的颗粒尺寸，实现了更高的分离效率和分离速度。
超高效液相色谱仪的关键组成部分包括色谱柱、泵、进样器、检测器和数据处理系统。
色谱柱中填充有具有特定亲和性的固定相，溶液在固定相表面上发生吸附和解吸过程，从而实现了不同组分之间的分离。
泵负责将流动相从溶液瓶中吸取并提供足够的压力，使其通过色谱柱。
进样器负责准确地将待测样品注入色谱柱中，以确保分析的准确性和精确性。
检测器是超高效液相色谱仪的关键部分，常用的检测器包括紫外-可见吸收检测器（UV-Vis）、荧光检测器和质谱检测器等。
检测器根据样品的物化性质，对样品进行监测和检测。
数据处理系统通过采集和处理检测器输出的信号，对样品进行定量和定性分析，并生成相应的色谱图和数据报告。
超高效液相色谱仪相比传统的液相色谱仪具有更高的分离能力和灵敏度。
其原理在于使用非常小的色谱柱和颗粒尺寸，以使样品在色谱柱内的交互作用时间更短，从而实现更高的峰分离度和较低的噪声信号。
此外，超高效液相色谱仪还具有分析速度快、分析精度高、样品量要求低等优点。
总之，超高效液相色谱仪是一种基于液相色谱技术的先进仪器，通过利用快速高效的分离和分析过程，实现了对复杂样品的分离和定量分析。
其原理主要基于色谱柱、泵、进样器、检测器和数据处理系统等关键组成部分。
通过提高色谱柱和颗粒尺寸，超高效液相色谱仪能够实现更高的分离效率和精确度，广泛应用于化学、生物、医药等领域的科学研究和实践中。
高效液相色谱仪原理
高效液相色谱仪原理
高效液相色谱（HPLC）是一种高效、高灵敏度的色谱分析技术，广泛应用于
化学、生物、药学等领域。
其原理是利用液相在高压下通过填充柱进行分离，再通过检测器进行检测，实现对样品中化合物的分离和定量分析。
首先，HPLC的原理是基于液相色谱的基本原理发展而来的。
液相色谱是利用
液相作为固定相，通过溶质在液相和固定相之间的分配作用，实现对混合物的分离和分析。
而HPLC相比传统液相色谱，其主要特点是在高压下进行分离，使得分
离效率更高、分析速度更快。
其次，HPLC的原理还涉及到柱和填料的选择。
柱是HPLC中至关重要的部分，其选择应根据样品的性质和分离要求进行合理选择。
填料则是柱内的固定相，其种类和粒径大小也会对分离效果产生影响。
通过合理选择柱和填料，可以实现对不同化合物的有效分离。
另外，HPLC的原理还包括流动相和检测器的选择。
流动相是指在色谱柱中流
动的溶剂，其选择应考虑到样品的性质和分离的需要。
检测器则是用于检测柱出口溶液中化合物的存在和浓度的检测，常见的检测器包括紫外-可见（UV-Vis）检测器、荧光检测器、质谱检测器等。
最后，HPLC的原理还涉及到色谱条件的优化。
色谱条件的优化包括流速、温度、洗脱剂的选择等，这些条件的优化可以使得分离效果更好、分析速度更快、峰形更尖锐。
总的来说，高效液相色谱仪的原理是基于液相色谱的基本原理，通过高压下进
行分离，利用合理选择的柱、填料、流动相和检测器，以及优化的色谱条件，实现对复杂混合物的高效分离和定量分析。
这种分析技术在化学、生物、药学等领域有着广泛的应用前景。
高效液相色谱仪的原理及应用
高效液相色谱仪的原理及应用
高效液相色谱仪（High-Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种常用的分析仪器，根据物质在固定相和流动相
间的相互作用差异来实现物质分离和测定的方法。
高效液相色谱的主要原理如下：
1. 样品进样：样品通过进样器注入到流动相中。
2. 流动相泵：流动相泵将流动相以一定的压力送入进样阀。
3. 进样阀：进样阀控制样品的进入量，并通过连接固定相柱。
4. 固定相柱：固定相在柱中，对流动相和待分离的样品进行分离。
5. 检测器：根据样品的特性和分离程度选择合适的检测器进行检测。
6. 数据处理器：将检测的信号转化为柱温度、流量和检测器信号等数据。
高效液相色谱仪的主要应用包括：
1. 分析化学：用于定性和定量分析化学样品中的成分。
2. 生物化学：用于分析蛋白质、核酸、多肽等生物大分子。
3. 药学：用于分析药物中的活性成分、控制药品的质量。
4. 环境分析：用于监测环境中的有机污染物和无机物质。
5. 食品分析：用于检测食品中的添加剂、残留农药和毒性物质。
高效液相色谱仪的优点包括分离效率高、分析速度快、样品容量小、样品制备简单等。
然而，高效液相色谱仪的操作要求严格，仪器费用较高，且需要使用高纯度的溶剂和试剂。
高效液相色谱仪的操作步骤
高效液相色谱仪的操作步骤高效液相色谱仪（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种常用的分离和分析技术。
它利用液体流动相和固定相之间的相互作用，将样品中的混合物分离出来，并通过检测器进行定量分析。
本文将介绍高效液相色谱仪的具体操作步骤。
1. 准备工作在进行高效液相色谱仪的操作之前，首先需要进行一些准备工作。
检查色谱柱是否安装正确，确保色谱柱是干净的，并检查流动相的配制是否准确。
2. 样品制备根据需要分析的物质，准备好待测样品。
样品制备可以包括溶解样品、过滤样品等步骤，以确保样品的纯净度和稳定性。
3. 仪器开机将高效液相色谱仪接通电源，打开仪器的电源开关。
等待仪器初始化，并确保仪器各个部分正常工作。
4. 设置参数在仪器上设置分析所需的参数。
包括选择适当的检测器类型和检测波长、设置流量、温度等。
5. 启动系统启动高效液相色谱仪系统，等待系统稳定。
通常需要一段时间使得流动相在管路中充分平衡，并确保流量稳定。
6. 校正进行色谱柱的校正。
校正过程包括流量校正、波长校正等。
通过校正可以保证仪器输出结果的准确性和可靠性。
7. 注射样品将样品通过注射器引入色谱柱中，控制样品的注射量，通常在微升至毫升的量级。
确保样品的注射量稳定和准确。
8. 分离分析开始运行高效液相色谱仪系统，进行样品的分离与分析。
在此期间，流动相通过色谱柱，将样品中的化合物根据它们与固定相之间的相互作用进行分离。
9. 监测结果通过检测器对分离后的化合物进行监测。
根据检测器的信号，可以得到每个化合物的峰面积、保留时间等数据。
10. 数据处理将监测到的信号输入到数据处理软件中，进行结果的计算和分析。
通常可以得到各个化合物的峰高、峰面积等数据，从而实现对样品的定量分析。
11. 关机分析结束后，关闭高效液相色谱仪的电源开关，并进行必要的清洗和维护工作。
确保仪器的正常运行，并延长其使用寿命。
总结：高效液相色谱仪的操作步骤涵盖了仪器准备、样品制备、仪器设置、校正、样品注射、分离分析、结果监测和数据处理等多个方面。
高效液相色谱简介及操作
a. 紫外检测器(UVD)：应用最广泛的检测器。
原理：朗伯-比尔定律
特点：使用面广； 灵敏度高（检测下限为10-10g／ml）； 线性范围宽； 对温度和流速变化不敏感； 可检测梯度溶液洗脱的样品。
缺点：只能检测有紫外吸收的物质，流动相的截止波长 应小于检测波长。
b. 示差折光检测器 (RID)
凡具有与流动相折光率不同的样品组分，均可使用示 差折光检测器检测。目前，糖类化合物的检测大多使 用此检测系统。
采用紫外、荧光、蒸发激光散射、电化学、质谱等检测器， 检测灵敏度高。紫外检测器检测限可达0.01n g；荧光和电化 学检测器可达0.1pg。
HPLC和经典液相色谱法的比较
3.高效液相色谱法的分类
• 通常将液相色谱法按分离机理分成吸附色谱法、分配色谱法、离子色 谱法和凝胶色谱法四大类。
4.如何阅读色谱图？？
（5）色谱柱平衡后，打开检测器（开灯） （6）测定样品 （7）清洗仪器
色谱柱及流路清洗 进样阀清洗 进样针清洗
四、主要注意事项
1 泵使用的注意事项
• 防止任何固体微粒进入泵体（用0.22 um或0.45 um 的微孔滤膜过滤）
• 流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲盐的流 动相不应保留在泵内更不允许留在柱内。
1.色谱的演化
• 色谱：由于不同的组分与固定相作用强弱不同， 在一定的推动力下，它们在固定相中滞留的时间 长短不一，从而使它们按一定顺序从色谱柱中先 后流出。
经典的柱色谱
• 渐渐地，人们以传统色谱为蓝本开发了气相色谱
经典的柱色谱
气相色谱示意图
• 高效液相色谱：效仿气相色谱，用高压输液泵将
流动相输入高柱效色谱柱，使其在柱内快速流动 ，并在柱末端附加检测器检测分离情况。高效液 相色谱就这样诞生了。
高相液相色谱仪原理
高相液相色谱仪原理
高效液相色谱仪（High-Performance Liquid Chromatography, HPLC）是一种基于溶液相相互作用的色谱分离技术。
其原理
主要包括样品注射、流动相传输、分离柱和检测等步骤。
首先，样品被注入至流动相中，并由进样器进行注射。
注射后的样品通过流动相传输至分离柱。
分离柱是高效液相色谱仪中的关键部件，其内部包含大量的填料，如C18矽胶。
填料的特性会根据样品的性质而选择，以
达到最佳的分离效果。
当样品通过分离柱时，样品中的组分将根据其在填料上的相互作用力不同而被分离。
这些相互作用力包括吸附、配位、离子交换等。
这样，样品中的各个组分将在柱内逐渐分离开来。
分离后的样品组分通过流动相传输至检测器进行检测。
常用的检测器包括紫外检测器（UV），光电二极管阵列检测器（PDA），荧光检测器等。
检测器将样品的吸收、发射、色
散等光学性质转化为电信号，并通过数据采集系统进行记录和分析。
通过对样品的分离和检测，可以得到样品中各个组分的峰值图谱。
根据峰的面积或峰高，可以定量分析样品中各组分的含量。
总的来说，高效液相色谱仪通过样品注射、流动相传输、分离
柱和检测等步骤，利用样品中的组分在填料上的相互作用力不同而实现样品分离和定量分析。
高效液相色谱仪的特点
高效液相色谱仪的特点高效液相色谱仪（High-performance liquid chromatography，HPLC）是现代分析化学中常用的一种高灵敏度和高分辨率的液相色谱技术，被广泛应用于药物分析、环境检测、食品安全、化妆品等领域。
以下将介绍HPLC技术的特点。
高分辨率HPLC技术的分离度比传统的液相色谱(PLC)明显提高，能够分离同种物质中结构相似的同族物质、极性不同的物质等。
相对于气相色谱，HPLC技术更加适用于非挥发性、易发生化学反应、分子量较大的物质等方面。
同时，HPLC技术可以实现对于复杂混合物中单一组分的分离，提高了分析灵敏度。
高选择性HPLC技术可以利用吸附剂、离子交换剂、氢键剂等对待分离的物质进行选择性吸附或交换，实现物质的选择性分离，从而提高了HPLC技术的选择性和灵敏度；同时，HPLC技术还可以通过调节分离剂的使用方式、流速、温度等参数实现更高的选择性。
高灵敏度HPLC技术采用微量采样、高灵敏检测技术，最高检测灵敏度可达到ppb级别。
HPLC技术采用现代检测手段，如UV检测器、荧光检测器、质谱检测等，以及前处理技术，提高了样品的检测灵敏度。
高效率HPLC技术在分析和检测同等数量的样品时，其分离效率比传统的液相色谱高，同时还能够实现自动化操作，提高了分析效率。
与手动的液相色谱相比，HPLC技术的样品处理和分析速度更快，更加准确、可靠。
安全、环保HPLC技术使用无毒和环保类型的溶剂，且溶剂的使用量很少，从而减少了对环境的污染；同时，HPLC技术的操作也更加安全，无需使用大量的有毒溶剂和试剂，可以减少操作风险。
总之，HPLC技术是当前分析领域中应用最广泛、最有效、最成熟的液相色谱技术之一，其高分辨率、高选择性、高灵敏度、高效率和安全环保的特点使得其被广泛应用于药物分析、环境检测、食品安全、化妆品等领域。
高效液相色谱仪操作说明书
高效液相色谱仪操作说明书一、引言高效液相色谱仪（HPLC）是一种广泛应用于化学、生物医药、环境监测等领域的分析仪器。
本操作说明书旨在帮助用户正确有效地操作HPLC仪器，以获得准确可靠的分析结果。
二、仪器概述1. 主要组成：HPLC仪器主要包括进样系统、色谱柱、流动相装置、检测器及数据分析系统等组成部分。
2. 基本原理：HPLC利用流动相在高压下通过色谱柱，样品分离后再由检测器进行检测和信号记录，通过数据分析系统生成分离效果图谱或定量结果。
三、操作步骤1. 准备工作a) 确保仪器电源已接通，并检查各部分连接是否牢固。
b) 打开相关软件并进行系统初始化。
c) 根据待分析样品的特性，选择适宜的色谱柱和流动相。
2. 进样系统操作a) 将待测样品通过合适的方法制备成溶液。
b) 打开进样系统的相关开关，将样品通过进样针注入进样口。
c) 调整进样量和进样速度，确保样品完全被进样器吸取。
3. 色谱柱操作a) 将色谱柱连接到系统中，并确保连接处密封良好。
b) 根据样品性质选择合适的流动相和梯度条件，设置柱温以提高分离效果。
c) 在柱前和柱后设置适当的减压阀，调节流量和压力，确保色谱柱正常运行。
4. 流动相装置操作a) 根据检测要求准备合适的流动相溶液。
b) 将流动相溶液通过流动相装置输送至色谱柱，确保流速和流量稳定。
5. 检测器操作a) 打开检测器并进行相关参数设置，如波长选择、灵敏度调节等。
b) 将流经色谱柱的样品原液通过检测器进行检测，并记录信号。
6. 数据分析与结果生成a) 使用相应的数据分析软件，导入检测到的信号数据。
b) 根据需求进行峰面积积分、峰高浓度定量等相关数据分析。
c) 生成分析图谱或报告，并保存结果。
四、故障排除在操作过程中，可能会遇到一些故障情况，以下列举一些常见故障及其排除方法：1. 柱堵塞：检查柱前和柱后的减压阀是否打开和调整流量。
2. 波峰异常：检查流动相和检测器参数设置是否正确。
3. 信号丢失：检查进样系统是否正常工作，检查柱连接是否存在泄漏。
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分离对象：适用高沸点、热不稳定有机及生化试样分 离分析 （与GC区分）
1.
流程
三、流程及主要部件
2. 主要部件
(1) 高压输液泵
单元泵
双元泵
高压泵作用：输送流动相。 也即是贮液瓶中的有机溶剂或缓冲溶液靠高压泵送入
色谱柱。由于色谱柱的阻力很大，高压泵必须克服阻力 以恒定流速输送流动相，这是保证色谱仪精确度的前提。
发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
规格：常规分析柱(常量柱) 内径2～5mm(常用4.6mm， 3.9mm)，柱长10～30cm (15cm，25cm居多）
制备柱 （21.2mm、30mm、50mm） 半制备柱（〉5mm，7.8mm、9.8mm、10mm）
C18柱（C8柱）
H 3 C
H 3 C H 3 C H 3 C
气动放大泵（恒压泵） 往复泵（恒流泵）是目前液相色谱使用最普遍的一种 高 压泵。其中又分单头往复泵和双头往复泵。 往复泵的优点是泵头内腔体积小，容易洗净，故更换 溶剂十分方便，尤其适合做色谱条件试验时使用。
气动放大泵
往复柱塞泵
(2) 进样装置
手动进样阀通常使用耐高压的六通阀 (美国Rheodyne 公司专利技术)， 其结构如图所示：
常用的压力范围：150～350×105 Pa 欧美等国家习惯使用psi作单位 PSI英文全称为Pounds per square inch。 定义为英镑/平方英寸， 它们之间的换算关系为： 1bar≈14.5psi =105Pa ， 145psi = 1Mpa 1psi = 6.895kPa=0.06895bar
主要是由于修饰到硅胶上的硅烷化 试剂不同。 C8是修饰的带8个碳原子的硅烷， C18是修饰的带18个碳原子的硅烷。
C18较C8极性小，C18更适合分析中等到小极性的化合物， C8更适合中等偏大极性 化合物。
C18柱（C8柱）性能影响因素
物理性质
•硅胶纯度 •色谱柱尺寸 •颗粒形状 •粒径 •表面积 •孔径
•键合类型
化学性质 •碳覆盖率 •封端
正相柱和反相柱
正相柱：固定相通常为硅胶以及其他具有极性官能团，如胺基(NH2)和
氰基(CN)的键合相填料。由于硅胶表面的硅羟基(SiOH)或其他极性基 团极性较强，因此，分离的次序是依据样品中各组分的极性大小，即 极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱；正相色谱使用的流动相极性相 对比固定相低，如正已烷、氯仿 、二氯甲烷等。
反相柱：固定相通常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱官能团的
键合相。反向色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓冲液与甲 醇，乙腈等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组分最先 被 冲洗出，而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。常用的反向填 料有:C18(ODS)、C8(MOS)、C4(Butyl)、C6H5(Phenyl)等。
高效液相色谱
2010/8/21一、高效液相色ຫໍສະໝຸດ 仪Agilent 1100
Waters 2487
二、高效液相色谱法的特点
借助气相色谱 的理论演变
经典的柱色谱
高效液相色谱的模块
20世纪70年代后发展迅速，它在技术上采用高压泵，高效固定相 和高灵敏度的检测器，实现了分析速度快，分离效率高和操作自动化。
高压泵应具有以下性能
✓ 流量稳定，精度在1%左右 ✓ 输出压力高，通常20~30MPa，最高50 MPa ✓ 流量范围宽，一般在0.01~10mL/min范围内 ✓ 能抗溶剂腐蚀 ✓ 压力波动小、更换溶剂方便、容易清洗、具梯度洗脱 ✓ 操作方便、容易维修
✓ 根据泵的操作原理不同，分为恒压泵和恒流泵
（3） 色谱柱
色谱柱是高效液相色谱的心脏，在HPLC的使用中， 保持色谱柱的柱效，延长柱子的使用寿命非常重要。
色谱柱流速方向
色谱柱的参数
色谱柱（Column） 结构：柱管多用不锈钢制成，色谱柱两端的柱接头内装有 筛板，目的是防止填料漏出。 填料：多以硅胶为基质，适用PH 2～8 粒度多为0.2～20 μm(以5～10μm居多) 。
进样装置 （正面）
进样装置 （背面）
图中a为进样阀处于“装样load”位置的情况，此时流动相直接进入色谱柱， 样品注入口与样品环连接，用微量进样针将一定体积的样品溶液从样品 注入口注入，装于样品管内。当将扳手扳至“进样inject”位时，进样阀的 流路发生了改变，流动相通过样品管，将注入的样品带入色谱柱进行分析。 六通进样阀具有使用方便，进样量准确等优点。
预柱和保护柱
从泵来的流动相
预柱
进样口
保护柱
预柱是针对流动相来保护色谱柱
保护柱是针对样品来保护色谱柱
分 析
柱
precolumn——预柱，guard column——保护柱 安装位置不同：预柱是泵后进样口前，途经流动相；保护柱
是进样口后分析柱前，途经样品和流动相。
作用不同：预柱则只能起到过滤颗粒物作用，防止颗粒物堵
样品环(Loop)
规格：有10µL、20µL、50µL等不同容积， 可以根据需要选 配。 作用：用来贮液，也用来测量样品溶液的体积。
将样品环装满后进样，进样量即为样品环的容积，此种 进样方式称为“满环进样”或“定量环进样”。 用定量环进样精密度好，在使用外标法时，应使用此种操 作方式。
自动进样器
C H 2
C H 2 C H 2 C H 2
H 2 C
H 2 C H 2 C H 2 C
C H 2
C H 2 C H 2 C H 2
H 2 C
H 2 C H 2 C H 2 C
C H 2 H 2 C
H 2 C C H 2 H 2 C C H 2 H 2 C C H 2
H H 3 C S C iH 2 C H 3 H H 3 C S C iH 3 C H 3 H H 3 C S C iH 2 C H 3 H H 3 C S C iH 2 C H 3 H H 3 C S C iH 2 C H 3 H H 3 C S C iH 3 C H 3 O S O iO O S O iO O S O iO O S O iO O S O iO O S O iO O S O iO O S O iO O S O iO O S iO O O S O iO H O S O iO