构建点突变质粒步骤
构建点突变质粒步骤
基因定点突变一、定点突变的目的把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。
二、定点突变的原理通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来,然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR 产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化,筛选阳性克隆,再测序确定就行了。
三、引物设计原则引物设计的一般原则不再重复.突变引物设计的特殊原则：（1）通常引物长度为25~45 bp,我们建议引物长度为30～35 bp.一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11—12 bp。
若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要11—12个bp才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补的引物.（2）如果设定的引物长度为30 bp，接下来需要计算引物的Tm值，看是否达到78℃（GC含量应大于40％）。
（3）如果Tm值低于78℃，则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78℃（GC含量应大于40％）。
（4）设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置。
(5）最好使用经过纯化的引物。
Tm值计算公式:Tm=0。
41×(% of GC)–675/L+81.5注：L：引物碱基数；% of GC:引物GC含量。
四、引物设计实例以G CG→A CG为例：5’—CCTCCTTCAGTA TGTAG G CGACTTACTTATTGCGG-3’（1）首先设计30 bp长的上下游引物，并将A (T）设计在引物的中央位置。
Primer #1: 5'-CCTTCAGTATGTAG A CGACTTACTTATTGC—3’Primer ＃2: 5’-GCAATAAGTAAGTCG T CTACATACTGAAGG-3’（2）引物GC含量为40%，L为30，将这两个数值带入Tm值计算公式,得到其Tm=75.5（Tm=0。
41×40-675/30+81.5）。
重组pCMV-N-Tudor-SN点突变质粒的构建及表达
重组pCMV-N-Tudor-SN点突变质粒的构建及表达杨文栋;苏超;张春燕;赵亚丽;任媛媛;高星杰;杨洁;何津岩【摘要】目的：构建Tudor-SN蛋白的Serine426（S426）、Serine781（S781）、Threonine240（T240）和Threonine429（T429）的点突变质粒，并使该重组质粒能够在HeLa细胞中融合表达。
方法：利用定点突变技术，对Tudor-SN蛋白进行S426A、S781A、T240A、T429A点突变，通过双酶切的方法获得Tudor-SN.Mutants片段，最后将其连入到pCMV-N-Flag载体中。
在HeLa细胞中转染该质粒，利用Western blot技术检测质粒表达效率。
结果：（1）重组质粒经双酶切鉴定，可以观察到载体与Tudor-SN.Mutants的条带。
（2）转染突变质粒后可看出HeLa细胞中有Flag蛋白表达。
结论：质粒构建成功，可以用于下一步科学研究使用。
%Objective:To construct eukaryotic Flag expressing recombinant pCMV-N-Tudor-SN.Mutants-Flag. Methods:The Serine426 (S426), Serine781(S781), Threonine240(T240)andThreonine429(T429)of Tudor-SN were transformed into Alanine by site-directed mutagenesis technique. Then the Tudor-SN.Mutants were obtained by restricting double enzyme digestion, and then inserted into pCMV-N-Flag vector. The recombinant plasmids were transfected into HeLa and observed by Western blot. Results:(1)The vector and Tudor-SN. Mutants could be observed by restricting double enzyme digestion.(2)Flag was expressed by HeLa which was transfected with recombinant plasmid. Conclusion:The recombinant plasmids of pCMV-N-Tudor-SN.Mutants-Flag are constructed successfully, and may be useful for further study.【期刊名称】《天津医科大学学报》【年(卷),期】2016(000)001【总页数】4页(P5-8)【关键词】人类Tudor-SN蛋白;pCMV-N-Flag;重组质粒;融合蛋白【作者】杨文栋;苏超;张春燕;赵亚丽;任媛媛;高星杰;杨洁;何津岩【作者单位】天津医科大学细胞生物学系，天津300070;]天津医科大学基础医学研究中心，天津300070;]天津医科大学医学生物化学与分子生物学系，天津300070;天津医科大学细胞生物学系，天津300070;]天津医科大学医学生物化学与分子生物学系，天津300070;]天津医科大学基础医学研究中心，天津300070;天津医科大学细胞生物学系，天津300070; ]天津医科大学基础医学研究中心，天津300070;天津医科大学细胞生物学系，天津300070【正文语种】中文【中图分类】Q7Abstract Objective:To construct eukaryotic Flag expressing recombinant pCMV-N-Tudor-SN.Mutants-Flag.Methods：The Serine426（S426）,Serine781（S781）,Threonine240（T240）and Threonine429（T429）of Tudor-SN were transformed into Alanine by site- directed mutagenesis technique.Then the Tudor-SN.Mutants were obtained by restricting double enzyme digestion,and then inserted into pCMVN-Flag vector.The recombinant plasmids were transfected into HeLa and observed by Western blot.Results：（1）The vectorand Tudor-SN.Mutants could beobserved by restricting double enzyme digestion.（2）Flag was expressed by HeLa which was transfected with recombinant plasmid.Conclusion：The recombinant plasmids of pCMV-N-Tudor-SN.Mutants-Flag are constructed successfully,and may be useful for furtherstudy.Key words human Tudor-SN；pCMV-N-Flag；recombinant plasmid；fusion protein人类Tudor-SN蛋白，又称SND1（staphylococcal nuclease domain containing 1）或p100，该蛋白首次以EB病毒细胞核抗原2（epstein-barr virus nuclear protein 2，EBNA2）的转录共激活因子被发现[1]。
环状质粒 pcr 构建定点突变序列
环状质粒 pcr 构建定点突变序列标题：环状质粒PCR构建定点突变序列在遗传工程领域，环状质粒PCR技术被广泛应用于构建定点突变序列，以实现对目标基因的精确控制和调节。
本文将介绍环状质粒PCR构建定点突变序列的原理、步骤以及应用前景。
一、原理环状质粒PCR是一种基于聚合酶链式反应（PCR）的技术，通过引入特定的引物和模板DNA，可以在特定位点引发突变。
其原理主要包括以下几个步骤：1.设计引物：根据目标基因序列，在突变位点的上下游设计引物，确保能够选择性扩增目标序列。
2.扩增反应：将设计好的引物与模板DNA一起加入PCR反应体系，进行多轮的循环反应，使目标序列得以扩增。
3.定点突变：在PCR反应体系中加入含有目标突变碱基的核苷酸，使其与目标序列进行配对，从而引发突变。
4.纯化和检测：通过凝胶电泳或其他检测手段，验证突变序列的引入是否成功。
二、步骤环状质粒PCR构建定点突变序列的步骤如下：1.设计引物：根据目标基因序列，利用生物信息学工具设计引物，确保引物的特异性和扩增效率。
2.模板制备：从目标基因所在的质粒中提取模板DNA，确保模板的纯度和完整性。
3.反应体系准备：根据PCR反应的需要，准备好反应缓冲液、酶、引物和dNTP等试剂。
4.扩增反应：将模板DNA与反应体系混合，利用PCR仪进行循环反应。
根据目标序列的长度和复杂性，设置合适的扩增程序和循环次数。
5.突变引入：在PCR反应的合适环节，加入含有目标突变碱基的核苷酸，使其与目标序列发生配对，引发突变。
6.纯化和检测：通过凝胶电泳等方法，纯化扩增产物并进行突变检测，确认突变序列的引入是否成功。
三、应用前景环状质粒PCR构建定点突变序列具有以下应用前景：1.基因功能研究：通过引入特定的突变序列，可以研究目标基因的功能和作用机制，揭示基因与表型之间的关系。
2.基因工程改良：利用定点突变序列构建新的基因表达载体，可以实现对基因表达的精确调控，为基因工程改良提供技术支持。
DNA定点突变实验具体步骤及详细说明
DNA定点突变实验具体步骤及详细说明定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。
一、引物设计每条引物都要携带有所需的突变位点，引物一般长25~45 bp，设计的突变位点需位于引物中部。
二、反应1. 使用高保真的pyrobest DNA聚合酶，循环次数少，一般为12个循环。
2. 反应体系：（1）10x pyrobest Buffer：5 ul（2）dNTP Mixture(10 mM) ：1 ul（3）模板DNA(5~50 ng) ：1ul（4）primer 1 (125 ng) ：1 ul（5）primer 2 (125 ng) ：1 ul（6）pyrobest DNA polymerase（TaKaRa）(5 U/ul)：0.25 ul（7）加无菌蒸馏水至50ul.三、产物沉淀纯化1. 加1/10 体积的醋酸钠，1倍体积的异丙醇，混匀置冰上（或-20℃冰箱）5min，离心弃上清。
2. 70~75%乙醇洗盐两次，烘干后溶于无菌水中（此步可省略，直接用DpnI 酶切）。
四、DpnI酶切1. 酶切体系（1）Buffer ：2 ul（2）BSA（100x）：0.2 ul（3）DNA ：x ul（4）DpnI：0.5 ul（5）加无菌去离子水至20 ul。
2. 30℃酶切1~4 h。
3. 65℃水浴15min 终止反应。
五、转化将酶切产物转化大肠杆菌DH5a菌株，利用抗生素筛选突变子。
六、测序验证注意事项1. 引物和质粒都准备好后，当然就是做PCR喽，不过对于PCR的酶和buffer，不能用平时的，我们做PCR把整个质粒扩出来，延伸长度达到几个K，所以要用那些GC buffer或扩增长片段的buffer，另外，要用保真性能较好的PFU酶来扩增，防止引进新的突变。
2. Quick change试剂盒分为几种不同的类型，QuikChange®、Site-Directed Mutagenesis Kit标准点突变试剂盒、QuikChange®、XL Site-Directed Mutagenesis Kit长模板单点突变试剂盒（>8kb）从原理上是一样的，只是PCR的酶和BUFFER不一样，后面用了比较适合长片段扩增的酶和BUFFER罢了，没什么特别的东西。
突变型PUMA质粒的构建及表达
研 究使 用 的 Ｐ Ｕ ＭＡ基 因来 源 于 ｐ Ｃ Ｅ Ｐ ４ 一 （ Ｈ Ａ） － Ｐ ｕ － ＭＡ质粒 ， 通 过野 生型 和 突变 型 质粒 的成 功 构 建 ， 旨 在 为 突变 型 Ｐ Ｕ ＭＡ对 肿 瘤 细胞 的促 凋 亡 功 能 研 究
奠定基 础 。
隆到 ｐ Ｉ Ｒ Ｅ Ｓ ２ ． Ｅ Ｇ Ｆ Ｐ载 体 上 ， 构建 Ｐ Ｕ Ｍ Ａ 真 核 表 达 载 体
ｐ Ｉ Ｒ Ｅ Ｓ ２ 一 Ｅ Ｇ Ｆ Ｐ 一 （ ＨＡ） ． Ｐ Ｕ Ｍ Ａ， 利 用 定 点 突 变 技 术 构 建 ｐ ｌ Ｒ Ｅ Ｓ ２ 一 Ｅ Ｇ Ｆ Ｐ 一 （ Ｈ Ａ） ， 一 Ｐ Ｕ Ｍ Ａ— Ｔ ２ ８ Ｇ， 行 Ｐ Ｃ Ｒ及 测 序 鉴 定 ； 脂 质体分别 将两种 质粒转 染 Ｈｅ ｌ ａ细胞 ， 同 时设 未转染 的 阴性 对照组及转染 空 载体 组 （ ４个 实 验组 ） ； Ｐ Ｉ 染 色观 察 Ｐ Ｕ Ｍ Ａ 对细胞的促凋亡作 用 ； 流式 细胞仪检测细胞 凋亡率 ； Ｒ Ｔ — Ｐ Ｃ Ｒ 检测 Ｐ Ｕ ＭＡ的表达 ； Ｗｅ ｓ ｔ ｅ ｒ ｎ ｂ ｌ ｏ ｔ 检测 突变 型 Ｐ Ｕ ＭＡ蛋 白和 标签蛋 白的表达 。结果 经Ｐ Ｃ Ｒ及 测序 结果 表 明 ， 正确 构 建野生型 、 突变 型 Ｐ Ｕ ＭＡ重组 质粒 ， Ｐ Ｕ ＭＡ基 因第 １ ０位氨基 酸的第 ２ ８～３ ０位 碱 基 由丝 氨 酸 （ Ｔ Ｃ Ｃ） 突 变 为 丙 氨 酸
Ａ ｃ ｔ ａ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ａ ｔ ｉ ｓ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎ ａ ｌ ｉ ｓ Ａ ｎ ｈ ｕ ｉ ２ ０ １ ３ Ａ ｐ ｒ ； ４ ８ （ ４ ）
・３ ４ １・
突变型 Ｐ Ｕ ＭＡ质粒 的构建及表达
质粒定点突变操作步骤
质粒定点突变
1.简介
定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化，包括碱基的添加、删除、点突变等。
定点突变能迅速高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。
本实验主要原理是设计一对包含突变位点的引物，和模板质粒退火后用高保真DNA聚合酶循环延伸后用Dpnl 酶切延伸产物。
由于原来的模板质粒来源于常规大肠杆菌，是经过dam甲基化修饰的，对Dpnl敏感而被切碎（Dpnl 识别序列为甲基化的GATC，GA TC在几乎各种质粒中不止一次出现），而体外合成的突变质粒没有甲基化不被消化因此得以在成功转化，随后得到突变的质粒克隆。
2.材料
2.1试剂
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（诺唯赞Vazyme Biotech，#P505-d1-AA）
2 × Phanta Max Buffer（诺唯赞Vazyme Biotech，#PB505）
dNTP Mix (10 mM each)（诺唯赞Vazyme Biotech，# P031-01/02）
DMSO
3.步骤
1、设计一对包含突变位点的互补引物。
2、反应体系
反应程序
所有操作请在冰上进行，各组分解冻后请充分混匀，用完之后请及时放回-20℃保存。
3、反应产物加入0.5 μl Dpnl酶，37 ℃静置>2 hs。
4、静置后取2 μl加入100 μl Turbo进行转化，后面步骤同分子克隆。
质粒的构建
质粒的构建一、质粒构建的基本原理1.1 质粒结构质粒是一种环状DNA分子，通常大小在1-200 kb之间，其中包含了一个或多个基因编码序列，以及与复制、表达等相关的功能序列。
质粒通常由多个功能区域组成，包括基因插入位点、选择标记、复制起点、多克隆位点等。
1.2 质粒构建方法质粒构建一般分为以下几个步骤：基因克隆、质粒挑选、连接反应、转化、筛选，这些步骤通常需要借助于PCR、限制性内切酶、DNA连接酶、转化试剂等。
1.3 质粒的应用质粒构建技术广泛应用于基因工程、蛋白质表达、基因敲除、基因组编辑等领域。
通过构建特定功能的质粒，可以实现对基因的操控和调控，对生物学功能进行研究。
二、质粒构建的方法与步骤2.1 基因克隆质粒构建的第一步通常是通过PCR扩增目的基因，得到目的基因片段。
基因片段的选择根据实验需要，可以是全长基因、部分序列、突变体等。
2.2 质粒挑选选择合适的质粒载体是质粒构建的关键一步。
通常质粒载体的选择考虑到基因插入位点、复制起点、选择标记等功能。
常用的质粒载体有pUC19、pBR322、pET等。
2.3 连接反应将基因片段与质粒载体进行连接反应，通常需要利用DNA连接酶将两者连接起来。
连接反应后，通过热激酶等方法将连接产物转化到大肠杆菌等宿主细胞中。
2.4 转化转化是将连接后的质粒DNA导入到宿主细胞中的过程，通常采用化学转化、电穿孔转化、热激等方法进行。
2.5 筛选通过选择标记或多克隆位点等方法对转化后的细胞进行筛选，筛选出含有目的质粒的阳性克隆。
通常可以利用抗生素抗性筛选、荧光报告基因筛选等方法。
三、质粒构建的应用3.1 基因工程质粒构建技术可以用于将外源基因导入到宿主细胞中，实现基因的操控和表达。
通过构建携带感兴趣基因的质粒，可以实现对基因编码蛋白质的表达和研究。
3.2 蛋白质表达利用质粒携带外源基因序列，在宿主细胞中进行蛋白质表达。
通过构建携带目的基因的质粒，可以实现对特定蛋白质的大量表达和纯化。
定点突变过表达质粒
定点突变过表达质粒
定点突变过表达质粒指的是在基因序列中通过特定的突变点，引入一种转录或翻译水平上过度表达的质粒或载体。
这种质粒常用于研究特定蛋白质功能、鉴定关键结构域以及评估在不同病理条件下的功能改变等。
要构建定点突变过表达质粒，首先需要确定目标基因的突变位点，这可以通过文献研究、结构生物学信息分析等方法来确定。
随后，可以采取多种方法来实现定点突变，如PCR扩增、聚合酶链反应、酶切和连接等。
具体操作步骤如下：
1. 设计合适的引物：根据目标基因的序列，设计与突变位点相匹配的特异性引物。
引物的设计要遵循引物设计原则，确保产生所需的突变。
2. 进行PCR扩增：使用设计的引物进行PCR扩增，从模板DNA中扩增出包含突变位点的目标基因片段。
3. 纯化产物：将PCR产物进行酶切或其他纯化方法，以获得纯净的片段。
4. 进行定点突变：使用突变引物和PCR产物作为模板，采用引物延伸方法，将突变引物与目标基因片段连接起来，形成含有突变的目标基因片段。
5. 构建表达载体：使用适当的酶切和连接技术，将突变的目标基因片段连接到表达载体中，如质粒或病毒载体，以构建定点突变过表达质粒。
6. 进行转染和表达：将构建好的质粒导入宿主细胞，并进行适当的培养和条件优化，以实现目标蛋白质的过表达。
最后，通过适当的测量和分析方法，如Western blot、荧光显微镜等，对目标蛋白质的定点突变过表达进行验证和表征。
总结而言，定点突变过表达质粒的构建需要确定突变位点、设计引物、进行PCR扩增和突变、连接到表达载体中等多个步骤。
这种质粒广泛应用于蛋白质功能研究和疾病机制的探索，为相关领域的研究提供了重要的工具和平台。
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构建点突变质粒步骤．
基因定点突变
一、定点突变的目的
把目的基因上面的一个碱基换成另外一个
碱基。
二、定点突变的原理
通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。
三、引物设计原则
引物设计的一般原则不再重复。
突变引物设计的特殊原则：
（1）通常引物长度为25~45 bp，我们建议引物长度为30~35 bp。
一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12 bp。
若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要11-12个bp才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补的引物。
．
接下来，）如果设定的引物长度为30 bp （2GC℃（Tm值，看是否达到78需要计算引物的 40%）。
含量应大于
℃，则适当改变引Tm值低于78（3）如果含量应大（GC78物的长度以使其Tm值达到℃）。
于40%）设计上下游引物时确保突变点在引物（4
的中央位置。
）最好使用经过纯化的引物。
（5
(% of 值计算公式：Tm=0.41×TmGC)–675/L+81.5
注：L：引物碱基数；% of GC：引物GC 含量。
四、引物设计实例
以G CG→A CG为例：
5'-CCTCCTTCAGTATGTAG G CGACTTACTT ATTGCGG-3'
（1）首先设计30 bp长的上下游引物，并将A (T)设计在引物的中央位置。
Primer #1:
5'-CCTTCAGTATGTAG A CGACTTACTTAT 3' TGC-
Primer #2:
5'-GCAATAAGTAAGTCG T CTACATACTGAA GG-3'
（2）引物GC含量为40%，L为30，将这
两个数值带入Tm值计算公式，得到其
Tm=75.5（Tm=0.41×40-675/30+81.5）。
通过计算可以看出其Tm低于78℃，这样的引物是不合适的，所以必须调整引物长度。
（3）重新调整引物长度。
Primer #1:
5'-CCTCCTTCAGTATGTAG A CGACTTACTT ATTGCGG-3'
Primer #2:
5'-CCGCAATAAGTAAGTCG T CTACATACTG AAGGAGG-3'
在引物两端加5mer（斜体下划线处），这样引物的GC含量为45.7%，L值为35，将这两个数值带入Tm值计算公式，得到其Tm
为80.952（Tm=0.41×
47.5-675/35+81.5），这样的引物就可以用于突变实验了。
Buffer
五、突变所用聚合酶及
引物和质粒都准备好后，当然就是做PCR喽，不过对于PCR的酶和buffer，不能用平时的，我们做PCR把整个质粒扩出来，延伸长度
达到几个K，所以要用那些GC buffer或扩增长片段的buffer，另外，要用保真性能较好的PFU酶来扩增，防止引进新的突变。
除了使用基因定点突变试剂盒，如Stratagene和塞百盛的试剂盒，但价格昂贵。
可以使用高保真的聚合酶，如博大泰克的金牌快速TM HS DNA PrimeSTAR酶、Takara的taqpolymerase。
六、如何去掉PCR产物
最简单的方法就是用DpnI酶，DpnI能够
识别甲基化位点并将其酶切，我们用的模板一般都是双链超螺旋质粒，从大肠杆菌里提出来的质粒一般都被甲基化保护起来（除非你用的是甲基化缺陷型的菌株），而PCR产物都是没有甲基化的，所以DpnI酶能够特异性地切割模板（质粒）而不会影响PCR产物，从而去掉模板留下PCR产物，所以提质粒时那些菌株一定不能是甲基化缺陷株。
．
DpnI处理的时间最好长一点，最少一个小时吧，最好能有两三个小时，因为如果模板处理得不干净，哪怕只有那么一点点，模板直接在平
板上长出来，就会导致实验失败。
七、如何拿到质粒
直接把通过DpnI处理的PCR产物拿去做转化就行了，然后再筛选出阳性克隆，并提出质粒，拿去测序，验证突变结果。
八、图示
九、定点突变操作步骤
[A] 诱导突变基因（PCR反应）以待突变的质粒为模板，用设计的引物及
Muta-direct?酶进行扩增反应，诱导目的基因突变。
PCR．
1. 设计点突变引物。
注]参考引物设计指导 [DN A
2. 准备模板质粒++型菌株中常有克隆数低的现象，但是对突变效damend型菌株（例如DH5α菌株）作为宿主菌。
在[注]用
时我们建议您使用本公司的质粒提纯试剂盒。
DNA率没有影响。
提取质粒反应体系）选项]对照反应体系（50μl3. 5μReaction Buffer10pUC18 control
2μ10ng/μplasmitotal 20nControl primer mi2μ20pmol/μeach
dNTP mixtur2μ2.5m38μOd2direct? Muta-1μl Enzyme
4. 样品反应体系（50μl反应体系）
10×Reaction Buffer 5μl
2μl Sample plasmid
total
，（10ng/μl ）20ngSample primer (F)
1μ10pmol/μSample primer (R1μ10pmol/μdNTP mixtur2μeach
2.5m38μOdt?Muta-dire1μEnzyme 5. PCR反应条件 [扩增条件。
]按如下参数设置PCRReactionCyclesTemperature Time
30sec 95℃1cycle
30sec ℃9515cycle
1min ℃ 55
1min per ℃72
plasmid Kb
分钟，然后置于扩增反应完成后冰育56. PCR 室温（避免反复冻融）。
个时会发生突变率降4PCR循环数。
注意当突变点位点超过注] 按下列提供的PCR条件进行扩增，控制[ 低的现象MutationCycles
15cycles1~2Nucleotide
18cycles
3Nucleotides
[B] 突变质粒选择PCR反应结束后使用Mutazyme?酶消化甲基化质粒从而选择突
变质粒DNA。
1. 准备PCR反应产物
2. 加入1μl（10U/μl）Mutazyme?酶37℃温育1小时。
[注]当质粒DNA用量过多时Mutazyme?酶可能发生与样品反应不完全的现象。
因此我们建议为了保证突变率请严格遵
照实验步骤进行操作。
如果突变率低，可以适当延长反应时间或增加Mutazyme?酶用量。
[C]转化
反应完毕后在质粒DNA上会产生缺口，当把这+型菌dam转入E.coli中时请选择个质粒DNA株，例如DH5α。
1. 将10μl样品加到50μl感受态细胞里，然后放分钟。
30置在冰上
2. 接下来可以参照一般的转化步骤进行。
序列分析
通常当LB平板上出白色菌落则表明发生了
突
变。
为了证实这一结果，我们建议对白色单菌落进行测序分析。
．。