矮牵牛pMADS4基因的克隆及序列分析
矮牵牛花香基因BSMT3的cDNA克隆与表达特征分析
应用与环境生物学报2007,13(2):176~179Chi n J App lEnvi ron B i o l=ISSN1006-687X2007-04-25矮牵牛花香基因BS MT3的c DNA克隆与表达特征分析喻麟淳泽1张海英杨涛王立洪刘世贵龙章富*(四川大学生命科学学院/生物资源与生态环境教育部重点实验室成都610064)(1中国科学院成都生物研究所成都610041)摘要以矮牵牛花瓣总RNA为模板,RT-PCR方法克隆得到其BS M T cDNA,全长1100bp,编码357aa,与已有报道phBS M T1(G enB ank N o.AA0501)和phBS MT2(AAO45013)的同源性分别达到97.76%和98.6%,该序列在G en-Bank登录号为DQ494491,命名为phBS MT3.构建的BS M T3cDNA的原核表达质粒p GBS M T转化BL21(DE3)E.co li,获得的重组菌株经0.01m o l/L IPTG诱导后得到正确表达的G S T-BS M T融合蛋白带,以纯化的重组表达蛋白免疫家兔获得其兔抗免疫血清.免疫组化研究结果证实,矮牵牛花香基因BS M T在花瓣、花管中的表达量较其它组织的表达量高.图5参24关键词矮牵牛;BS M T;c DNA;克隆;表达CLC Q78:Q946.8c DNA C loni ng and Expression Characteristi cs ofFloral Scent Gene BS M T3of Pet uni a hybri daYU Lin,C HUN Ze1,Z HANG H a i y i n g,YANG Tao,WANG L i h ong,L I U Shigu i&LONG Zhang fu* (K e y Labora tory of B io-R esource and E co-environm e n t,M i n istry of Edu c a tion,Colle g e o f L i fe S cie n ces,S ic huan Universit y,C hengdu610064,Ch i na)(1Chengdu Instit u te of B iology,Ch i ne se A c ad e my of Sc i ences,Ch engdu610041,Ch i na)Abstract A ne w cDNA(G enBank DQ494491)was cloned from P etunia hybr i da by RT-PCR usi ng the tota lRNA o f its peta ls as te m plate.T he sequence w as1100bp i n leng t h and encoded a m ature peptide w ith357a m i no acids.T his c DNA nam ed as phBS M T3s hared97.76%and98.6%homo log i es to phBS M T1(AAO4501)and phBS M T2(AAO45013)reported for P.hy-brida.T he recomb i nant expressi on stra i n,p G BS M T/BL21,w as constructed by s ub-cloni ng the cDNA unde r the pro m oter of vector p GEX4T-1and the identifi ed reco m b i nant plas m id p G BS M T was transfor m ed i n t o BL21(DE3)E.coli.T his stra i n w as expressed by the induction of0.01m ol/L IPTG,and the f usi on expression product GST-BS M T w as purified and used as t he an-ti gen to i m mun ize rabbits i n order t o prepare target po l yc l onal anti body.T he results of i m muno-h i stochem ical analyses show ed that the BS MT3gene w as expressed large l y i n the pe tals and tubes of P.hy bri da when compared w ith other tissues,such as l eaves,ste m s and ca l yces.F i g5,R e f24K eyword s P etun i a hybr i da;BS M T3;cDNA;c l on i ng;expressi onCLC Q78:Q946.8天然或人工合成的花香成分已广泛用于食品、化妆品、饲料,但花香成分与酶的催化作用联系起来的研究目前较少[1].花香挥发物首次与酶一并分析研究的植物是山子草属植物仙女扇(C lark i a bre w eri)[2,3].安息香酸甲酯和水杨酸甲酯是花香的常见成分[4],如矮牵牛花(Petunia hybr i da)释放安息香酸甲酯[1],烟草释放水杨酸甲酯和安息香酸甲酯[5].据本文作者从G enBank搜索,与花香形成有关的甲基转移酶已登记的植物种类达40余种,涉及的酶类主要有苯甲醇乙酰基转移酶(acety-l Co A:benzy lalcoho l ace t y ltransfe rase,BEAT)[6,7]、水杨酸羧甲基转移酶(S-adenosy-l L-m ethioni ne:sali cy lic aci d m ethy ltrans-ferase,S AMT)[7~9]、安息香酸羧甲基转移酶(benzo ic ac i d ca r-boxy l me t hy ltransferase,B AM T)[10,11]、苯甲醇苯乙酰基转移酶(benzy l alcoho l benzoy l transferase,BEBT)[12]、安息香酸水杨收稿日期:2006-10-10接受日期:2006-12-31*通讯作者C orres pond i ng author(E-m ai:l L zf0028@163.co m)酸羧甲基转移酶(S-adenosy-l L-m eth i oni ne:benzo i c acid/sa licy-l ic ac i d carboxy l m ethy ltransferase,BS M T)[13]、芳樟醇合酶(S-li naloo l syn t hase,L IS)[14].矮牵牛常作为研究花青素、类黄酮的生物合成、花的发育和花香物质的模式植物,其花香主要成分)))安息香酸甲酯的生物合成由BS M T以S-adenosy-L-m e-thion i ne(S AM)实现转甲基使羧基变为羧甲基[5,15].N egre等(2003)报道了矮牵牛BS M T1和BS MT2两个cDNA序列,其研究还发现BS M T的基因表达受植物激素乙烯的抑制[13].本文则报道新的矮牵牛花BS M T cDNA序列、原核表达、抗体制备及其表达定位的研究结果.1材料与方法1.1试验材料及主要试剂矮牵牛(P et unia hybrida,2n=14)栽培于四川大学室内. O ne S tep RNA PCR K it、p M D18-T连接试剂盒、DEPC、各种限制性内切酶均购自T aK aR a公司;总RNA提取试剂盒购自上海华舜生物公司;DNA片段回收试剂盒购自M B I公司;原核表达载体p GEX4T-1购自Phar m ac i a公司,大肠杆菌DH5A、BL21 (DE3)由本室保存.异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)购自P romega公司;丙烯酰胺、N,N c亚甲双丙烯酰胺购自Borhr i ng er M annhe i m公司;N,N,N c,N c-四甲基乙二胺(TE M ED)、工具酶、T4DNA连接酶等购自T a K a R a公司.Bu l k G ST purifica ti on m odules购自Am ersha m Phar m acia B i otech公司.辣根过氧化物酶联羊抗兔Ig G血清购自华美生物工程公司.1.2方法1.2.1矮牵牛花香基因BS M T的RT-PCR矮牵牛花瓣总RNA的抽提参照总RNA提取试剂盒的使用说明书进行.参照报道[13]的序列进行引物设计.上游引物P1(5c-CGATCT-GAATTCATGGAAGTTGTTG-3c)和下游引物P2(5c-cgcg tcgaccg ttcttaatcctcctcag-3c),按T a K a R a公司的O ne Step RNA PCR K it使用说明书.在200L L DEPC处理的薄壁PCR EP管中加入10@O ne Step RNA PCR Buffer5L L,25mmo l/L M gC l210L L,10mm o l/L d NTP5L L,RN ase Inh i bito r(40u-n its/L L)1L L,AM V RT ase X L1L L,AM V-O pti m ized T aq1 L L,BS M T上游引物P1和下游引物P2各1L L(15mm o l/L),矮牵牛花总RNA2L L,RN ase F ree d H2O23L L.扩增条件如下:50e30m i n,94e2m i n,然后94e1m i n、60e30s、72 e1m i n15s共35个循环,然后72e延伸10m in.切下RT-PCR产物特异带,按M B I DNA Ex tracti on K it方法回收c DNA,并与p M D18-T载体连接、转化DH5A E.coli,重组质粒的筛选参照Sathe等(1991)的方法[16]进行.显阳性的重组子(pB-S M T)送上海基康生物工程公司测序.测序结果采用DNAm an、B l ast等进行分析.1.2.2原核表达质粒的构建与表达E co RⅠ+SalⅠ双酶切pBS M T质粒和p G EX4T-1,分别胶回收目标片断,在T4DNA 连接酶、16e下连接过夜,转化DH5A E.coli,经菌落PCR和质粒酶切鉴定后,得到原核表达阳性菌株p G BS M T.将筛选出的p GBS MT质粒转化到BL21(DE3),将含重组质粒菌落pGB-S M T/BL21(DE3)接种于2mL LA(含100g/L氨苄青霉素的LB)培养过夜.取100L L转接到5mL新鲜LA培养液,37e 200r/m in培养4h后,取2mL培养液到无菌试管并添加终浓度为1mm ol/L的I PTG进行诱导表达,余液3mL作为未诱导对照;37e200r/m i n继续培养3h后,12000r/m i n30s离心收集菌体.原核表达蛋白样品于10%SD S-PAGE凝胶电泳,考马斯亮蓝R250染色.1.2.3G ST-BS M T融合蛋白回收按原核诱导表达方法制备样品,经包涵体纯化、变性与复性,复性蛋白液采用Phar m a-cia公司Bu l k G S T P urifica ti on M odule回收融合蛋白,SD S-PAGE电泳检测回收蛋白纯度.1.2.4兔高免血清制备按2mg/kg家兔剂量皮下多点注射免疫日本大耳白兔,15d后减半剂量加强免疫两次,耳静脉取血EL ISA法测定兔高免血清效价,效价合格后在免疫家兔颈动脉取血分离血清,-20e保存.1.2.5不同组织的免疫组织化学采用制备的家兔BS MT 多抗作为一抗,对矮牵牛的组织切片进行免疫组化分析,方法参照P i m enta等(1998)[17].2结果与分析2.1矮牵牛花香基因BS MT的克隆与序列分析以矮牵牛花瓣的总RNA为模板,克隆得到其花香基因BS M T c DNA,其编码框(ORF)全长1074,编码357氨基酸残基(图1).与已知的植物花香基因c DNA序列相比较,结果(图2)发现与矮牵牛BS M T登记序列(AAO45012、AAO45013)[13]分别有8aa和5aa的氨基酸残基的差异,同源性分别为97.76%和98.60%;该c DNA序列在G enBank的登录号为DQ494491.图1BS M T3基因cDNA序列和推导的蛋白质序列Fi g.1c DNA nu cleoti de sequen ce and deduced a m i no aci d sequen ce of BS M T32.2矮牵牛BS MT原核表达从图3结果可以看出,矮牵牛花香基因BS M T c DNA正确插入了原核表达载体pGEX4T-1,重组表达质粒质粒命名为p GB-S MT;转化BL21(DE3)得到的表达菌株命名为p GBS MT/BL21,1772期喻麟等:矮牵牛花香基因BS M T3的c DNA克隆与表达特征分析经IPTG 诱导后的SDS -PAGE 电泳结果(图4)表明得到了正确表达,表达的融合蛋白分子量与预期大小66.6@103基本一致(Lane 4,L ane 6),含空载体p G E X 4T -1转化菌p GEX 4T-1/BL 21诱导表达蛋白(Lane 2)的分子量与预期的26@103一致.2.3 矮牵牛BS MT 在不同组织的免疫定位从图5可以看出,矮牵牛花香基因BS M T 在根、茎、叶、花萼中均无表达产物,而在花瓣和花管中有BS M T 表达,表达产物主要集中在细胞质.图2 矮牵牛BSMT3与已有报道的蛋白序列比较Fi g .2 C o mp aris on of the ne w BSM T c DNA w it h ot h ers reported f or P.hybri da i n a m i no aci dsAAO45012:P.hybri da BSM T1;AAO45013:P.hybri da BS M T2图3 矮牵牛BS M T 原核表达重组质粒的酶切鉴定F i g .3 Enzy m atic i den tification of t he reco mb i n ant plas m idfor prok aryo expression of P.hybri da BS MT3图4 重组质粒原核表达产物SDS -PAGE (10%Gel)Fi g .4 SDS -PAGE of prokaryoti c produ cts of t h e exp res s i on of pgBSM T (10%Gel)图5 BSM T 基因在矮牵牛不同组织的表达定位F i g .5 Iden tificati on for BSM T gene express i on i n d i ff eren t tiss ues of P.hybrida178 应用与环境生物学报 Chi n J App lEnvi ron B i o l 13卷3讨论植物花香具有重要的生物学意义,但目前对植物花香的研究还不够深入,且集中在花香气成分的分析与提取以及人工合成,而对花香的生物合成研究相对较少[18].参与植物花香形成的酶类基因结构解析研究的报道近年来逐渐增多,仅2005年G enBank登记花香形成相关基因的植物种类就达30余种.随着植物花香生物合成机理的研究发展,植物花香的生物合成将成为新的研究热点.高丽萍等(2001)报道茉莉花香气成分除萜烯醇和芳香醇等醇系香气外,主要决定茉莉花特征香气的还有乙酸苄酯、苯甲酸甲酯、邻氨基苯甲酸甲酯等酯类化合物,但酯类香气化合物的合成途径及其酶学却少有研究.他们研究发现,在茉莉花开放过程中,苯丙氨酸解氨酶在花初开时(20:00)活性有所提高;非特异性酯酶同工酶谱带显示酯酶与香气释放有关[19].M ah m oud和Croteau等(2001)应用薄荷呋喃合成酶(m entho f uran synthase,M FS)的反义基因进行转基因,获得的转基因植物的薄荷醇含量增加[20].L e w i nsohn等(2001)将C l arkia bre weri的S-芳樟醇合酶基因(S-li na l oo l synthase,LIS)在番茄果实中实现了特异超表达,转基因番茄果实中S-芳樟醇比对照高123~833倍,其它类萜含量没有观察到明显变化[21].V erbe rne等(2000)在质体中超表达编码细菌ICS和IPL酶基因,转基因烟草植株与野生型植株相比,水杨酸含量高出1000倍,相关防御基因持续组成性表达,抵抗病毒和真菌的能力明显提高,但植株其它性状均正常[22].目前,植物次生代谢基因工程最大的困难是我们对植物次生代谢途径及其调控了解不多,仅鉴定和克隆了少数几个基因[23].未来研究的一项任务是探明植物次生代谢途径,包括次生代谢途径的中间产物和终产物的来龙去脉、参与各步反应的酶及其基因的表达与调控、次生代谢产物合成的细胞分区、定位和转运以及各代谢途径之间的相互联系等,有效地确定代谢基因工程的靶标[24].R eferences1Verdonk J C,H ari ng M A,van Tunen AJ,S c huuri nk RC.ODORANT1 regu l ates fragrance b i osynthes i s i n petun ia flo w ers.P l an t Cell,2005,17(5):1612~16242Ragu s o RA,Pichers ky E.Floral vol atiles fro m C larki a bre w e ri and C.conc i nna(Onagraceae)recent evol u tion of fl oral scent and moth polli na-ti on.P lant SystE vol,1995,194(1~2):55~673P i chersky E,Ragu s o RA,Le w ins ohn E,C roteau R.F l oral scent produc-ti on i n Clarkia(Onagraceae)Ⅰ:l ocali zation and devel opm entalm odula-ti on of m onoterpene e m i ss i on and li nal ool s ynthase acti vit y.P l an t P hysiol,1994,106(4):1533~15404Dobson H.F l oral Vol atiles i n Insect B i ol ogy:Insect-Plant I n teracti on s.B oca Raton,FL:CRC Press,1994.47~815Ragu s o RA,Levi n RA,Foose SE,H ol m berg M W,M c Dade LA.Fra-grance che m i stry,nocturnal rhyth m s and polli nation-syndro m es.i n N i c-oti an a.Phytoche m istry,2003,63(3):265~2686Dudareva N,D.Auria J C,Na m K H,Ragu s o RA,Pichers ky E.Acety-lC o A:b e n z ylalcohol acetyltransferase an enzy m e i nvol ved i n fl oral scentproduction i n C l arki a bre w eri.P l ant J,1998,14(3):297~3047Dudareva N,Raguso RA,W ang J,Ross J R,P i chersky E.F l oral scent production i n C l arkia bre w e riⅢ:enzy m ati c synthes i s and e m i ss i on of benzenoi d esters.P l an tP hysiol,1998,116(2):599~6048Ross J R,Na m K H,D.Auria J C,P ic h ersky E.S-adenos y-l L-m eth i on i ne: salicylic aci d carboxyl m et hyltran sferase,an enzy m e i nvolved i n floral scen t produ cti on and p l an t defense,represents a ne w cl as s of plantm et h-yltrans f erases.A rch B i oc h e m B i ophys,1999,367(1):9~169Negre F,Ko l osovaN,M ann C J,DudarevaN.Nove-l S-adenos y-l L-m et 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矮牵牛MADS2box基因
园 艺 学 报 2008,35(6):917-925Acta Horticulturae Sinica矮牵牛M AD S2box基因郭余龙3(西南大学园艺园林学院,重庆400715)摘 要:综述了近年来研究观赏植物矮牵牛MADS2box基因的文献,重点介绍矮牵牛的研究对深入认识该家族基因在植物发育中的作用所做出的重要贡献,及其所揭示的基因功能的保守性和多样性。
对Gen2 Bank中登录的矮牵牛MADS2box基因进行了系统发育分析。
讨论了研究工作中存在的一些问题。
关键词:矮牵牛;MADS2box基因;花发育中图分类号:S68116 文献标识号:A 文章编号:05132353X(2008)0620917209Petun i a M AD S2box Gene Fam ilyG UO Yu2l ong3(Horticulture and L andscape A rchitecture College,Southw est U niversity,Chongqing400715,China)Abstract:MADS2box genes p lay p ivotal r oles in fl ower devel opment.This paper revie ws the p r ogress of petunia MADS2box gene research,and put s pecial e mphasis on the contributi ons of petunia research t o our knowledge about the r oles of p lantMADS2box fa m ily genes in p lant devel opment,and the functi onal conserva2 ti on and diversity ofMADS2box genes in angi os per m s.W e als o reconstruct a phyl ogenetic tree of petunia and other selected MADS2box genes repositted in GenBank and discuss the p r oble m s in the petunia MADS2box gene research.Key words:petunia;MADS2box gene;fl ower devel opmentMADS2box基因编码的蛋白都具有一个与DNA结合的结构域———MADS域(MADS源于最初发现的几个家族成员MC M12AG2DEF2SRF的首字母缩写),它是重要的转录调控因子,广泛存在于动物、植物和真菌中,在发育调控和信号传导等生命活动中发挥重要作用。
矮牵牛同源三倍体种质创制及减数分裂观察
矮牵牛同源三倍体种质创制及减数分裂观察矮牵牛（Viola tricolor L.）是禾本科植物矮牵牛属的一种植物，具有丰富的药用价值和园艺观赏价值。
矮牵牛同源三倍体是指其细胞中包含有三套完整的染色体组，是一种常见的多倍体植物。
本文旨在探讨矮牵牛同源三倍体种质创制及减数分裂观察的相关内容。
1. 种质来源及选取本次矮牵牛同源三倍体种质创制的选取对象为矮牵牛属中具有较好性状的种质，如花色鲜艳、花型规整等特征。
通过对不同自然种群中的矮牵牛种质进行调查和对比，选取了具有高产、抗逆、抗病等优良性状的种质作为亲本。
2. 方法选择采用杂交与克隆技术相结合的方法进行矮牵牛同源三倍体的种质创制。
首先通过花粉离体培养与处理，创制出不同自然种群的矮牵牛花粉离体培养系。
然后利用杂交技术进行杂交，选择优良性状的杂交子代进行筛选，以获取优良的同源三倍体材料。
第二部分：减数分裂观察1. 样品制备选取已经获得的矮牵牛同源三倍体植株的花蕾为观察样品，进行固定和切片处理。
首先用乙醇醋液对花蕾进行固定，然后采用石蜡包埋和切片技术，制备出适合显微镜观察的花蕾切片样品。
2. 减数分裂观察将制备好的花蕾切片样品放置于显微镜下进行观察，观察减数分裂的各个阶段。
通过高倍显微镜观察花药内的小孢子母细胞分裂过程和成熟小孢子的产生过程，记录并比较同源三倍体与二倍体的减数分裂过程中的差异。
3. 结果分析通过观察和比较，发现矮牵牛同源三倍体花蕾中的小孢子母细胞分裂过程相对于二倍体有着明显的差异，如染色体的配对与分离等。
同时也可以观察到同源三倍体的小孢子发育过程与二倍体有所不同，如胚珠形成、精子细胞形成等。
通过以上研究可以更深入地了解矮牵牛同源三倍体的形态特征和减数分裂过程，为研究矮牵牛的遗传和育种提供了重要的数据支持。
对于矮牵牛的种质创制也提供了理论指导和实践经验。
矮牵牛初级三体创制、细胞学观察及生理特性
生长和发育
观察并记录创制后植株的生长和发育情况，包括株高、叶片 Байду номын сангаас、花蕾数等指标。
02
细胞学观察
实验材料
染色体数目正常的矮牵牛植株 正常培养基
秋水仙碱处理后的矮牵牛植株 秋水仙碱处理培养基
实验方法
2. 取材
分别从两种植株上取下根尖、 茎尖等分生组织。
通过细胞学观察，发现三体细胞 的染色体数目异常，这可能是导 致三体植株生长发育异常的重要 原因。这一发现对于研究染色体 数目异常对植物生长发育的影响 具有重要意义。
对三体植株的生理特性进行测定 和分析，发现其在生长速率、光 合作用、抗逆性等方面与正常植 株存在显著差异，这可能与三体 细胞的染色体数目异常有关。这 些差异可能会对三体植株在实际 应用中的表现产生影响，需要进 一步探讨其潜在的应用价值。
采用适宜的植物培养基，如MS培养基或改良MS培养基，添加适量的植物激 素和营养成分。
实验方法
种子萌发
将矮牵牛种子按照一定的播种量和方式播种在培养基中，控制光照、温度和湿度 等环境条件，促进种子萌发。
染色体加倍
使用秋水仙素等化学物质处理萌发后的幼苗，抑制纺锤体的形成，诱导染色体加 倍。
实验结果
染色体数目变化
参考文献
• Li, J., Wang, Y., Zhang, L., et al. (2021). Physiological and Biochemical Characteristics of Somatic Hybrids between Diploid and Autotetraploid Petunia. Journal of Plant Physiology and Molecular Biology, 47(2), 167179.
矮牵牛同源三倍体种质创制及减数分裂观察
矮牵牛同源三倍体种质创制及减数分裂观察矮牵牛（学名：Petunia hybrida）是一种常见的观赏植物，因其花朵美丽多彩，受到了广大园艺爱好者的喜爱。
在园艺栽培过程中，对矮牵牛进行改良选育一直是研究人员关注的焦点，而利用同源三倍体进行种质创制是其中的重要手段之一。
本文将着重介绍矮牵牛同源三倍体的种质创制方法和减数分裂观察的重要性。
一、矮牵牛同源三倍体种质创制同源三倍体是指植物经过杂种育种、雄性不能发育或者雌性不育等手段，使得其染色体数目为3倍体。
同源三倍体的种质创制对于提高植物的观赏性状、增加抗逆性能以及扩大遗传变异等方面具有重要作用。
在矮牵牛的种质创制中，同源三倍体的应用可以使其花朵更加丰富多彩，叶片更加丰满，整体植株更加健壮。
同源三倍体的种质创制方法主要有人工诱导雄性不育和雌性不育、利用细胞培养和基因工程技术等。
人工诱导雄性不育和雌性不育是应用较为广泛的方法之一。
通过化学诱变剂或者基因突变等手段，对矮牵牛进行处理，使得其产生雄性不育或雌性不育的现象，从而获得同源三倍体种质。
在矮牵牛的同源三倍体种质创制中，还需要注重筛选及混合育种的过程，以保证同源三倍体的稳定性和表型的一致性。
通过选育过程，可以获得具有良好性状表现的同源三倍体种质，为矮牵牛的品种改良提供了重要的遗传资源。
二、减数分裂观察的重要性在矮牵牛同源三倍体的种质创制过程中，减数分裂是一个至关重要的环节。
减数分裂是指有丝分裂的前一次分裂过程，其目的是减少染色体数目，从而形成生殖细胞。
对于同源三倍体的种质创制而言，减数分裂的观察可以帮助研究人员了解其染色体行为、染色体配对情况以及遗传物质的分配等信息，有助于揭示同源三倍体的形成机制和稳定性。
减数分裂观察通常需要采用显微镜等仪器对植物的花药或者花粉进行解剖观察，以获得细胞核的详细信息。
在矮牵牛同源三倍体的种质创制中，对花药进行解剖观察可以发现不同类型的花粉，包括正常形态的花粉、畸形的花粉以及无法正常发育的花粉等。
矮牵牛花色CHS-A基因启动子(Pchsa)的克隆及序列分析
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维普资讯
西 南
６２０ １ ４期 ０６ ９卷
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福建省光泽第一中学高中生物教师论文 矮牵牛中chsA基因的2个启动子在F2分离群体中的分离情况分析
福建省光泽第一中学2014高中生物教师论文矮牵牛中chsA基因的2个启动子在F2分离群体中的分离情况分析摘要：本文以矮牵牛花幼苗为材料,提取基因组DNA;根据GenBank公布的chsA基因启动子序列，设计并合成PCR引物,克隆出chsA基因启动子DNA,并构建到pMT18-T载体, 转化DH5α，获得阳性克隆，经检测后测定序列，萌发矮牵牛（F1）种子,获得实生苗（F2代），利用矮牵牛幼嫩的叶片提取基因组DNA，通过普通PCR扩增出chsA基因启动子DNA，电泳观察条带的多少和大小，统计学分析F2植株中只具有PchsA-L、只具有PchsA-S和同时具有PchsA-L和PchsA-S条带的单株的比例，进行遗传学分析。
关键词：矮牵牛（Petunia）；基因组（Genome）；PCR扩增（amplification—PCR ）；引物（Primer）自1983年首次获得转基因植物以来，植物基因工程研究就进入了蓬勃发展的阶段。
由于组成型启动子在使用过程中逐渐暴露出一些问题（Kumpatla等，1998），寻找更为有效的组织、器官特异性启动子代替组成型启动子，以更好地调控基因表达成为近年来基因工程的热点。
在众多组织特异的启动子中，植物花特异表达启动子的克隆不仅可以通过调控特定基因的表达来提高农作物产量、品质，而且还可以通过RNAi等技术抑制或破坏花特异基因的表达，来创造雄性不育系；在花色基因工程方面，还可以创造颜色各异、形态奇特的花色品种等，因此具有重要的意义和应用价值。
目前已相继分离和鉴定了许多花特异表达基因的启动子，其中查尔酮合酶基因（chs）的启动子研究较多。
我国的张树珍等（2002）、洪亚辉等（2003）、刘佳等（2004）、夏江东等（2006）先后报道从矮牵牛（Petunia hybrida）中克隆了chsA基因的启动子。
特别有意思的是他们克隆的启动子除了个别碱基差别外，最大的差别是洪亚辉等（2003）克隆的启动子缺少了一段150bp左右的序列，而这段序列中不存在典型的调控元件，但经Splice site prediction 分析，发现其符合内含子的序列特征。
矮牵牛同源三倍体种质创制及减数分裂观察
矮牵牛同源三倍体种质创制及减数分裂观察矮牵牛是一种十分美丽的植物，它的花朵小巧精致，色彩艳丽。
而在矮牵牛的育种过程中，三倍体种质创制及减数分裂观察是非常重要的环节。
本文将就矮牵牛同源三倍体种质创制及减数分裂观察进行深入探讨。
一、矮牵牛同源三倍体种质创制1.材料准备要创制矮牵牛的同源三倍体种质，首先要准备好适合的母本和父本材料。
母本通常选择具有良好抗性、繁殖力强、植株健壮的矮牵牛种质。
而父本则需要选择近交亲缘较近的植物，以提高杂种优势的利用率。
2.花粉处理在创制同源三倍体种质的过程中，花粉处理是非常关键的一步。
首先要观察母本和父本的花期，确保它们在同一花期进行花粉处理。
然后需要将父本的花粉用刷子轻轻的涂抹在母本的柱头上，确保花粉充分接触到柱头上。
3.种子培育花粉处理完成后，需要等待种子成熟。
这个过程需要耐心等待，并且要定期对种子进行观察，确保种子在最佳的生长环境下。
一旦种子成熟，就可以开始进行同源三倍体的育种工作了。
4.同源三倍体鉴定在育种完成之后，需要对所得到的植株进行同源三倍体的鉴定工作。
这个过程需要利用细胞学和分子生物学的方法，通过染色体观察和基因检测来确定植株是否为同源三倍体。
只有通过鉴定的植株才能真正成为同源三倍体的种质资源。
二、减数分裂观察1.提取花药在观察减数分裂的过程中，首先需要提取矮牵牛的花药。
花药是花朵中负责产生和释放花粉的组织，通过精细的操作，可以将花药进行提取并制作成玻片，以便后续的观察。
2.染色体分析提取花药后，需要将花药进行染色处理，以便观察染色体的分裂情况。
通过染色体分析，可以清晰地观察到减数分裂的每一个阶段，从而了解减数分裂的过程和规律。
3.细胞观察在染色体分析完成后，需要进行细胞观察。
通过显微镜的放大观察，可以清晰地看到细胞内部的结构和变化，从而观察到减数分裂的每一个细节。
4.结果分析需要对观察到的结果进行分析，总结出减数分裂的规律和特点。
通过结果分析，可以为矮牵牛的育种工作提供重要的理论依据和实验数据，为今后的育种工作提供参考。
矮牵牛花特异表达启动子PchsA的克隆及蓝色基因F3′5′H表达载体的构建
矮牵牛花特异表达启动子PchsA 的克隆及蓝色基因F 3′5′H 表达载体的构建李吉莲1,2,姚宁涛1,祝建波1,邓福军2*(1.石河子大学生命科学学院农业生物技术重点实验室,新疆石河子832003;2.新疆农垦科学院棉花所,新疆石河子832000)摘要 [目的]克隆花特异表达启动子PchsA ,将此启动子与蓝色基因“F 3′5′H ”构建新的表达载体,拟以该启动子驱动“F 3′5′H ”在其他花色中特异表达。
[方法]根据G enB an k 报道的矮牵牛启动子的序列设计并合成一对特异引物,以蓝紫色矮牵牛总D N A 为模板,用P CR 仪扩增目的片段。
[结果]P CR 扩增出的启动子D N A 片段长约550bp ,回收后连接到PGM -T 质粒载体上,经转化、筛选确定重组子,酶切鉴定后送上海生工生物工程公司测序,得到片段长度为553bp 。
经D N AM AN 软件分析和G enB ank 上B LA S T 序列比对,显示序列与已报道序列同源性为98.55%。
应用pcgen e 软件进行序列分析,结果表明试验克隆的启动子含有启动子所必须的所有调控元件,这与报道的序列基本一致。
[结论]试验成功地克隆了CH SA 启动子并将其与“F 3′5′H ”构建成能够在植物中进行遗传转化的表达载体,为培育新型花色新品种奠定了基础。
关键词 矮牵牛;PchsA 启动子;克隆;蓝色基因F 3′5′H ;表达载体中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2009)17-07897-03C lon in g o f th e Spe c ific E xp re s s ion G e n e Prom o te r-Pchs A o f Pe t un ia hyb rida F low e r an d C on s tru c tio n o f F 3′5′H G en e E xp re s s ion V e c to r LI J i-lia n e t a l (K e y L abo ra to ry o f A g r icu ltu re B io te chn o logy ,C o lleg e o f L ife S cien ce ,S h ih e zi U n ive rsity ,S h ih ez i ,X in jian g 832003)A b s tra c t [O b je ctive]T h e specia l exp ressionvecto r -F 3′5′H ,w h ich w a s n ewtype o f v ecto r ,a com bin a tiono f b lu e co lor gen e v ecto r-F 3′5′H an d PchsA clon ed ,fo r o th e r flow e rs i n Petunia hyb ri da cou ld be arou sed.[M e th od]A cco rd in g to th e sequ en ce o f flow e r tissu e -specific exp ress ion gen e CH SA pro-m o te r in Petun ia hy b rida repo r ted by G enB an k ,a pa ir o f p r i m e rs w a s syn th e sized.W ithto ta lD N A o f Petun ia hyb rida u sed as tem p la te ,a D N Afragm en t abou t 550bp w a s am p lified by P CR p rocedu re.[R e su lts]T h e D NAfragm en t w as li n k ed in pGM -T v ecto r an d th e re com b in an t w a s con firm ed a fte r its tran sfo rm a tion and filtra tion.T h enth e recom b in an t w as iden tified w ithre striction en zym e s an d sub je cted to sequ en ce an a lys is .T h e resu lt sh ow ed th a t th is fra gm en t ’s len g th w as 553bp .T h ese sequ en ce s w e re p roved to sh are 98.55%h om o log y w ith th e sequ en ce repo r ted by B LA S T p rog raman d D N AM AN an a ly sis .W e clon ed T h e spe cia l p rom o ter te sted w ith Pch sA i n d ica ted th a t it con ta in ed th e n ece ssa ry ad j u stm en t an d con tro l factor o f a p ro m o ter and its sequ en ce w a s s i m ila r w ithth e repo r ted resu lt .[C on clu sion ]T h e prom o te r-CH SA w as su cce ss fu lly clon ed an d th e expre ssion ve cto r ,w h ich cou ld be u sed in g en e tran s fo rm a tion,w a s con stru cted a fte r it w as com b in ed w ith F 3′5′H so th a t th e ba sis o f n ew co lou r i n g v ar ie ty -b reed i n g w as la id .K e y w o rd s Pe tun ia hy brida ;PchsA prom o te r ;C lon e ;F 3′5′H gen e ;E xp ression ve cto r基金项目 新疆生产建设兵团重大科技攻关项目(2006GG 20);新疆生产建设兵团科技攻关项目(2006GG 03);兵团博士资金“转基因棉花杂交棉育种技术新体系的建立”项目。
矮牵牛同源三倍体种质创制及减数分裂观察
矮牵牛同源三倍体种质创制及减数分裂观察一、矮牵牛同源三倍体种质创制同源三倍体是指一个细胞拥有三套相似的染色体组，通常由两个同源染色体的杂交产生。
在植物育种过程中，同源三倍体种质通常具有更高的育种价值，因为它们具有更好的抗逆性和适应性。
矮牵牛同源三倍体的创制成为了研究人员关注的重点之一。
矮牵牛同源三倍体种质的创制通常通过雄性不育线和雄性不育剂的配合利用来实现。
选取具有较高不育性的亲本植株作为亲本，再通过人工授粉的方式，将不育系的花粉施加在雌蕊上，使其进行杂交。
随后，将杂交后的种子进行播种和育苗，筛选出植株的同源三倍体，并进行延续培养。
在同源三倍体的育种过程中，除了要进行同源三倍体的创制外，还需要对植株进行不断的遗传选育，以获得更好的品质和产量。
通过对同源三倍体的遗传性状进行评价和筛选，可以最大程度地发挥其优势，为矮牵牛的种质创制提供重要的理论依据和技术支持。
二、矮牵牛减数分裂观察减数分裂是生物体进行生殖细胞形成时的一种特殊的细胞分裂方式，它发生在生物的生殖器官中，通过减数分裂，生物体能够产生出具有不同遗传特性的生殖细胞。
而矮牵牛减数分裂观察则是为了更好地了解矮牵牛的生殖特性和遗传规律。
在进行矮牵牛减数分裂观察时，可以选择不同的生长发育阶段的花蕾进行观察。
要对花蕾进行解剖切片，然后使用差显微镜或荧光显微镜对细胞进行观察和记录。
通过观察细胞的形态、染色体的数量和排列情况，可以了解矮牵牛的雌、雄配子体形成过程，进而推断出其遗传规律和遗传特性。
研究人员还可以利用细胞学和遗传学的方法，对矮牵牛的减数分裂进行深入的研究。
通过比较不同类型的矮牵牛植株的减数分裂过程，可以发现可能存在的异常现象和变异情况，为矮牵牛的种质创制和遗传改良提供重要的参考和依据。
矮牵牛同源三倍体种质创制及减数分裂观察是为了更好地了解矮牵牛的遗传特性和生殖规律，为矮牵牛的育种和种质改良提供理论和技术支持。
通过对矮牵牛的同源三倍体的创制和减数分裂的深入研究，可以推动矮牵牛育种技术的进步，为矮牵牛品种的创制和推广提供更好的理论和实践基础。