实验五：分光光度法测定血清蛋白含量
血清鉴别实验报告
一、实验目的1. 了解血清的基本概念和组成；2. 掌握血清鉴别实验的原理和方法；3. 通过实验操作，提高对血清成分的鉴别能力。
二、实验原理血清是血液中去除红细胞和白细胞后剩余的液体部分，主要由血浆和少量细胞碎片组成。
血清中含有多种蛋白质、电解质、营养物质、激素等成分。
本实验通过观察血清的颜色、透明度、凝固性、酸碱度等特性，以及进行血清蛋白定性实验和定量实验，对血清进行鉴别。
三、实验材料1. 实验动物：家兔、小白鼠；2. 实验器材：注射器、试管、试管架、滴管、酒精灯、镊子、剪刀、显微镜、离心机等；3. 实验试剂：生理盐水、10%氢氧化钠溶液、5%醋酸溶液、酚酞指示剂、双缩脲试剂、标准蛋白质溶液等。
四、实验方法1. 观察血清的基本特性：（1）颜色：取少量血清置于试管中，与生理盐水比较，观察血清颜色；（2）透明度：观察血清的透明度，与生理盐水比较；（3）凝固性：将血清滴入试管中，用酒精灯加热至50℃，观察血清是否凝固；（4）酸碱度：取少量血清置于试管中，加入酚酞指示剂，观察颜色变化。
2. 血清蛋白定性实验：（1）双缩脲实验：取少量血清置于试管中，加入双缩脲试剂，观察颜色变化；（2）硫酸铵盐析实验：取少量血清置于试管中，加入硫酸铵溶液，观察沉淀情况。
3. 血清蛋白定量实验：（1）紫外分光光度法：取少量血清置于试管中，用紫外分光光度计测定其在特定波长下的吸光度值；（2）凯氏定氮法：取少量血清置于试管中，用凯氏定氮法测定其中的氮含量。
五、实验结果与分析1. 观察血清的基本特性：（1）颜色：家兔血清呈淡黄色，小白鼠血清呈淡红色；（2）透明度：家兔血清和小白鼠血清均较透明；（3）凝固性：家兔血清加热后凝固，小白鼠血清加热后不凝固；（4）酸碱度：家兔血清和小白鼠血清均呈碱性。
2. 血清蛋白定性实验：（1）双缩脲实验：家兔血清和小白鼠血清均呈紫色；（2）硫酸铵盐析实验：家兔血清和小白鼠血清均产生白色沉淀。
3. 血清蛋白定量实验：（1）紫外分光光度法：家兔血清和小白鼠血清吸光度值相近；（2）凯氏定氮法：家兔血清和小白鼠血清氮含量相近。
常用紫外分光光度法测定蛋白质含量
6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。
含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。
经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。
若以甘氨酸为例，其反应式如下：nh2ch2cooh+3h2so4——2co2+3so2+4h2o+nh3 (1)2nh3+h2so4——(nh4)2so4 (2)(nh4)2so4+2naoh——2h2o+na2so4+2nh3 (3)反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。
为了加速消化，可以加入cuso4作催化剂，k2so4以提高溶液的沸点。
收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。
实验和计算方法这里从略。
计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。
如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。
二、双缩脲法（biuret法）（一）实验原理双缩脲（nh3conhconh3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。
在强碱性溶液中，双缩脲与cuso4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。
凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。
测定范围为1-10mg蛋白质。
干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。
此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。
主要的缺点是灵敏度差。
因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
（二）试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（bsa）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用bsa浓度1mg/ml的a280为0.66来校正其纯度。
蛋白质含量测定实验报告
一、实验目的1. 理解并掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的原理和操作步骤。
2. 学习使用分光光度计进行比色分析。
3. 通过实验，掌握蛋白质含量测定的实际操作，提高实验技能。
二、实验原理考马斯亮蓝法是一种快速、简便的蛋白质定量方法。
该法基于蛋白质与考马斯亮蓝G-250染料的结合，蛋白质含量与染料结合程度呈线性关系。
通过测定溶液在特定波长下的吸光度，可以计算出蛋白质的含量。
实验原理：蛋白质分子中的肽键在碱性条件下能与考马斯亮蓝G-250染料发生结合，形成有色的复合物。
该复合物在特定波长下有特征性吸收峰，其吸光度与蛋白质含量呈线性关系。
三、实验材料1. 蛋白质标准品（如牛血清白蛋白）。
2. 考马斯亮蓝G-250染料。
3. 6.0mol/L NaOH溶液。
4. 双蒸水。
5. 分光光度计。
6. 试管、移液器、吸管等实验器材。
四、实验步骤1. 标准曲线制作：将不同浓度的蛋白质标准品配制成溶液，分别加入考马斯亮蓝G-250染料，在特定波长下测定吸光度，绘制标准曲线。
2. 样品处理：取待测样品，按照一定比例稀释，加入考马斯亮蓝G-250染料，在特定波长下测定吸光度。
3. 数据处理：根据标准曲线，计算待测样品中的蛋白质含量。
五、实验结果与分析1. 标准曲线制作：根据实验数据，绘制标准曲线，得出线性方程。
2. 样品处理：取待测样品，按照一定比例稀释，加入考马斯亮蓝G-250染料，在特定波长下测定吸光度。
3. 数据处理：根据标准曲线，计算待测样品中的蛋白质含量。
实验结果显示，待测样品中的蛋白质含量为XX g/L。
六、实验讨论1. 实验过程中，应注意操作规范，避免污染和误差。
2. 在制作标准曲线时，应选择合适的浓度范围，保证线性关系良好。
3. 待测样品的稀释倍数应根据实际浓度选择，以保证在检测范围内。
4. 在测定吸光度时，应注意仪器校准和操作，避免误差。
七、实验总结本次实验通过考马斯亮蓝法测定了待测样品中的蛋白质含量，实验结果准确可靠。
双缩脲加分光光度法测蛋白质含量
5、待检测样品的测定。
试剂
管号
待测样品（ml）
1 （脱脂牛奶）
3.0
3 （含乳饮品）
3.0
双缩脲试剂A(ml)
1.0
1.0
双缩脲试剂B(ml)
1.0
1.0
水浴加热20min，充分混匀，在540nm比色。
A540nm
0.463
0.239
4 （牛奶）
3.0 1.0 1.0
2.695
利用相关电脑软件制作标准曲线，并对照标准曲线比较待测饮品中蛋白质浓度高低。
两分子尿素加热脱氨缩合成的双缩脲(H2N-0C-NHC0-NH2) ，因分子内含有两个邻接的肽键，在碱性溶 液中可与Cu2+发生双缩脲反应，生成紫红色络合物。
蛋白质分子含有大量彼此相连的肽键(-CO-NH-),同 样能在碱性条件下与Cu2+发生双缩脲反应，生成的 紫红色络合物，且在540nm处的吸光度与蛋白质的含量 在10~120g/L范围内有良好的线性关系。
双缩脲试剂的使用：使用时先在待测液体中加入双缩脲试剂A，再 加入等量的双缩脲试剂B，摇匀。
2、2mg/ml标准蛋白的配制。
精确称取牛血清白蛋白0.1g，在小烧杯内搅拌溶解。再转移到50ml容量瓶 中，定容。
3、标准曲线的绘制 取干净试管7支，编号，按表1进行操作。
管号 试剂
0
1
2
3
2mg/ml牛血 清白蛋白
六、实践活动评价
由实验结果可知：蛋白质含量脱脂牛奶>含乳饮品>纯牛奶。 与预期实验结果符合。
0.0
0.3
0.6
0.9
蒸馏水/ml
3
2.7
2.4
2.1
蛋白质浓度/ （mg/ml）
实验五：分光光度法测定血清蛋白含量解析
电脑绘制标准曲线图方法
新建一个EXCEL，一行输吸光度，一行输标准系列 的含量，用鼠标选定这两行，点击菜单栏的“插入”， 选择“图标”（或直接点工具栏的“图表向导”），在弹 出的对话框里点“X-Y散点图”，点击完成 选择在出现的图标上任意一个点，在这个点上点击 右键，在弹出的对话框里点击“添加趋势线”，在弹 出的“添加趋势线”对话框里点击“选项”那一页，选取 “显示公式”“显示R2”，点击完成后，再看你的图， 标紫外分光光度计。 （二）试剂 1．0.15mol/L NaCl溶液，用蒸馏水定容。 2．被检血清。
实验内容
用0.15mol/L NaCl溶液将血清作100倍稀释， 选用光径为1cm的石英比色杯，分别在 280nm和260nm波长两处测定溶液的吸光 度（A），根据Lowry-Kalckar公式或 Warburg-Christian公式计算此溶液的蛋白 质浓度，再乘以稀释倍数100得到血清蛋白 质的真实浓度。
试剂：0.15mol/L Nacl溶液 、蛋白质标准溶 液 、蛋白质待测溶液 器材：紫外分光光度计 、石英比色杯、试 管架、试管、吸管、洗耳球、记号笔
实验步骤
取9支试管，分别用记号笔表上1-8和 U（待测）数字；按照下表格加入试剂
混匀，选用石英比色杯，在280nm处以第 一管调节零点，记录比色结果。 制作标准曲线，以吸光度为纵坐标，蛋白 质浓度为横坐标，绘制出280nm处的血清 蛋白质标准曲线 根据标准曲线查出所测蛋白质浓度
分光光度法测定 血清蛋白含量
实验目的
1.学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原 理。 2.掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的 实验技术。 3.掌握紫外-可见分光光度计的使用方法。
测定血清实验报告
一、实验目的1. 了解血清的组成及其生理功能。
2. 掌握血清测定的原理和方法。
3. 学习血清蛋白电泳技术的操作流程及注意事项。
二、实验原理血清是由血浆中去除纤维蛋白原后剩余的液体成分，主要包含水、蛋白质、电解质、营养物质、激素等。
血清蛋白电泳技术是一种常用的分离血清蛋白的方法，通过电泳将血清中的蛋白质分离成不同的组分，便于进一步分析。
三、实验器材与试剂1. 实验器材：醋酸纤维薄膜、电泳槽、直流稳压电泳仪、剪刀、镊子、试管、烧杯、培养皿、巴比妥-巴比妥钠缓冲液、染色液、漂洗液、浸出液、血清样本。
2. 实验试剂：巴比妥钠、巴比妥、硫酸铜结晶、酒石酸钾钠、KI、NaOH、双缩脲试剂、2，4-二硝基苯肼、丙酮酸标准液、NaOH溶液、生理盐水、75%乙醇、抗A、抗B血型定型试剂。
四、实验步骤1. 血清蛋白电泳（1）将醋酸纤维薄膜浸泡在pH8.6的巴比妥-巴比妥钠缓冲液中，使其充分浸润。
（2）取少量血清样本，加入适量的双缩脲试剂，充分混匀。
（3）用滴管将血清样本滴加在醋酸纤维薄膜的一端，确保样本均匀分布。
（4）将醋酸纤维薄膜放入电泳槽中，加入适量的pH8.6的巴比妥-巴比妥钠缓冲液。
（5）接通直流稳压电泳仪，调整电压为150V，电泳时间约30分钟。
（6）关闭电源，取出醋酸纤维薄膜，用染色液染色。
（7）用漂洗液漂洗醋酸纤维薄膜，直至洗去未结合的染色液。
（8）观察醋酸纤维薄膜上的蛋白质带，记录各蛋白质带的迁移率。
2. 血型鉴定（1）取双凹玻片一块，用干净纱布轻拭使之洁净，在玻片两端用腊笔标明A及B，并分别各滴入A及B标准血清一滴。
（2）细胞悬液制备：从指尖或耳垂取血一滴，加入含1ml生理盐水的小试管内，混匀，即得约5％红细胞悬液。
采血时应注意先用75％酒精消毒指尖或耳垂。
（3）用滴管吸取红细胞悬液，分别各滴一滴于玻片两端的血清上，注意勿使滴管与血清相接触。
（4）竹签两头分别混合，搅匀。
（5）10～30min后观察结果。
血清成分鉴定实验报告
一、实验目的1. 学习并掌握血清成分鉴定的基本原理和方法。
2. 通过实验操作，了解血清中主要蛋白质的组成及其功能。
3. 培养实验操作技能，提高对实验数据的分析和处理能力。
二、实验原理血清是血液凝固后，血细胞与血浆分离得到的液体。
它主要由水、蛋白质、电解质、激素、营养物质等组成。
本实验通过醋酸纤维薄膜电泳、双缩脲比色法等方法，对血清中的主要成分进行鉴定。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 新鲜血清样本- 巴比妥-巴比妥钠缓冲液- 双缩脲试剂- 蛋白质标准品- 醋酸纤维薄膜- 电磁搅拌器- 电泳槽- 直流稳压电泳仪- 分光光度计- 移液器- 移液管2. 实验仪器：- 离心机- 恒温水浴锅- 显微镜四、实验步骤1. 血清样品处理：- 将血清样本离心，取上清液备用。
2. 醋酸纤维薄膜电泳：- 将醋酸纤维薄膜浸泡在pH 8.6的巴比妥-巴比妥钠缓冲液中，使其充分润湿。
- 将处理好的血清样品点样于醋酸纤维薄膜上。
- 将醋酸纤维薄膜放入电泳槽中，加入pH 8.6的巴比妥-巴比妥钠缓冲液。
- 开启直流稳压电泳仪，进行电泳分离。
- 电泳结束后，将醋酸纤维薄膜取出，用染色液染色，然后用漂洗液漂洗。
3. 双缩脲比色法测定蛋白质含量：- 将处理好的血清样品与双缩脲试剂混合，放入恒温水浴锅中加热反应。
- 用分光光度计在540nm处测定吸光度值。
- 根据蛋白质标准品绘制标准曲线，计算样品中蛋白质含量。
4. 观察与记录：- 观察醋酸纤维薄膜电泳图谱，分析血清中蛋白质的组成。
- 记录双缩脲比色法测定的蛋白质含量。
五、实验结果与分析1. 醋酸纤维薄膜电泳图谱：- 观察到血清中存在清蛋白、球蛋白、纤维蛋白原等蛋白质组分。
- 清蛋白位于电泳图谱的阳极侧，球蛋白位于中间，纤维蛋白原位于阴极侧。
2. 双缩脲比色法测定蛋白质含量：- 样品中蛋白质含量为X mg/L。
六、实验讨论1. 醋酸纤维薄膜电泳是一种快速、简便的蛋白质分离方法，可以有效地将血清中的蛋白质组分分离。
分光法测蛋白质实验报告
紫外分光光度法测定蛋白质含量一、实验目的1.学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理。
2.掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术。
3.掌握TU-1901紫外-可见分光光度计的使用方法并了解此仪器的主要构造。
二、实验原理1.紫外-可见分光光度法，是以溶液中物质的分子或离子对紫外和可见光谱区辐射能的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。
紫外光：10-400 nm可见光：400-780 nm（可被人们的眼睛所感觉）特点：带光谱、分子光谱应用：定性分析-最大吸收波长；定量分析-朗伯-比尔定律（标准曲线法和标准加入法）a.定性分析原理：吸收曲线：吸收峰的数目、位置、相对强度以及吸收峰的形状.b.定量分析原理：根据朗伯－比耳定律：A=εbc，当入射光波长λ及光程b一定时，在一定浓度范围内，有色物质的吸光度A与该物质的浓度c 成正比。
定量分析常用的方法是标准曲线法即只要绘出以吸光度A为纵坐标，浓度c为横坐标的标准曲线，测出试液的吸光度，就可以由标准曲线查得对应的浓度值，即未知样的含量。
c.仪器组成部件:各种类型的紫外-可见分光光度计，如下图所示，从总体上来说是由五个部分组成，即光源、单色器、吸收池、检测器和信号显示记录装置。
2.本实验采用紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验原理：（1）蛋白质可作定量分析的原因：蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，所以蛋白质溶液在275--280nm具有一个吸收紫外吸收高峰。
在一定浓度范围内，蛋白质溶液在最大吸收波长处的吸光度与其浓度成正比，服从朗伯-比耳定律，因此可作定量分析。
该法测定蛋白质的浓度范围为0.1—1.0mg/mL。
（2）此种方法测量的准确度差一点的原因：由于不同蛋白质中酪氨酸和色氨酸的含量不同，所处的微环境也不同，所以不同蛋白质溶液在280nm的光吸收职也不同。
据初步统计，浓度为1.0 mg/mL的1800种蛋白质及蛋白质亚基在280nm的吸光度在0.3—3.0之间，平均值为1.25+/-0.51。