全内反射荧光显微镜用途
全内反射荧光显微镜概述
3. 物镜型光学成像系统中物镜
由于细胞的典型折射率为1.33~1.38，因此要实现全内 反射，在物镜型全内反射荧光成像系统中物镜的数值 孔径（NA）必须大于1.38。 当物镜数值孔径为1.4时，只有很小的一部分数值孔径 范围（1.4-1.38=0.02）被利用，入射角可调节范围 （最大孔径角与全内反射角的差值）很小，光束校准 比较难，同时光束的强度也很难提高。若使用数值孔 径为1.65的物镜，则有一个大的多的孔径范围（1.651.38=0.27）可以被利用，则入射角可调节范围变大， 降低了操作难度。高数值孔径的物镜的使用是物镜型 全内反射荧光成像系统的关键。
全内反射
全内反射是一种普遍存在的光学现象。 考虑一束平面光波从折射率为n1的介质进入到折射 率为n2的介质中。入射光在表面上一部分发生反射， 另一部分则发生透射。入射角θ1和透射角θ2之间满 足关系式n1sinθ1=n2sinθ2 当n1大于n2时，全反射就可能发生:即所有的入射光 线全部反射出来,称为全内反射。
2.2 物镜型
而在物镜型成像系统中，显微镜的物镜既是发生全内反射的 光学器件，又是样品荧光信号的收集器。其优点是样品的大 小没有棱镜的限制，样品的放置非常方便，并且由于样品远 离物镜而可以与多种其他技术相结合，例如微操作，微分干 涉成像系统，光镊技术，扫描探针显微术等等，因而相对于 棱镜型展现出更加广阔的生物应用前景。
2.1棱镜型
棱镜型利用激光经过棱镜并产生全内反射，其隐失波照射已 被荧光标记的生物样品，其激发光从另一侧进入物镜并被 CCD相机捕捉。棱镜作为发生全内反射的光学器件。物镜只 是作为荧光信号收集器。在探测上，它也不容易受到入射光 的干扰。缺点是放置样品的空间位于棱镜和盖玻片之间，所 以样品大小和样品的放置受到限制。
全内反射荧光显微镜TIRFM介绍介绍
• 钙离子通道实时监测
(w/ High Speed Camera) – Using Ca-green / M. Morad
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Dr. S. Simon, J. Schmoranzer / Rockefeller Univ. Dr. Axelrod / Univ. of Michigan
全内反射荧光显微镜系统
Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRFM)
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优 势
劣 势
・ 只能观察盖波片 和细胞膜 ・非实时动态 表面 ・ 信噪比没有 TIRFM 高
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全内反射应用
• 细胞表面观察
– D. Axelrod – Cell/Substrate Contact / W. Reichert
安装简单 可用于膜片钳实验 物镜数值孔径受限制
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全内反射照明的切换
宽场荧光照明
盖波片
物镜
激光
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荧光 —— 全球首次引入离子镀膜技术 “最明亮的荧光显微镜”
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全内反射荧光显微镜 - 北京大学单分子与纳米生物学实验室
当一束平面光波从折射率为n1的介质进入到折射率为n2的介质中
消逝波----全内反射荧光镜的关键所在
消逝波 消逝场(evanescent field)
荧光消逝波 θ2=90° θc=sin-1(n2/n1)
全内反射的仪器组成
全内反射荧光显微成像系统
棱镜型
物镜型
成像系统的消逝场 是通过入射光经棱 镜发生全反射产生 的
基本概念
Title 全内反射荧光显微术：
Title 数值孔径：
全内反射荧光显微术：
全内反射荧光显微术是利用全内反射产 生的消逝波来照射样品，从而致使在样 品表面数百纳米级厚度的光学薄层内的 荧光团受到激发，使单分子成像。
数值孔径：
数值孔径又叫做镜口率，简写为N.A。它是 由物体与物镜间媒质的折射率n与物镜孔径 角的一半（a\2）的正弦值的乘积，其大小 由下式决定：N.A=n×sin a/2
全内反射荧光技术发展历程
1965年
Hirsch field 完成了第一个 全内反射荧光 实验
1995年
Yanagida小 组用TIRFM技 术首次在液体 溶液中得到了 荧光标记的单 个蛋白质分子 的成像.
1996年
Moerner小 组又用这项技 术实现了限制 在丙烯酰胺胶 体的纳米孔中 的单分子的三 维成像。
层析深度分别为～ 500nm～800nm , 而全内反 射显微术典型的垂直照明深度<100nm。这么 薄的光学层析层切片意味着信噪比 比共焦系统 好得多, 细胞的光损伤和光漂白也很小。
全内反射荧光显微镜优点：
1：信噪比高 2：分辨率高 3：对生物样本损伤小
与共焦技术相比, 单光子或双光子的共焦系统层 析深度分别为～ 500nm～800nm , 而全内反射显 微术典型的垂直照明深度<100nm。这么薄的光 学层析层切片意味着信噪比 比共焦系统好得多, 细胞的光损伤和光漂白也很小。
全内反射荧光显微术名词解释
全内反射荧光显微术名词解释全内反射荧光显微术，听起来就像是从科幻电影里蹦出来的名词，是吧？其实它可是一种非常酷炫的显微镜技术，能让我们看到那些微小得像针尖一样的细胞和分子。
想象一下，把光线像小箭一样射向样品，当光线以一定的角度入射，嘿，光线就不再穿透，而是在界面上反射回来，这就是全内反射的魔法！这时候，样品里的荧光分子会被激发，发出闪闪的光芒，简直就像夜空中的繁星，令人心醉。
用这个技术，科学家们可以观察生物样品，像细胞膜、蛋白质等。
大家知道细胞是生命的基本单位，对吧？而这些微小的结构可不是轻易就能看清的，普通显微镜就像是用放大镜看远处的星星，模糊得很。
全内反射荧光显微术却像是把宇航员送到了太空，直接给你展示了细胞内部的每一个角落，真是让人眼前一亮。
这项技术的魅力在于，能在活细胞中进行观察。
别小看这一点，很多传统的显微镜技术可得把细胞弄得死去活来才能看清。
可是全内反射荧光显微术却让我们能够在“现场”观察，活生生的细胞在做什么，简直就像在看一场精彩的真人秀！你可以看到细胞的动态变化、分裂过程，甚至是它们如何和周围的环境互动，这些都是生命中最微妙的瞬间。
说到荧光，这里有个小秘密。
荧光分子就像是小小的发光棒，只有当它们被特定波长的光激发时，才会闪耀出美丽的光芒。
像小孩子玩耍一样，开心得不得了。
这种现象让我们能够区分不同的细胞，甚至标记特定的蛋白质，形成色彩斑斓的图像。
这些图像比任何油画都要生动，简直就是生命的艺术品。
想想看，科学家们在显微镜下能看到的那些细胞，像极了微缩版的城市，热闹非凡。
全内反射荧光显微术也让我们在医学研究中大放异彩。
比如在癌症研究中，科学家们通过观察癌细胞的特征，发现它们是如何突破正常细胞的防线，蔓延到其他地方的。
这种技术帮助我们了解疾病的根本，寻找更有效的治疗方案。
感觉像是在揭开一个个神秘的面纱，让我们看清楚那些潜藏在暗处的真相。
操作全内反射荧光显微术可不是随便拍拍的事。
它需要一套精密的设备和技术，像调整光路、选择激发波长，这些都得小心翼翼。
全内反射荧光显微镜90613113
TIRFM的发展历程
❖ 上世纪80年代初，Axelrod和Daniel等生物 物理学家对TRIFM技术及基本原理进行描述， 他们利用TIRFM对荧光脂质标记的人类皮肤 成纤维细胞的细胞-基膜连接进行了研究，另 外几乎是在同一时间，科学家也通过TIRFM 和FRAP(荧光漂白恢复技术)的结合使用对生 物分子表面的动力学进行了研究。
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TIRFM的发展历程
❖ 上世纪90年代初，随着新型物镜透镜、聚光 镜和超灵敏探测器的出现，使TRIFM技术得 到充分发展。
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TIRFM的发展历程
❖ 1995年，Yanagida等人第一次用TIRFM技术， 将单位时间（秒）单位区域（以一个衍射极 限面积为单位，微米级别）内的背景信号降 低到3个光子，在液体溶液中得到了荧光标记 的单个肌动球蛋白质分子的成像，并且探测 到了单个ATP酶的翻转反应。从此TIRFM开 始广泛应用于单分子的成像研究。
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传统光学显微镜在生物样本显微方面 的缺点
❖ 信噪比不高，分辨率不高，同时光学显微镜 有空间分辨极限，约为250 nm。从生物学应 用的角度，传统的光学显微镜显然无法满足 更高的空间分辨率要求，并且研究过程中需 要破碎细胞或对细胞造成损伤，无法做到在 活细胞生理条件下实时地对细胞内蛋白质-蛋 白质间相互作用进行动态研究。
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TIRFM的发展历程
❖ 21世纪以来，全内反射荧光法的方法多种多 样，包括时间分辨全内反射荧光、多重内反 射荧光和全内反射荧光相关光谱等方法。它 研究的内容也很广泛，包括观察表面分子或 近表面分子的取向、旋转和荧光寿命，肌球 蛋白酶活性测量，单个蛋白分子对之间的荧 光共振能量转移，基因芯片荧光检测等等。
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物镜型TIRFM系统
各荧光检测方法简介(流式、荧光显微镜、共聚焦、全内反射与双光
各荧光检测方法简介（流式、荧光显微镜、共聚焦、全内反射与双光很多细胞实验都要检测荧光，为方便大家选择合适的方法，在此简单说一下各种荧光检测方法的特点。
不足的地方，欢迎大家补充：1、流式，优点是速度快，非常适合做大数量统计，且样品只被检测一次，完全不用担心荧光淬灭的问题。
缺点是只能检测荧光的有无、强度大小，无法提供空间定位信息，无法做荧光定位变化的实验；由于样品只被检测一次，因此无法对同一个样品进行连续观察。
例如，做膜蛋白定位时会得到这么一个结果——用流式可以检测出信号，但是用显微镜却看不到东西，排除仪器和滤光片选择问题，很可能是核的自发荧光或非特异标记造成流式的假阳性结果。
2、荧光显微镜，刚好与流式互补，可很好地进行空间观察，判断目标蛋白的定位，但是不适合做大流量检测，估计没人能经得起时间的考验。
有不同倍率的物镜选择，可以使用高倍物镜看精细结构，或用小倍率物镜做少量统计。
与之搭配的CCD和软件，是系统能否发挥性能的关键。
尤其是CCD，从那么多商品里选一款合适的不容易，需要了解很多知识否则只能听别人忽悠。
3、共聚焦，荧光显微镜的升级产品，具有很好的光学层切效果，能得到很好三维定位信息。
但是，如果使用共聚焦的目的仅仅是为你的样品拍一张靓照，取得一张好看的图片，就让人觉得可惜了。
共聚焦基本都是全自动系统，可随意定义照明区域、选择多个荧光通路和设定定时取图，所以，做Time-laps、FRAP和FRET有其独到的优势。
另外，4Pi和 STED又是其中的极品，具有超高的空间分辨率，只是使用不方便，未必适合做生物实验。
4、全内反射，荧光显微镜的另一种升级产品，属于近场光学范畴，只适合且最适合做膜研究，无法看到胞内信息。
也是用CCD成像，但是对CCD的要求更高——个人甚至觉得对CCD的要求是没有上限的。
5、双光子，另一种共聚焦，因使用长波激发荧光，故能做深层检测（突破共聚焦的100微米极限），最典型的应用是观察活体脑组织。
tirf显微镜原理
tirf显微镜原理简介：TIRF（Total Internal Reflection Fluorescence，全内反射荧光显微镜）是一种用于研究界面和薄膜附近的生物发光过程的高分辨率显微镜技术。
本文将解析TIRF显微镜的原理，包括全内反射现象、波导耦合和荧光检测等方面，帮助读者深入了解这种重要的显微镜技术。
正文：1. 全内反射现象TIRF显微镜利用全内反射现象实现高分辨率成像。
当光束从高折射率的材料（例如玻璃）射入到低折射率的材料（例如溶液）时，当入射角大于临界角时，光束将完全反射，不进入低折射率材料。
2. 波导耦合TIRF显微镜利用光波在玻璃和样品之间发生全内反射来实现荧光成像。
一种常用的方法是通过特殊设计的金属或玻璃叫做波导，将激光束耦合到玻璃和样品的边界上。
波导保证了光束以全内反射的方式沿界面传播，通过控制波导与样品之间的接触面积，可以使激光束只在非常薄的区域内与样品相互作用，实现高分辨率荧光成像。
3. 荧光检测TIRF显微镜利用荧光探针标记的样品发出的荧光信号来进行观察。
在TIRF成像中，仅有与表面接触的荧光染料将被激发并发射荧光。
未被激发的荧光将不被收集，从而有效地减少了背景信号的干扰，提高了信噪比和成像的分辨率。
4. 超分辨率成像TIRF显微镜在满足一定条件下能够实现超分辨率成像。
通过控制入射角度、荧光染料的位置和波导耦合等参数，可以限制荧光激发区域的大小，使得成像分辨率超越传统荧光显微镜的衍射极限，实现更高的空间分辨率。
5. 应用TIRF显微镜广泛应用于生物科学的研究领域，特别是细胞和分子生物学。
通过观察细胞膜和介观尺度结构之间的相互作用、细胞内分子交互作用以及染料的分子动力学等，TIRF显微镜为研究生命科学中的各种现象和过程提供了高分辨率的实时成像手段。
总结：TIRF显微镜利用全内反射现象和波导耦合技术，实现了高分辨率的成像和荧光检测。
通过限制光激发区域和减少背景干扰，TIRF显微镜能够提供超过传统荧光显微镜的分辨率。
简述全内反射荧光显微术的原理和应用
全内反射荧光显微术原理与应用1. 引言全内反射荧光显微术（Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy，TIRFM）是一种基于全内反射原理的显微技术，利用全内反射限制激光光束的传播范围，使其仅激发样品表面附近的荧光染料，并通过荧光显微镜观察和记录表面附近的高分辨荧光信号。
该技术具有高灵敏度、高空间分辨率和实时监测能力等优点，广泛应用于生命科学研究中。
本文将详细介绍TIRFM的原理和应用。
2. 全内反射原理光在由一个折射率较大的介质（如光具）射入折射率较小的介质（如空气）时，当入射光线的入射角大于一个特定的临界角时，光线将会完全发生反射，不再穿透进入折射率较小的介质中。
这个现象被称为全内反射（Total Internal Reflection，TIR）。
当一个光束从高折射率的物质射入低折射率的物质时，入射角大于临界角时，发生全内反射。
通过调控入射角，可以使光线沿着介面传播，从而形成衰减系数很小的光束。
这个现象可以被用来实现TIRFM的照明光路。
3. 全内反射荧光显微术系统TIRFM系统主要由以下几个部分组成：激光光源、调制器、目标镜、物镜、荧光滤光片、成像系统和数据采集分析系统等。
激光光源：一般使用高功率激光器，如氩离子激光器或二极管激光器。
激光通过光纤输入到光路系统中。
调制器：用于控制激光的工作模式，常用的包括振荡镜或振荡腔。
目标镜：一般是具有高折射率的玻璃片或光具，用于实现全内反射，常用的目标镜材料有石英、玻璃等。
物镜：用于聚焦激光到样品表面，并收集荧光信号。
物镜的选择要考虑到激光的聚焦效果和空间分辨率。
荧光滤光片：用于选择性地阻挡激发光和透射荧光信号。
成像系统：一般是荧光显微镜或全内反射显微镜。
能够观察并记录样品表面的荧光信号。
数据采集分析系统：可以对观察到的荧光图像进行实时处理和分析，如图像增强、图像叠加、荧光强度计算等。
4. TIRFM原理TIRFM的原理可以通过以下步骤进行解释：1.激光从物镜聚焦到样品表面。
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全内反射荧光显微镜用途
全内反射荧光显微镜，是一种高级显微镜技术，通过结合荧光技术和反射技术，使得观察样品更加清晰和准确。
该显微镜具有广泛的应用领域，特别是在细胞生物学、生物医学研究和材料科学等领域中发挥着重要作用。
全内反射荧光显微镜的主要用途之一是观察和研究细胞和组织的结构与功能。
通过标记荧光染料或荧光蛋白，可以使细胞内的特定结构或分子呈现出明亮的荧光信号。
这种显微镜技术可以用于观察细胞核、细胞器、细胞膜以及细胞内的信号传导通路等。
通过全内反射荧光显微镜的高分辨率成像能力，科研人员可以更加准确地研究细胞的形态、结构和功能，进一步揭示生物学过程的机制。
全内反射荧光显微镜还在生物医学研究中发挥着重要作用。
例如，在癌症研究中，科学家可以利用该显微镜观察和分析癌细胞的形态、活动和功能，进而研究癌症的发生机制和治疗策略。
此外，全内反射荧光显微镜还可以用于观察细菌、病毒等微生物的行为，帮助科学家研究它们的生长、传播和致病机制。
在材料科学领域，全内反射荧光显微镜也被广泛应用。
由于该显微镜具有高灵敏度和高分辨率的特点，可以用于研究材料的表面和界面性质，例如薄膜的生长、表面化学反应以及材料中颗粒的分布情况等。
此外，该技术还可以用于研究材料的光学性质和电子性质等，
为材料设计和制备提供重要的参考。
除了以上应用领域，全内反射荧光显微镜还可以在其他领域中发挥作用。
例如，在环境科学领域，可以利用该技术研究水体和土壤中微生物的分布和活动情况，进而了解生态系统的功能和稳定性。
在食品科学中，可以利用全内反射荧光显微镜观察食品中的微生物污染情况，保障食品的安全性。
在纳米技术领域，该技术可以用于研究纳米材料的光学、电子和磁性等性质，为纳米器件的设计和制备提供重要的信息。
全内反射荧光显微镜具有广泛的应用领域，在细胞生物学、生物医学研究和材料科学等领域中发挥着重要作用。
通过该技术，科研人员可以观察和研究细胞和组织的结构与功能，揭示生物学过程的机制；在生物医学研究中，可以帮助科学家研究疾病的发生机制和治疗策略；在材料科学中，可以用于研究材料的表面和界面性质，提供重要的参考。
全内反射荧光显微镜的不断发展和改进，将进一步推动科学研究的进展，为人类社会的发展做出更大的贡献。