单克隆抗体制备融合方法
单克隆抗体制备流程图
单抗制备流程1975年,Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体,又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术.这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。
制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。
一、细胞融合前准备（一) 免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。
一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定.1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。
下面以细胞性抗原为例的免疫方案:初次免疫1×10７／0.5ml ip （腹腔内注射)↓2～3周后第二次免疫1×10７／0。
5ml ip↓3周后加强免疫（融合前三天）1×10７／0.5ml ip或iv（静脉内注射）↓取脾融合2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂,常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂.要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。
商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇,使沉淀的分枝杆菌充分混匀。
初次免疫 Ag 1~50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射│(一般0.8～1ml 0.2ml／点)↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip│(ip剂量不宜超过0.5ml)↓3周后第三次免疫剂量同上，不加佐剂,ip│（5～7天后采血测其效价,检测免疫效果）↓2～3周后加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv↓3天后取脾融合目前,用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性,另一方面可降低抗原的使用量。
单克隆抗体制备之细胞融合
单克隆抗体制备之细胞融合细胞融合：⼴义上的细胞融合指两个或者多个细胞的原⽣质体融合形成⼀个杂种细胞的过程。
⼴义上的细胞融合可以是同种属的细胞发⽣，也可以是不同种属的细胞发⽣。
在单抗制备过程中的细胞融合专指瘤细胞与脾细胞的融合。
在介绍融合技术之前，有必要先了解⼀下⾻髓瘤细胞。
⾻髓瘤细胞的选择在前⾯概述部份就讲到，为了便于筛选出成功融合的杂交瘤细胞，需要选择DNA合成主要途径缺陷型的⾻髓瘤细胞（HGPRT-或TK-）与脾细胞融合，通常是HGPRT-的⾻髓瘤细胞。
要得到这种细胞需要做两件事，第⼀是得到⾻髓瘤细胞，第⼆步是诱导和筛选出HGPRT-的⾻髓瘤细胞。
⼀般可以通过向⼩⿏腹腔内注射碳氢化合物、⽯蜡或者油类物质⽽诱发其产⽣⾻髓瘤细胞，通常的做法是注射降植烷（Pristane，⼜称姥鲛烷）。
诱导出⾻髓瘤后，在⽆菌条件下取出此⾻髓瘤，⽤完全培养基培养⼀段时间后，再⽤8-氮杂鸟嘌呤或者5-溴脱氧尿嘧啶核苷酸进⾏筛选即可得到HGPRT-的⾻髓瘤细胞。
对于第⼀步的诱导过程，⽬前只有BALB/C和N2B品系的⼩⿏才具有⾼度的敏感性。
⽬前最常⽤的⾻髓瘤是来⾃BALB/C⼩⿏的，为了减⼩远亲属种系之间的排斥反应，单抗制备中⽤来免疫的动物品系应该与⾻髓瘤来源的品系相同。
1972年，Potter第⼀次从Balb/C⼩⿏中分离⾻髓瘤细胞株MOPC,第⼀次⽤于脾细胞融合的⾻髓瘤细胞株为P3-X63-Ag8,简称X63或P3，它由Milstain 实验室将P3K(源⾃MOPC)细胞系经8-Aza筛选得到。
X63⾃⾝不能分泌完整的免疫球蛋⽩，但是可以合成并分泌γ1重链和κ轻链，因此如果⽤X63⾻髓瘤细胞与脾脏融合，得到的融合细胞除分泌脾细胞的抗体外，还可以分泌X63的γ1链和κ链。
后来⼜从P3K细胞系选育出另⼀变种P3-NS1-Ag4-1,简称NS-1,它不能合成γ1重链，能合成κ轻链，但是合成之后在细胞内降解⽽不能被分泌出来。
单克隆抗体制备流程图
单抗制备流程1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。
这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。
制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。
一、细胞融合前准备(一) 免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。
一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
.1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。
下面以细胞性抗原为例的免疫方案:初次免疫1×10７／ ip (腹腔内注射)↓2～3周后第二次免疫1×10７／ ip↓3周后\加强免疫(融合前三天) 1×10７／ ip或iv(静脉内注射)↓取脾融合2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。
要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。
商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。
初次免疫 Ag 1～50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射│(一般～1ml ／点)^↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip│(ip剂量不宜超过↓3周后第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip}│ (5～7天后采血测其效价，检测免疫效果)↓2～3周后加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv↓3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。
3.细胞融合及单克隆抗体的制备
恶性增殖的转化细胞，只要营养条件
适合可永远分裂和存活——长命细胞。
经筛选与驯化，现已建立多种骨髓瘤 细胞株——没有抗体分泌物。
2. 细胞融合技术：
分泌抗体 短命 脾细胞 (B淋巴细胞) 长命 不分泌抗体 骨髓瘤细 胞 分泌抗体 长命 杂交瘤细 胞
Köhler和Milstein, 1975
1984年Nobel医学奖
外源性途径(旁路途径)
谷氨酰胺 or 单磷酸尿苷酸
二氢叶酸还原酶
A
DNA
T
内源性途径(主要途径) 外源性途径(旁路途径) 胸腺嘧啶激酶 ( TK ) (Thymidine kinase)
B淋巴细胞： HGPRT+， TK+ 骨髓瘤细胞： HGPRT-， TK-
存活
死亡
单克隆抗体技术操作流程
目的：
触1分钟；
（4）加9ml 培养液，离心沉淀，吸去上清液； （5）加5ml 培养液，分别接种5个直径60mm平皿，每个 平皿加培养液至 5ml，37℃的CO2培养箱中培养。 （6）6—24小时后，换成选择培养液筛选杂交细胞。
电融合法
电融合法是80年代出现的细胞融合技术，在直流电 脉冲的诱导下，细胞膜表面的氧化还原电位发生改变， 使异种细胞粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连 接，直到闭和成完整的膜，形成融合体。
150ul/孔 A、B
+3.6ml M
2个cell/孔 1个cell/孔
150ul/孔 C、D
+3.6ml M
150ul/孔 E、F、 G、H
0.5个cell/孔
6.杂交瘤细胞的鉴定
染 色 体 核 型 分 析
大规模培养——批量生产单克隆抗体
单克隆抗体制备
单克隆抗体制备1. 免疫动物：三只Balb/c小鼠2. 佐剂：首先用完全弗氏佐剂（CFA），后用不完全弗氏佐剂（IFA）。
3. 免疫原：蛋白或KLH偶联多肽。
每次免疫使用50-100µg免疫原。
4. 免疫：用PBS稀释免疫原，然后与相应的佐剂1：1混合。
抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂在小鼠双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后腿进行肌肉注射。
每个区域大约用1/8的免疫原。
接着将1/2的免疫原进行腹腔注射，这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。
以后每个星期进行腹腔注射直到达到要求的效价。
5. 第0星期预采血完全弗氏佐剂（CFA）混合的100µg抗原免疫小鼠。
第2星期完全弗氏佐剂（CFA）混合的50µg抗原免疫小鼠。
第3星期不完全弗氏佐剂（IFA）混合的50µg抗原免疫小鼠。
第4星期溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
第5星期取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测，溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
第X星期取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测，溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
6. 杂交瘤融合和筛选：用PEG方法将效价最好的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞F0进行融合。
用抗原对融合的杂交瘤克隆进行筛选，检测它们的特异性和敏感性。
ELI SA阳性的克隆可用WB检测，筛选出来的克隆至少还需要亚克隆两次。
7. 大规模抗体生产：筛选得到两个克隆最后进行大规模培养（每个克隆1L）或者取腹水（每个克隆5只小鼠）。
用蛋白A/G对培养液或腹水进行纯化，平均每个克隆可以得到3-5mg 抗体。
8. 注意：每个融合平均可以得到900多个克隆，对于多肽抗原可以得到100个左右的ELISA阳性克隆，重组蛋白抗原可以得到100-150个ELISA阳性克隆。
亚克隆实验做的越早，越容易保存克隆。
因此，为了保存和复苏阳性克隆，尽早进行筛选检测是必需的。
单克隆抗体制备实验步骤
单克隆抗体制备实验步骤
嘿，咱今儿就来唠唠单克隆抗体制备实验这档子事儿哈！
首先呢，得选个好苗子，就像咱挑水果得挑个水灵的，这就是要选对细胞啦。
把咱要的免疫细胞找出来，这可是关键的第一步哟！
然后呢，把这些小家伙放到合适的环境里，让它们好好长。
就好比给花浇水施肥，得让它们茁壮成长呀。
接着呀，得让这些细胞和骨髓瘤细胞来个亲密接触，这就像一场特别的相亲会，得找到最合适的那一对。
这可不是随便凑凑就行的，得精心挑选呢。
之后呢，把它们放在一块儿培养，看着它们融合在一起，就好像看到了新的希望诞生啦。
再然后，就得筛选啦！把那些不符合要求的淘汰掉，留下最棒的融合细胞。
这就像选秀比赛，只有最出色的才能留下来。
接下来，把这些选出来的宝贝们放到合适的地方继续培养，给它们提供最好的条件，让它们不断繁殖。
再往后，还得检测检测它们的能力呢，看看是不是真的厉害。
这就像考试，得检验一下真本事。
等确定了它们确实是我们想要的，那就可以大量生产啦！就像工厂生产产品一样，源源不断地制造出我们需要的单克隆抗体。
你想想，这过程多像培育一个小生命呀，从最开始的挑选，到精心呵护，再到筛选出最优秀的，最后让它发挥大作用。
这单克隆抗体制备实验可不简单，但要是做好了，那可真是了不起呀！它能帮我们解决好多难题呢，在医学、生物学等好多领域都大有用处。
所以呀，可别小瞧了这一系列步骤，每一步都得认真对待，就像对待一件珍贵的宝贝一样。
咱得有耐心，有细心，才能让这个实验成功呀！大家都加油吧，让我们一起在单克隆抗体制备实验的道路上越走越远，创造出更多的奇迹！怎么样，是不是觉得很有意思呀？。
单克隆抗体技术路线
单克隆抗体技术路线引言：单克隆抗体技术是一种重要的生物医学研究方法，也是生物制药领域的重要工具。
本文将介绍单克隆抗体技术的基本原理、制备步骤以及应用领域，以帮助读者更好地了解和应用这一技术。
一、单克隆抗体技术的基本原理单克隆抗体技术是一种通过克隆单个抗体细胞，制备具有相同抗原结合特异性的抗体的方法。
其主要原理是将抗原注射到实验动物体内，激发机体产生免疫应答，然后采集动物体内的B细胞，融合B 细胞与骨髓瘤细胞，形成杂交瘤细胞，最后通过筛选获得特异性抗原结合能力的单克隆抗体。
二、单克隆抗体制备步骤1. 免疫原选择：选择合适的免疫原，通常为纯化的蛋白质或多肽。
2. 免疫程序：将免疫原注射到实验动物体内，激发免疫应答。
3. B细胞采集：从免疫动物体内采集脾细胞或淋巴结细胞，富集含有目标抗体的B细胞。
4. 杂交瘤细胞制备：将采集到的B细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。
5. 杂交瘤细胞筛选：通过限制性稀释法或酶标记法等方法，筛选出分泌特异性抗原结合能力的杂交瘤细胞。
6. 单克隆抗体生产：将筛选出的杂交瘤细胞进行扩增培养，收集培养上清液，纯化得到单克隆抗体。
三、单克隆抗体技术的应用领域1. 生物学研究：单克隆抗体可用于特定分子或细胞的定位和鉴定，帮助研究者了解生物体内的生物过程和机制。
2. 临床诊断：单克隆抗体可用于检测和诊断疾病，如癌症、感染性疾病和自身免疫性疾病等。
3. 治疗应用：单克隆抗体可用于治疗某些疾病，如肿瘤、免疫性疾病和传染病等，具有较高的治疗效果和较低的副作用。
4. 生物制药：单克隆抗体作为生物制药领域的重要工具，可用于药物研发、质量控制和生产等方面。
结论：单克隆抗体技术是一种重要的生物医学研究方法和生物制药工具，其制备步骤简单明了，应用领域广泛。
随着技术的不断发展和完善，单克隆抗体技术在生物医学领域将发挥越来越重要的作用，为疾病的诊断和治疗提供更多的选择和可能。
相信随着对单克隆抗体技术的深入研究和应用，必将为人类健康事业作出更大贡献。
抗cd19单克隆抗体及其制备方法与应用
抗CD19单克隆抗体及其制备方法与应用1. 抗CD19单克隆抗体概述在免疫疗法领域，抗CD19单克隆抗体被广泛应用于治疗B细胞相关的疾病，尤其是B细胞恶性肿瘤和自身免疫疾病。
CD19是B细胞表面的一种标志性蛋白，它在B细胞的发育、激活和功能中扮演重要角色。
抗CD19单克隆抗体可以选择性地杀伤CD19阳性的B细胞，而对其他细胞几乎没有影响，从而成为治疗B细胞相关疾病的有效手段。
2. 抗CD19单克隆抗体的制备方法抗CD19单克隆抗体的制备主要通过以下步骤实现：1.免疫原：首先需要获得CD19的免疫原，常见的方法包括从CD19表达的细胞中提取膜蛋白或人工合成片段。
2.免疫动物：将免疫原注射到小鼠或大鼠等实验动物体内，触发其免疫系统产生抗CD19抗体。
3.融合细胞：从免疫动物中获取B细胞，并将其与瘤细胞或其它细胞融合，形成杂交瘤细胞，这些细胞能够不断产生具有特异性的抗CD19抗体。
4.提取与纯化：从培养基中提取并纯化目标抗体，经过一系列的纯化步骤，最终得到高纯度的抗CD19单克隆抗体。
3. 抗CD19单克隆抗体的临床应用抗CD19单克隆抗体作为治疗B细胞相关疾病的新战略，已在临床上取得了显著的成果。
以CAR-T细胞疗法为代表的治疗手段，就是通过将患者自身的T细胞进行基因改造，使其表达抗CD19单克隆抗体，从而实现对恶性B细胞的杀伤。
在自身免疫疾病的治疗中，抗CD19单克隆抗体也展现出了良好的疗效。
通过选择性地清除异常活化的B细胞，可以有效地控制自身免疫疾病的发作和进展。
4. 个人观点和理解抗CD19单克隆抗体作为一种新型的免疫治疗药物，不仅在临床上展现出了显著的疗效，而且为免疫疗法领域带来了新的活力和希望。
在未来，随着对其作用机制和临床应用的进一步深入研究，相信抗CD19单克隆抗体会在更多疾病的治疗中发挥重要作用，并为患者带来更好的治疗效果。
结语通过对抗CD19单克隆抗体的概述、制备方法和临床应用的全面探讨，我们对其在治疗B细胞相关疾病中的重要作用有了更深入的理解。