荧光显微镜的基本原理及应用
荧光显微镜的原理和应用
荧光显微镜的原理和应用1. 原理1.1 荧光的基本原理•荧光是一种由物质吸收能量而产生的特殊形式的发光现象。
•荧光分为荧光激发和荧光发射两个过程。
•在荧光激发过程中，物质吸收光子能量，并将电子从基态激发到激发态。
•在荧光发射过程中，激发态电子从高能级跃迁至低能级，放出能量并发射荧光光子。
1.2 荧光显微镜的构成荧光显微镜由以下部分组成：•激发光源：通常使用荧光灯或激光器作为激发光源，激发样品发出荧光。
•滤光器：用于选择合适的波长以激发样品，并屏蔽其他波长的光。
•物镜：用于聚焦激发光和荧光光。
•感光器件：用于检测和记录荧光光。
•显示器或相机：用于显示和记录荧光图像。
2. 应用荧光显微镜广泛应用于生物医学领域和材料科学领域中的研究和实践。
2.1 生命科学研究•细胞和组织成像：荧光显微镜可以用于观察活体细胞和组织的形态、结构和功能。
通过标记特定蛋白质或染料，可以研究细胞生理、细胞信号传导、细胞分裂等过程。
•药物研发：荧光显微镜可以用于药物的输送、靶向和释放的研究。
将药物标记荧光染料，可以追踪药物在细胞和组织中的分布和代谢。
•基因编辑：荧光显微镜可以用于观察基因编辑技术（如CRISPR-Cas9）的效果。
通过标记特定基因或DNA序列，可以追踪基因编辑的结果和效率。
2.2 材料科学研究•纳米材料研究：荧光显微镜可以用于观察和研究纳米材料的结构、形态和光学性质。
通过将纳米材料标记特定染料或荧光蛋白，可以研究纳米材料的生长、聚集和相互作用。
•薄膜研究：荧光显微镜可以用于观察和研究薄膜的表面形态和荧光特性。
通过标记特定染料或荧光分子，可以研究薄膜的结构、厚度和质量。
•光电器件研究：荧光显微镜可以用于观察和研究光电器件的结构和性能。
通过标记特定荧光染料或有机分子，可以研究光电器件的光学响应和电子传导。
3. 总结荧光显微镜以其独特的原理和广泛的应用领域在生物医学和材料科学研究中发挥着重要作用。
通过荧光显微镜的使用，研究人员能够观察并了解细胞、组织和材料的结构、形态和功能。
荧光显微镜的基本原理及应用PPT课件
未来荧光显微镜的发展将更加注重个性化定制，根据不同 领域和不同需求，定制特定的光学系统和成像方案，以满 足不同用户的需求。
06 参考文献
参考文献
参考文献1
介绍荧光显微镜的基本原 理，包括激发光、发射光 和滤色片的原理和作用。
参考文献2
介绍荧光显微镜的应用， 包括生物学、医学、化学 等领域的应用案例和效果。
荧光显微镜的基本原 理及应用ppt课件
目录
CONTENTS
• 荧光显微镜简介 • 荧光显微镜的基本原理 • 荧光显微镜的应用 • 荧光显微镜的优缺点 • 荧光显微镜的发展趋势与未来展望 • 参考文献
01 荧光显微镜简介
荧光显微镜的发展历程
01
02
03
荧光显微镜的起源
19世纪末，科学家开始研 究荧光现象，并尝试将其 应用于显微镜中。
多色观察
荧光显微镜可以同时观察多个 荧光标记物的表达，通过不同 的荧光颜色来区分不同的标记 物。
非破坏性
荧光显微镜观察样本时不会对 样本造成破坏，因此可以观察
同一样本的不同层面。
缺点
01
02
03
04
光毒性
荧光显微镜需要使用高强度光 源来激发荧光，长时间观察会
对样本造成光毒性损伤。
光漂白
荧光标记物在受到高强度激发 光照射时容易发生光漂白，导
环境化学
荧光显微镜用于检测环境中的有害物 质和污染物。例如，利用荧光标记的 探针检测水体中的重金属离子或有机 污染物。
04 荧光显微镜的优缺点
优点
高灵敏度
荧光显微镜能够检测到非常微 弱的荧光信号，因此可以用于
观察低浓度的荧光标记物。
高对比度
荧光显微镜能够通过选择合适 的激发和发射波长，获得高对 比度的荧光图像。
荧光显微镜的原理和使用方法
透射式荧光显微镜效果图
透射式荧光显微镜光路图
• 2．落射式荧光显微镜 ：这是近代发展起来的新 式荧光显微镜，与上不同处是激发光从物镜向下
落射到标本表面，即用同一物镜作为照明聚光器 和收集荧光的物镜(图2―6)。光路中需加上一个 双色束分离器，它与光铀呈45°角，激发光被反 射到物镜中，并聚集在样品上，样品所产生的荧
• 激发滤色镜加放于汞灯和二向色镜（dichotic mirror）之间，物镜之前。滤镜的型号不同，数量 较多，可按不同需要选用。
• 阻断滤色镜（barrier filter）:阻断滤色镜 位于物镜之上，二向色镜和目镜之间，用 以阻断或吸收光路中的激发光或某些波长 较短的光线，以防伤害眼睛，使荧光透过。 选用的原则，以能完全阻断或吸收波长短 于所需荧光的光线，并透过样品发出的荧 光。所以，阻断滤色镜的选用，应视荧光 染料的荧光光谱而定，以能最大限度地透 过荧光和阻断短波光。
• (2)光吸收器的组装：
• 反射式荧光装置无需聚光器，由一底部 封闭的圆筒状的光吸收器取代，用以吸收 射入的光线，防止四射。
• 组装方法：降下聚光器架，将光吸收器 插入楔形神内，固紧、回升最高位。
• (3)操作程序 • 转动镜臂旋转台，至相应的标志位。旋转台为
一圆盘状结构，上有5个定位标志：U、V、B、G、 O，分别代表不同的荧光激发方法及其不同的滤 色镜系统组合。 • 点亮汞灯，接通电源，按压启动器按钮，使汞 灯点亮。 • 将镜臂左侧的DIA转换钮调至EPI位。 • 确认汞灯点亮，照明系统正确，灯位调中，电 弧像聚焦准确。 • 用荧光染料染色的样品，放在载物台上，用 10×物镜聚焦。 • 孔径光阑的调整使用：光阑位于镜臂中，用外 露手杆操纵。在汞灯调中、聚焦时，光阑应全开。 荧光显微时，孔径应缩小，使之小于视场。
荧光显微镜原理及应用实验原理及步骤
实验三荧光显微镜原理及应用
一、实验原理：1852年 Stokens发现当以短波光照射某些物质时，这些物质就会发出较长的光波，称之为荧光。
当某一物质的外层电子接收到能量相当时的光量子后，这个电子就会从能级较低的电子层跃迁到能级较高的电子层（激发态），但激发态是不稳定的，大约经过10ˉ8秒，电子就会以辐射光量子的形式释放能量而回到原来的稳定状态，辐射的光量子就是光（如图），因为能量还有一部分是以热能的形式散发的，所以荧光光波比激发的光波长。
动物细胞内的大部分成分经激发光波激发后，可以发出淡蓝色的荧光，植物叶绿素等经激发光照射后发出血红色荧光。
这种现象称为自发式荧光，或直接荧光。
有些细胞成分与发荧光的有机物——荧光染料结合后，而具有发荧光发能力，这种荧光成为间接荧光或次生荧光。
除少数物质具有较强的自发荧光外，大多数细胞的自发荧光否很弱，不能满足实际工作的要求，现在比较广泛利用的是间接荧光，获得间接荧光的方法有两种：
[1].荧光染色法：利用荧光染料使细胞或组织着色，它和细胞内不同成分结合后可发出一定波长的荧光。
对于不同的组织或细胞组分，目前已成立了一些有效的荧光染色方法，如显示粘蛋白成分的荧光RAS反应显示类脂质磷化氢3R荧光染色法，显示染色体分带的Q带技术等，可选用不同的方法研究不同的细胞成分。
荧光显微镜工作原理
荧光显微镜工作原理荧光显微镜是一种利用荧光原理观察样品的显微镜。
它通过激发样品中的荧光物质，使其发出特定的荧光信号，然后通过光学系统放大和观察这些信号。
荧光显微镜常用于生物医学研究、细胞生物学和生物化学等领域。
荧光显微镜的工作原理基于荧光现象。
在样品中加入荧光染料或标记的分子后，这些分子会在特定波长的激发光照射下吸收能量并跃迁到激发态。
随后，它们会自发地从激发态返回基态，并发出荧光信号。
这个过程称为荧光发射。
荧光显微镜的光学系统由激发光源、滤光器、物镜和目镜等组成。
激发光源通常是一个强度可调的光源，如汞灯或激光器。
它能够产生特定波长的激发光，以激发样品中的荧光物质。
为了观察样品发出的荧光信号，荧光显微镜使用了一系列滤光器。
滤光器的作用是选择性地透过特定波长的光线，同时屏蔽其他波长的光线。
通常，荧光显微镜会使用两个滤光器，一个用于选择性地透过激发光，另一个用于选择性地透过荧光发射光。
通过物镜和目镜的组合，荧光显微镜能够放大样品中的荧光信号，并将其投影到人眼或相机上。
物镜是一个高放大倍率的镜头，它能够将样品中的细微结构放大到足够大的尺寸以观察。
目镜则用于进一步放大物镜中的图像，使得观察者能够清晰地看到样品中的细节。
荧光显微镜的工作原理还涉及到荧光染料的选择和标记技术。
荧光染料的选择应根据样品中要观察的分子或结构的特性来确定。
荧光染料需要有足够的发射强度和稳定性，以及与样品中的目标分子或结构有特异性的结合能力。
标记技术则是将荧光染料与样品中的分子或结构进行特异性结合，以便在显微镜下观察到它们。
值得注意的是，荧光显微镜的工作原理还涉及到荧光现象的基本特性。
荧光发射的强度和光谱特性与荧光物质的性质有关，如激发光的波长、激发光的强度和样品中的浓度等。
通过对这些特性的研究和控制，可以进一步提高荧光显微镜的灵敏度和分辨率。
荧光显微镜的工作原理是基于荧光现象。
通过激发样品中的荧光物质，并利用光学系统放大和观察荧光信号，荧光显微镜可以实现对样品中细微结构的观察和分析。
荧光显微镜详解
森林生物工程 黄雅婷
目录
一、荧光显微镜成像原理 二、荧光显微镜的优点及应用 三、荧光显微镜的基本构造 四、荧光显微镜的使用 五、使用荧光显微镜注意事项 六、荧光镜检样品的制作注意事项 七、荧光强度计算
2020/9/23
2
一、荧光显微镜成像原理
某些物质在一定短波长的光(如紫 外光等)的照射下吸收光能进入激发态， 从激发态回到基态时, 就能在极短的时 间内放射出比照射光波长更长的光(可 见光)，这种光就称为荧光。
荧光显微镜是利用一个高发光效
率的点光源，经过滤色系统发出一定 波长的光作为激发光，激发标本内的 荧光物质发射出各种不同颜色的荧光 后，再通过物镜和目镜的放大进行观 察。
2020/9/23
3
二、荧光显微镜的优点及应用
优点：
1.检出能力高，即使荧光很微弱也易辨认，敏感性高（放大作用） 2.对细胞的刺激小（可以活体染色） 3.能进行多重染色等
2020/9/23
12
六、荧光镜检样品的制作注意事项
1. 不能使用本身能产生荧光的药剂 2. 切片标本不能太厚 3. 因石蜡可产生青色荧光，采用石蜡制片时，脱蜡必须 彻底。切片进入水后，应充分水洗，再经荧光染料处理。 4. 最好采用萤石玻璃制成的载玻片、盖玻片。 5. 封片时可采用甘油等无荧光的封固剂。
３、检测时间每次以1h为宜，超过90min，高压汞灯发光强度逐 渐下降，荧光减弱，标本经激发15min后，荧光亦明显减弱。 标本染色后立刻观察，因存放时间太久，荧光会逐渐猝灭。 可将染好色的标本用黑纸包好，存放在聚乙烯塑料袋中，4℃ 保存，可延缓荧光的猝灭时间。
4、荧光显微镜的激发装置及高压汞灯寿命有限，标本应集中检 查，节省时间
荧光显微镜原理特点及使用
荧光显微镜原理特点及使用
荧光显微镜的原理和结构特点：荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统发出一定波长的光(如紫外光3650入或紫蓝光4200入)作为激发光、激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，再通过物镜和目镜的放大进行观察。
这样在强烈的对衬背景下，即使荧光很微弱也易辨认，敏感性高，主要用于细胞结构和功能以及化学成分等的研究。
荧光显微镜的基本构造是由普通光学显微镜加上一些附件(如荧光光源、激发滤片、双色束分离器和阻断滤片等)的基础上组成的。
荧光光源——般采用超高压汞灯(50一200W)，它可发出各种波长的光，但每种荧光物质都有一个产生最强荧光的激发光波长，所以需加用激发滤片（一般有紫外、紫色、蓝色和绿色激发滤片），仅使一定波长的激发光透过照射到标本上，而将其他光都吸收掉。
每种物质被激发光照射后，在极短时间内发射出较照射波长更长的可见荧光。
荧光具有专一性，一般都比激发光弱，为能观察到专一的荧光，在物镜后面需加阻断(或压制)滤光片。
它的作用有二：一是吸收和阻挡激发光进入目镜、以免于扰荧光和损伤眼睛，二是选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。
两种滤光片必须选择配合使用。
荧光显微镜就其光路来分有两种：
1．透射式荧光显微镜: 激发光源是通过聚光镜穿过标本材料来激发荧光的。
常用暗视野集光器，也可用普通集光器，调节反光镜使激发光转射和旁射到标本上．这是比较旧式的荧光显微镜。
其优点是低倍镜时荧光强，而缺。
荧光显微镜的使用原理
荧光显微镜的使用原理荧光显微镜是一种高级显微镜，它利用荧光现象来观察样品。
荧光显微镜的使用原理是将样品用荧光染料标记，然后在显微镜下观察样品发出的荧光信号。
荧光显微镜的使用原理可以分为三个步骤：样品制备、荧光染料标记和荧光显微镜观察。
第一步是样品制备。
样品可以是细胞、组织、蛋白质等生物样品，也可以是纳米材料、金属材料等非生物样品。
样品需要在显微镜下观察，因此需要制备成透明的薄片或切片。
第二步是荧光染料标记。
荧光染料是一种可以吸收光能并发出荧光信号的化合物。
荧光染料可以与样品中的特定分子结合，例如细胞膜、细胞器、蛋白质等。
荧光染料标记可以通过直接染色、间接染色、基因工程等方法实现。
荧光染料标记后的样品可以在荧光显微镜下观察到荧光信号。
第三步是荧光显微镜观察。
荧光显微镜是一种特殊的显微镜，它可以激发荧光染料发出荧光信号，并将信号放大成可见光信号。
荧光显微镜的主要部件包括光源、滤光片、物镜、目镜等。
荧光显微镜可以观察样品的形态、结构、分布、运动等信息。
荧光显微镜的使用原理有以下优点：1.高灵敏度：荧光显微镜可以检测到非常微弱的荧光信号，因此可以观察到低浓度的样品。
2.高分辨率：荧光显微镜可以观察到微小的结构和细胞器，例如细胞核、线粒体、内质网等。
3.多色成像：荧光染料可以标记不同的分子，因此可以实现多色成像，观察不同分子的分布和相互作用。
4.非侵入性：荧光染料标记后的样品不需要破坏或摧毁，因此可以观察到活体细胞和组织的动态过程。
荧光显微镜的使用原理在生物学、医学、材料科学等领域有广泛的应用。
例如，在生物学中，荧光显微镜可以观察细胞分裂、细胞凋亡、蛋白质相互作用等过程；在医学中，荧光显微镜可以观察病毒、细菌、癌细胞等病理过程；在材料科学中，荧光显微镜可以观察纳米材料、金属材料等的结构和性质。
总之，荧光显微镜的使用原理是将样品用荧光染料标记，然后在显微镜下观察样品发出的荧光信号。
荧光显微镜具有高灵敏度、高分辨率、多色成像和非侵入性等优点，在生物学、医学、材料科学等领域有广泛的应用。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
六、荧光组化实验中应注意的几个问题
1、每种荧光染料，均有自己的最适pH值，此时荧光最强。 当pH改变时，不仅荧光强度减弱，而且波长将有所改变，因 此荧光检测时要在一定的pH值的缓冲液中进行。 2、一放荧光染色在20。C以下时荧光比较稳定，温度升高常 出现温度猝灭。 3、在荧光观察中，常因激发光的增强而使样品荧光很快衰 竭，造成观察和照相困难。为此最好用能量小的长波长光进 行观察，需照相时再适当增强激发光。 4、一般荧光染液的浓度在万分之一以下，甚至亿万分之一， 也能使标本着色。在一定的限度内，荧光强度可随荧光素的 浓度增加而增强，但超过限度，荧光强度反而下降，这是由 于荧光分子间的缔合而使自身荧光猝灭所致。
2.药物筛选
荧光探针分布是利用信号传 导中信号分子的迁移功能，将 一荧光蛋白与信号分子相偶联， 根据荧光蛋白的分布情况即可 推断信号分子的迁移状况，并 推断该分子在迁移中的功能。 由于GFP分子量小，在活细胞 内可溶且对细胞毒性较小，因 而常用作荧光探针
八、使用注意事项
1 暗室内进行，打开汞灯5-10min稳定后再观察。
A filter set consists of two barrier filters (1 and 3) and a dichroic mirror (beam-splitting 2)
三、荧光显微镜的操作
(1)安装紫外防护罩。
(2)打开高压汞灯的电源控制箱开关。
(3)插入挡光板，中断光路。
七、荧光显微镜应用技术
1. 对细胞结构或组分的定性位、半定量研究
免疫荧光技术 用荧光标记的抗体或抗原与样品(细胞、组织或分离 的物质等)中相应的抗原或抗体结合，以适当检测荧光的 技术对其进行分析的方法。将抗原或抗体与荧光染料连 接，用于检测相应特异性的抗体或抗原的方法称“直接 免疫荧光技术(direct immunofluorescent technique)”。 用荧光染料标记的第二、第三抗体等检测相应抗原抗体 复合体的方法则称“间接免疫荧光技术(indirect immunofluorescent technique)”。
（五）镜油
一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时，必须使 用镜油，最好使用特制的无荧光镜油，也可用上述甘油 代替，液体石蜡也可用，只是折光率较低，对图像质量 略有影响。
五、荧光染料的使用
1、吖啶橙：吖啶橙是最经典的灵敏的荧光染料， 它可对细胞中的DNA和RNA同时染色而显示不同颜 色的荧光，DNA呈绿色荧光，RNA呈橙红色荧光。 2、溴化乙锭（EB）:染色DNA和RNA。 3、荧光素双醋酸酯(FDA)：FAD 本身无荧光,无极 性,可透过完整的原生质膜。一旦进入原生质体后,由 于受到酯酶分解而产生 具有荧光的极性物质荧光素。 4、荧光染料Ho33342和罗丹明123:Ho33342能与细 胞中DNA进行特异的结合，罗丹明123能与线粒体 进行特异的结合。
2 荧光淬灭(光漂白)：激发光长时间照射会发生荧光 减弱或消失，操作时注意及时用挡板阻挡激发光照射 标本。 3 汞灯关闭后需冷却30min后再重新启动（最好不要短 时间内反复开关，标本应集中观察。） 4 载物台前方黄色遮光板：最好不直接用肉眼看激发 光，以防短波光中的紫外伤害。 5标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。
由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检 出，从而可对抗原进行细胞定位
O 1.分子标记
利用绿色荧光的发光机制，可将 GFP作为蛋白质标签(protein tagging)，即利用DNA重组技术， 将目的基因与GFP基因构成融合基 因，转染合适的细胞进行表达，然 后借助荧光显微镜便可对标记的蛋 白质进行细胞内活体观察
二、荧光显微镜的组成
1、光源：一般采用高压汞灯 2、滤色系统：由激发滤板和压制滤板组成
a、激发滤板：提供一定范围的激发光
b、压制滤板：完全阻挡激发光通过，提供相应滤长范围荧光 3、反光镜：一般采用平面反光镜 4、聚光镜：用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成 5、物镜和目镜
The optical system of a fluorescence microscope.
The end,thank you!
（二）盖玻片 盖玻片厚度在0.17mm左右，光洁。为了 加强激发光，也可用干涉盖玻片，这是一 种特制的表面镀有若干层对不同波长的光 起不同干涉作用的物质（如氟化镁）的盖 玻片，它可以使荧光顺利通过，而反射激 发光，这种反射的激发光女可激发标本。
（三）标本
组织切片或其他标本不能太厚，如太厚激发光大部分消 耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不充分激发。 另外，细胞重迭或杂质掩盖，影响判断。 （四）封裱剂 封裱剂常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光 的亮度在pH8.5～9.5时较亮，不易很快褪去。所以，常用 甘油和0.5mol/l pH9.0～9.5的碳酸盐缓冲液的等量混合液 作封裱剂。
(4)预热5—10分钟。 (5)将载有样品的载玻片放到载物台上。 (6)选择接物镜(按照先低倍，后高倍顺序)。
(7)旋转分光镜组件转盘，选择所需要 的分光镜组件：“O”为观察透射光时 用；“WU”为观察蓝色荧光时用(如 DAPl)；“WB”为观察绿色荧光时用 (如FITC)；“WG"为观察红色荧光时用 (如TRITC)。 (8)使用阻断滤片(目前多数阻断滤片内 置于荧光显微镜)。
(9)通过粗、细螺旋调整焦距。
(10)打开与显微镜连接的计算机，点 击数码成像系统软件，采集数码图像。
四、荧光显微镜标本制作要求
（一）载玻片
载玻片厚度应在0.8～1.2mm之间，太厚 的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能 使激发光在标本上聚集。载玻片必须光洁， 厚度均匀，无明显自发荧光。有时需用石 英玻璃载玻片。
高分辨率荧光显微镜的基本原理和 操作要求
一、荧光显微镜(fluorescence microscope)
原理： 某些物质经一定波长的光（如紫外光）照射后， 物质中的分子被激活，吸收能量后跃迁至激发态；当其从 激发态返回到基态时，所吸收的能量除部分转化为热量或 用于光化学反应外，其余较大部分则以光能形式辐射出来， 由于能量没能全以光的形式辐射出来，故所辐射出的光的 波长比激发光的要长，这种波长长于激发光的可见光部就 是荧光(fluorescence)。所谓荧光就是某些物质在一定波 长光（如紫外光）的照射下、在极短时间内所发出的比照 射光波长更长的可见光。