张嗣同 发酵工程第九章：发酵过程优化与放大概论(精品课程)6-5
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以发酵过程多尺度为核心内容的发酵放大解读
以发酵过程多尺度为核心内容的发酵罐设计与操作条件研究华东理工大学，国家生化工程技术研究中心（上海）上海国强生化工程装备有限公司1、发酵过程多尺度理论及过程优化与放大为了实现微生物发酵过程优化，往往从各自研究的技术背景出发，以单一尺度去理解和分析过程特点，长期来把注意力放在菌种的筛选或基因工程菌的构建上，忽视工程问题所引起的优化问题。
此外，由于发酵过程特征数据采集的困难和过程酶学研究的困难，发酵工艺开发研究时只能采用最佳工艺控制点为依据的静态操作方法，缺乏代谢流变化的实时分析。
所依据的基本思想和方法都是采用传统的生物学方法或化学工程的宏观动力学的调控方法，这对活体细胞的发酵调控来说存在很多问题，因此长期来有关发酵过程优化与放大，国内外都没有很好解决。
以华东理工大学张嗣良教授为首的国家生化工程技术研究中心（上海）提出了以活细胞为主体的细胞大规模培养的生物反应过程，可以分为基因分子尺度、细胞尺度与生物反应器尺度的网络结构，是不同尺度的网络状态关系。
认为跨尺度观察与控制是微生物过程优化的关键，由此形成了一套形成了基于参数相关的发酵过程多水平问题研究的优化技术和发酵过程多参数调整的放大技术。
随着过程传感技术和计算机技术的发展，设计了一种用于生物过程多尺度研究的新概念发酵装置，利用该装置技术在实验室规模实现各发酵产品的过程优化研究，其优化结果一般可由几十升发酵罐直接放大到上百M3的工业生产发酵罐。
采用该项目技术原理和装置对各种发酵产品开展研究，发现了红霉素发酵生产过程中黄豆饼粉与葡萄糖作为碳源竞争性利用时对次级代谢的影响机制，使发酵水平由5000u/ml提高到8400u/ml，打破了二十多年来我国红霉素发酵水平停止不前的局面，进入了国际先进水平；金霉素发酵在实验室发酵罐取得成功后，实现了1500公里外由上海至内蒙的远程发酵过程诊断，直接放大到120M3发酵罐，达到提高发酵水平30%以上的国内领先水平；广东星湖公司的鸟苷发酵，发现了代谢流迁移，经深入研究，使发酵水平达到了国际先进水平，由17g/L提高到34g/L，在与国外产品的市场竞争中获得了成功；WHO项目由上海第二军医大学构建完成的Pichia酵母表达系统的基因工程疟疾疫苗高密度高表达由70mg/L提高到2600mg/L，达到了国际领先水平；基因工程白蛋白由700mg/L提高到7g/L。
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可以根据Q10估算。
表5-6a 估算的芽孢不同温度大概灭菌时间
温度/℃
10 0
110
115
12 1
12 5
13 0
时 间 / m in
12 00
15 0
51
15
6. 4
2. 4
表5-6b 一些细菌芽孢的实际杀灭时间
二、培养基的灭菌
（一）培养基的灭菌方法 1. 分批灭菌
概念： 又称为间歇灭菌，就是将配制好的培养基全 部输入到发酵罐内或其它装置中，通入蒸汽 将培养基和所用设备加热 至灭菌温度后维持 一定时间，再冷却到接种温度。也称为实罐 灭菌或实消。
E
k Ae RT (5-3)
式中：
A为比例常数，s-1； △E为活化能，J/mol； R为气体常数，8.314 J/(mol·K)； T为绝对温度，K。
k 值与活化能的关系 活化能处于指数项，可见其与 k 值的变化关系密切。 高温瞬时灭菌 (HTST) 营养损失小的原理，可以从 细菌与一些营养物的不同活化能得到解释。
生物。 防腐剂：抑制体系 (主要是食品)表面和内部微
生物的生长繁殖。 注意：抑菌和杀菌甚至溶菌作用是相对的。
一、化学灭菌
常用的化学药剂
主要有石碳酸、甲醛、氯化汞、碘酒、酒精高 锰酸钾等。
共同规律：杀菌强度有别，但在低浓度时都有 促进微生物生长的刺激作用，在浓度升高后依 次表现出制菌、杀菌和溶菌的现象。
一、湿热灭菌的基本原理
微生物的热阻
热阻指在某一特定条件下 (主要是指温度和加热方 式等) 微生物细胞的致死时间，表征了不同微生物 细胞对热的相对抵抗力。
例如一些微生物的相对热阻和抵抗力如表5-1.
2. 微生物热死亡的数学规律
发酵工程-各章重点ppt课件
第九章 发酵供养 一、呼吸强度、耗氧速率概念及其相互关系 二、临界氧浓度概念 三、氧的传送阻力 四、根据传质方程式分析影响氧传送的要素 五、溶氧系数的测定方法
第十念及其组成 2、温度对发酵的影响 3、最适温度控制 二、pH的控制 1、pH对菌体生长和代谢产物合成的影响 2、pH的调理控制 三、泡沫的控制 1、消泡方法 2、化学消泡剂的特点及类型 3、机械消泡类型
各章重点
绪论 一、发酵、发酵工程概念 二、新产品、新种类投入消费的必经之路 三、发酵工业的开展历史
第一章 菌种与菌种扩展培育 一、微生物工业对菌种的要求 二、菌种保藏方法及其特点 三、工业微生物的培育类型 四、影响种子质量的主要要素
第二章 培育基的制备与灭菌 一、培育基的组成成分及培育基的类型 二、淀粉水解糖的制备方法及其特点 三、糖蜜前处置的方法及其特点 四、灭菌与消毒的区别 五、灭菌方法类型、微生物热阻、致死时间、致 死
四、补料的控制 1、补料的作用 2、补料内容 3、补料原那么 五、发酵终点判别的要素 六、染菌控制 1、染菌时间对发酵的影响 2、发酵总染菌率概念 3、染菌缘由分析及其防止 4、染菌后的处置方法
一、考核方式：闭卷考试 二、试题类型 1、填空题〔30空，每空0.5分，共15分〕 2、选择题〔10题，每题2分，共20分〕 3、名词解释〔5题，每题3分，共15分〕 4、简答题〔5题，共40分〕 5、论述题〔1题，共10分〕 三、平常成果20％＋卷面成果80％
温度概念 六、湿热灭菌优缺陷 七、分批灭菌的优缺陷 八、空气除菌的方法 九、介质过滤机理
发酵机制 一、发酵机制概念 二、巴斯德效应及其机制 三、乳酸发酵类型 四、氨基酸发酵代谢调控方法 五、抗生素类型
第八章 发酵动力学 一、微生物培育方式及其特点 二、补料培育的类型 三、延续培育的类型 四、延续培育的优缺陷
发酵工程课程总结 ppt课件
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发酵动力学模型：
发酵动力学模型，是为了描述菌体 生长、碳源利用与代谢产物形成速度 变化，以及它们相互之间的动力学关 系。目前有多种动力学分型。
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碳源利用与产物形成速度的关系动力 学分型，它将发酵过程分成了三个类型。 1）Ⅰ型——产物直接与碳源利用有关； 2）Ⅱ型——产物间接与碳源利用有关； 3）Ⅲ型——产物表面与碳源利用无关。
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代谢过程错综复杂，但受体内调 节系统严格控制，并按照顺序、协调 有效地进行，维持体内代谢平衡。
对微生物而言：
代谢过程----细胞内自我调节
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微生物代谢调节方式:
1.细胞透性调节； 2.代谢途径调节； 3.代谢流向调节； 4.代谢速度调节(酶活性或酶数量)。
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②空气流速，一般空气流速提高，可提高供 氧量，但空气流速过大，搅拌器叶轮发生 过载，即叶轮不能分散空气，此时气流形 成大气泡在轴的周围逸出。当空气流速超 过过载速度时，通气效率就不再增加，反 而增加动力消耗。
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③罐压，罐压增大，一般溶氧量增大，但也 会增大二氧化碳溶解度，影响发酵。
④空气分布器，良好分布器可增大供氧量。 ⑤温度，温度升高氧溶解量下降。 ⑥空气含氧量，富氧空气可提高溶解氧量，
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④有毒产物的形成和积累：发酵 液中二氧化碳等代谢产物如果不能及 时从培养液中排出，让其在发酵罐中 积累，就会抑制微生物的呼吸并对微 生物有毒害作用，减小氧的需求量。
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⑤消沫剂的影响：如使用消沫剂可被微 生物利用，则会增强需氧量。
⑥其它因素：发酵接种量大，微生物生 长快，菌体浓度大需氧量多；幼龄菌 体呼吸强度高，需氧量大。
第10章 发酵过程的优化和放大
[2*(5.6+5.6+4 [2*(1+2+2)/3]- [2*(162+162+3 0.3074 )/3]-4=6.13 1=2.33 03)/3]-303=115 4.9 1.5 224 0.3804 4.4 2.8 266 0.3420
四、应用
为了更好地理解和说明生物过程优化的方法,下面以 为了更好地理解和说明生物过程优化的方法 下面以 我们的研究结果为例进一步说明。 我们的研究结果为例进一步说明。 我们根据代谢控制育种理论，利用理性育种技术， 我们根据代谢控制育种理论，利用理性育种技术，以 黑曲霉ATCC2660作为出发菌株，经过紫外与亚硝基 作为出发菌株， 黑曲霉 作为出发菌株 胍联合诱变， 胍联合诱变，筛选到一支抗叠氮化钠的高产核糖核酸 酶的突变株SA-13-20。首先利用单次单因子法，确定 酶的突变株 。首先利用单次单因子法， 了其发酵培养基为: 葡萄糖30g/L，玉米粉 了其发酵培养基为 葡萄糖 ，玉米粉120g/L, NH4NO32g/L, K2SO40.087g/L, pH2.2。 。 为了确定培养基各成分和培养条件对发酵产酶的影响， 为了确定培养基各成分和培养条件对发酵产酶的影响， 利用Plackett-Burman设计对总碳量、葡萄糖与玉米 设计对总碳量、 利用 设计对总碳量 粉比例、 起始pH和接种量等 粉比例、NH4NO3量、K2SO4量、起始 和接种量等 6个因子进行了研究。实验方案及其结果见下表。 个因子进行了研究。 个因子进行了研究 实验方案及其结果见下表。
4. 优化
对回归方程求导， 便可得到其极值点， 对回归方程求导 ， 便可得到其极值点 ， 即最优化的 条件。 条件。 各因子的响应面等高图能够直观地描绘各因子相互作 用的情况。如等高线为圆形， 用的情况。如等高线为圆形，则说明因子间的相互作 用可忽略；若为椭圆或马鞍形， 用可忽略；若为椭圆或马鞍形，则因子间的相互作用 对考察目标是非常明显的。 对考察目标是非常明显的。 另外，响应面等高图同样能求出最优化条件。 另外，响应面等高图同样能求出最优化条件。
发酵工程课件第六章
• 次级代谢及产物 各抗种生次素级、代毒谢素产物、都激是素在和微色生素物生等长。缓慢或停止生
长时期即稳定期所产生的，来自于中间代谢产物和 初级代谢产物。
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第二节 代谢调节方式与机制
一、调节方式 • 代谢途径区域化 • 代谢流向的调控 • 代谢速度的调控 • 细胞透性的调节 • 能荷调节
酶的顺序反馈抑制
抑制
抑制
D
E
Y
Eb
A
B
C
Ea
Ec
F
G
Z
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抑制
途径中的第一个反应（A B）被两个不同的酶所催化，一 个酶被Y抑制，另一个酶被Z抑制。只有当Y和Z同时过量 才能完全阻止A转变为B。另两个控制点（C D），（C F），分别受Y或Z的抑制。
同工酶的反馈抑制
同工酶是能催化同一生化反应，但它们的结构稍有不同，可分别 被相应的末端产物抑制的一类酶。
一、积累代谢产物的有效措施
（一）反馈抑制作用的解除：实质是使代谢途径中的关键酶（别构
酶）的调节亚基的结构基因发生突变，使末端产物或其类似物不再与别 构中心结合，从而解除反馈抑制，积累末端产物；
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（二）反馈阻遏作用的解除：实质是使调节基因蛋白不再与末端产物相结合， 或结合后的复合物不能同操纵基因结合，从而解除了末端产物对酶合 成的阻遏；
① 酶活性的激活（activation）
前体激活：代谢途径中后面的酶促反应，可被该途径中较 前面的一个中间产物所促进。
代谢中间产物的反馈激活：代谢中间产物对该代谢途径的 前面的酶起激活作用。
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2、酶活性的调节（细调）
② 酶活性的抑制（inhibition）：大多是反馈抑制
长时期即稳定期所产生的，来自于中间代谢产物和 初级代谢产物。
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第二节 代谢调节方式与机制
一、调节方式 • 代谢途径区域化 • 代谢流向的调控 • 代谢速度的调控 • 细胞透性的调节 • 能荷调节
酶的顺序反馈抑制
抑制
抑制
D
E
Y
Eb
A
B
C
Ea
Ec
F
G
Z
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抑制
途径中的第一个反应（A B）被两个不同的酶所催化，一 个酶被Y抑制，另一个酶被Z抑制。只有当Y和Z同时过量 才能完全阻止A转变为B。另两个控制点（C D），（C F），分别受Y或Z的抑制。
同工酶的反馈抑制
同工酶是能催化同一生化反应，但它们的结构稍有不同，可分别 被相应的末端产物抑制的一类酶。
一、积累代谢产物的有效措施
（一）反馈抑制作用的解除：实质是使代谢途径中的关键酶（别构
酶）的调节亚基的结构基因发生突变，使末端产物或其类似物不再与别 构中心结合，从而解除反馈抑制，积累末端产物；
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（二）反馈阻遏作用的解除：实质是使调节基因蛋白不再与末端产物相结合， 或结合后的复合物不能同操纵基因结合，从而解除了末端产物对酶合 成的阻遏；
① 酶活性的激活（activation）
前体激活：代谢途径中后面的酶促反应，可被该途径中较 前面的一个中间产物所促进。
代谢中间产物的反馈激活：代谢中间产物对该代谢途径的 前面的酶起激活作用。
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2、酶活性的调节（细调）
② 酶活性的抑制（inhibition）：大多是反馈抑制
09第九章：发酵过程优化与放大概论(精品课程)
软 件 设 计
关键技术 •在线检测参数 •实验室手工测定参数 •间接参数(代谢流特征 或工程特征)
功能
BlORADAR。
•适应多种反应器特点 •融合多种过程理论和 控制理论 •工艺分析与操作 •远程通讯与异地数据 传送和分析
/jpkc/fjgc
发酵过程优化与放大概论
数学模型、静态和动态优化、系统识别、自适应控制、 专家系统、模糊控制、神经元网络、各种混沌现象的研究 复杂性 动态性 多容量过程 不可预测性 高度非线性 线性或拟线性关 系的数学摸型 发酵过程参数趋势曲线相关
困难
发酵生产完 整过程
跨尺度观察
/jpkc/fjgc
/jpkc/fjgc
发酵过程优化与放大概论
v发酵过程优化控制中的方法和手段
第二部分
发酵过程优化控制中的方法和手段
/jpkc/fjgc
发酵过程优化与放大概论
v发酵过程优化控制中的方法和手段
数据驱动型方法
/jpkc/fjgc
发酵过程优化与放大概论
v生物反应器过程的多尺度理论——发酵过程优化 与方法基础
代谢调控研究 代谢工程研究 过程数据采集 和处理的困难 发酵过程酶学 研究的困难 发酵工艺优化研究 的基本思路 单一生理调控机制， 缺乏全局性的概念 • 仍旧局限于寻求培养基配方和最佳的温度、pH、DO等 • 缺乏微观的实时的代谢调控 /jpkc/fjg手段
方法和装备技术研究
/jpkc/fjgc
发酵过程优化与放大概论
v发酵过程优化控制中的方法和手段
基本方法
● 基于参数相关的发酵过程多水平(尺度)问题研 究的优化技术 ● 发酵过程多参数调整的放大技术 区分三个水平(尺度)问题 生物反应器的传递与混和 不同环境条件下的代谢动力学特征 细胞代谢流的迁移 基因水平的启动与表达 …
关键技术 •在线检测参数 •实验室手工测定参数 •间接参数(代谢流特征 或工程特征)
功能
BlORADAR。
•适应多种反应器特点 •融合多种过程理论和 控制理论 •工艺分析与操作 •远程通讯与异地数据 传送和分析
/jpkc/fjgc
发酵过程优化与放大概论
数学模型、静态和动态优化、系统识别、自适应控制、 专家系统、模糊控制、神经元网络、各种混沌现象的研究 复杂性 动态性 多容量过程 不可预测性 高度非线性 线性或拟线性关 系的数学摸型 发酵过程参数趋势曲线相关
困难
发酵生产完 整过程
跨尺度观察
/jpkc/fjgc
/jpkc/fjgc
发酵过程优化与放大概论
v发酵过程优化控制中的方法和手段
第二部分
发酵过程优化控制中的方法和手段
/jpkc/fjgc
发酵过程优化与放大概论
v发酵过程优化控制中的方法和手段
数据驱动型方法
/jpkc/fjgc
发酵过程优化与放大概论
v生物反应器过程的多尺度理论——发酵过程优化 与方法基础
代谢调控研究 代谢工程研究 过程数据采集 和处理的困难 发酵过程酶学 研究的困难 发酵工艺优化研究 的基本思路 单一生理调控机制， 缺乏全局性的概念 • 仍旧局限于寻求培养基配方和最佳的温度、pH、DO等 • 缺乏微观的实时的代谢调控 /jpkc/fjg手段
方法和装备技术研究
/jpkc/fjgc
发酵过程优化与放大概论
v发酵过程优化控制中的方法和手段
基本方法
● 基于参数相关的发酵过程多水平(尺度)问题研 究的优化技术 ● 发酵过程多参数调整的放大技术 区分三个水平(尺度)问题 生物反应器的传递与混和 不同环境条件下的代谢动力学特征 细胞代谢流的迁移 基因水平的启动与表达 …
《发酵工程绪论》PPT课件
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一、发酵工程的特征
（p13）
1、原料：发酵所用的原料通常以淀粉、糖蜜或其他 农副产品为主，只要加入少量的有机和无机氮源 就可进行反应。可以利用废水和废物等作为发酵 的原料进行生物资源的改造和更新。
2、菌种：微生物菌种是进行发酵的根本因素，通过 变异和菌种选育，可以获得高产的优良菌株并使 生产设备得到充分利用，也可以因此获得按常规 方法难以生产的产品。
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10
4、发酵的现代概念
• 利用微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物菌体或其代谢产物的过程， 统称为发酵。
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11
利用微生物的特点：
• 发酵工程所利用的微生物：细菌、放线菌，酵母菌和霉菌等。 • 利用微生物的特点：
(1)对周围环境的温度、压强、渗透压、酸碱度等条件有极大的适应能力。 (2)有极强的消化能力。 (3)有极强的繁殖能力。
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（三）发酵工程产品的类型
• 酒精类饮料、醋酸和面包，而且生产胰岛素、 干扰素、生长激素、抗生素和疫苗等多种食品 、医疗保健药物；
• 天然杀虫剂、细菌肥料和微生物除草剂等农用 生产资料；
• 氨基酸、香料、生物高分子、酶以及维生素； • 单细胞蛋白等微生物菌体。 • 生物能 • 微生物冶炼 • （p3 ）
病用的疫苗等。 • 特点：细胞的生长与产物积累成平行关系，生长速率最大时期也是产物合成速率
最高阶段，生长稳定期产量最高。
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30
2、微生物代谢产物发酵
• 包括初级代谢产物、中间代谢产物和次级代谢产物。 • 对数生长期形成的产物是细胞自身生长所必需的，称为初级代谢产物或中间代谢
产物。 • 各种次级代谢产物都是在微生物生长缓慢或停止生长时期即稳定期所产生的，来
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黄豆饼粉的调控机制
限制补加葡萄糖速率(RGLU) 限制补加葡萄糖速率(RGLU) • 9至25小时，除作氮源外同时作为主要碳源使用 营养缺乏起动 ── •终止RNA在胞内积累， 形成氨基酸等营养缺乏时的严紧响应，在翻译 (p)ppGpp的启动表达合成
水平上进行调控，启动次级代谢
mRNA
• 黄豆饼粉利用时间、与其它碳源的竞争性利用 特点、补料策略、p H 控制、D
远程通讯与异地数据传送与分析
推广应用
DO-发酵液中溶解氧浓度、OUR-菌体代谢耗氧速率、CER-二氧化碳释放速率、RQDO-发酵液中溶解氧浓度、OUR-菌体代谢耗氧速率、CER-二氧化碳释放速率、RQ呼吸商-代谢途径、 呼吸商-代谢途径、KLa-生物反应器中氧传递速率、pH酸碱度、菌体浓度、…等40多 生物反应器中氧传递速率、pH酸碱度、菌体浓度、… 40多 个参数 9-25小时之间 25小时之间 RQ呈低谷状 RQ呈低谷状 必需限制补葡萄糖
0-8小时 : OUR、CER、DO、pH、RQ、F ──不同水平 OUR、CER、DO、pH、RQ、 ──不同水平 基因水平(Science,2001,293(5530):614) DNA 8.9小时 : OUR与CER继续上升呈分枝态； pH迅速上升 RQ呈低谷 8.9小时 OUR与CER继续上升呈分枝态； pH迅速上升 RQ呈低谷 状 ── 非葡萄糖碳源利用； response) 25小时前: 必需 25小时前: 严紧响应 (stringent
5’ 空载 tRNA O (氨基酸缺乏) 控制等应从
核糖体
Байду номын сангаас
(p)ppGpp合成酶 Ⅰ （严紧响应因子） 合成酶Ⅰ 合成酶 三个水平上进行综合考虑 严紧响应因子 ）
5000 u/ml ───> ppGpp u/ml ─── 5000 pppGpp
8200u/ml 抗生素
菌丝分化
为多家企业的生物技术产 业发展做出贡献