分光光度法检测蛋白质含量

【操作步骤】
（一）制作标准曲线 1.取试管6支，编号，按下表操作。 试剂（ml） 1 2 3 4 5 6
标准蛋白质溶液 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 0 生理盐水 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 4.0
混匀，盛于石英杯中，用紫外分光光度计，以第6管调“0” ，在 280nm波长下测定各管光密度，以各管的光密度值为纵座标，以蛋 白质浓度为横座标绘制标准曲线图。 （二）标本测定：取标本1.0ml，加入生理盐水3.0ml，测A280标准曲 线上读出浓度。
（二）样品测定：
取样品0.1ml，加生理盐水0.9m1，再加双缩脲试剂4m1 ，于37℃水浴中放置15分钟，测其吸光度，根据吸光度值 查标准曲线并计算得出样品中蛋白质的浓度。 注意：
❖双缩脲法的灵敏度为1-20mg，取蛋白标准液时注意浓度。 ❖实验时， 样品管可与标准管同时处理
实验三 考马斯亮兰结合法测定蛋白质含量
实验: 利用分光光度技术进行蛋白质含量测定 1.双缩脲法测定蛋白质含量 2.考马斯亮兰结合法测定蛋白质含量 3.紫外分光光度法测定蛋白质含量
分光光度技术（Spectrophotography）
一、概念 利用物质特有的吸收光谱来鉴别物质或测定
其含量的一项技术 。 应用：定性、定量 优点：灵敏度高 精确度高 操作简便、快速
•【操作步骤】
•（一）标准曲线的绘制
•1. 取小试管6支，编号按下表操作
试 剂 （ml） 标准蛋白质溶液
1
2
3
4
56
0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 —
生理盐水 双缩脲试剂
0.9 0.7 0.5 0.3 0.1 1.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0
• 2．混合后，于37℃水浴中放置15分钟，在540nm波长下比色 ，以 • 第6管调零，测得各管的吸光度值。以各管的吸光度值为纵 • 座标，蛋白质浓度为横座标，绘成曲线。
一束单色光通过某溶液时，光波被溶液吸收一 部分，吸收多少与溶液的浓度和溶液厚度成正比。
A=εCL
• A：吸光度； C：溶液浓度； L：液层厚度 • ε：即摩尔吸光系数，指一定波长时，溶液的浓度 为1 mol/L，光程为 1cm时的吸光度值 。 • *在波长、溶液和温度确定的情况下，ε由物质的 特性决定的。
实验考试
•平时表现
•实验课成绩 •实验测验
原理
•实验报告 ----格式 结果
•操作考试
分析
实验报告网上提交
实验报告采取网上提交的方式，实验报告提交时间设定为3天，即本次 实验结束后第三天晚上12点之前提交，过期无法再提交，本次实验报 告则记为0分。
尽早提交报告，不要等到最后期限，有时系统不稳定，可能提交不上去 。
分光光度计 (spectrophotometer)
一．基本部件
•光源
•钨灯 •氢灯
•单色 器•棱镜
•光栅
•吸收池
•比色皿/ •比色池
•狭缝
•检测系统、测量装置
二 、分光光度计使用步骤（示教） 三、使用时注意事项**
1. 波长选择。 2. 机器预热。 3. 不测量时，应使样品室盖处于开启状态，否 则会使光电管疲劳。 4. 不应把成有腐蚀性液体的比色皿放在仪器表 面。
【基本原理】
考马斯亮兰G-250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色 。它和蛋白质可通过范德华力结合，与蛋白质结合后颜色由 红色转变成蓝色，最大吸收峰从465nm变成595nm，能过测 定595nm处的光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
优点：灵敏度高，1-5μg；测定速度快；干扰物质少。
•【操作步骤】
直接将报告粘贴在框中，切记不要以附件方式上传，否则有可能文件打 不开，影响成绩。
不要相互抄袭，一旦发现雷同卷则均记为0分。 若过期没有提交报告，不要将报告发到老师邮箱，发也没用，最终实验
报告成绩只记系统导出的成绩。
实验一
分光光度技术及蛋白含量测定
理论 掌握分光光度技术的基本原理 了解分光光度计的基本构造
二、工作原理
物质对光线有选择性吸收作用。 每种物质都具有其特征性的吸收光谱。 在一定条件下，物质对光的吸收程度与该物质
的浓度成正比。
•分光光度法所使用的光谱范围： 200nm ~ 10µm
• 200~400nm 400~760nm 760~10µm • 紫外光区 可见光区 红外光区
如何定性？
获得测定物的浓度。
标准曲线使用注意事项
❖ 标准曲线范围在测定浓度的一半到二倍之间。 ❖ 吸光度在0.05～1.0范围内。 ❖ 所作标准曲线仅供短期使用。 ❖ 标准曲线制作与测定管测定应在同一台仪器上进行
，避免误差产生。
5．应用中注意的问题***
❖ Lambert-beer’s law的偏离：该定律只适应于一定浓度 范围，A宜在0.05～1.0之间；
用水冲洗比色皿3～4次。 * 本次实验，考马斯亮蓝可使玻璃比色皿着色，
酒精浸泡后清洗。
蛋白质定量分析实验
实验一 双缩脲法测定蛋白质含量 （p50） 实验三 考马斯亮兰结合法测定蛋白质含量（p52） 实验四 紫外分光光度法测定蛋白质含量 （p53）
实验一 双缩脲法测定蛋白质含量
【基本原理】
蛋白质分子中含有许多肽键，与双缩脲结构类似，在碱性溶 液中能与铜离子结合成紫色的化合物（称双缩脲反应）。 在一定浓度范围，颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，故可用 比色法测定蛋白质的含量。 含有两个以上肽键的物质才有此反应，故氨基酸无此反应。 双缩脲法的灵敏度为1-20mg。
分光光度法检测蛋白质含量
生物化学与分子生物学实验
实验室规则 实验室安全及防护 实验室常用玻璃仪器 实验考试
实验室规则
提前5分钟到实验室，不能迟到、早退、旷课，每迟到、早退一 次扣1分，每旷课一次扣5分。
禁止在实验室内吃食品，如有违反者按迟到处理。 上课必须穿隔离衣，不能穿拖鞋和吊带背心，否则禁止进入实验
•小鼠肝脏组织总蛋白的提取
1. 颈椎脱臼处死小鼠，剪开腹部，取出肝脏组织，置于平皿中 用PBS清洗。
2. 称取100mg肝组织，剪碎，并转移到匀浆器中。 3. 将1mL 预冷的裂解缓冲液加入匀浆器中，冰浴条件下充分
研磨。将组织研磨液转移到1.5mL的离心管中。 4. 离心（13000rpm，5min），取上清液转移至一新的
注意：蛋白标准液浓度50 µg/ml
实验四 紫外分光光度分子中含有酪氨酸，色氨酸等芳香 族氨基酸，因而蛋白质具有吸收紫外光的性质，吸 收高峰在280nm波长处。由于各种蛋白质所含芳香 族氨基酸的量相差很少，因此在此波长范围内，吸 收峰的光密度值与其浓度成正比关系，可作定量测 定。 灵敏度：50-100μg
❖ 选择波长：最大吸收波长； a.灵敏；b.避免杂质干扰
❖ 参比溶液（空白管）：消除背景效应，应包含除待测 溶质以外所有的成分。
空白管：
测量过程中，因比色皿本身和溶剂也会产生一定的光 吸收，故设置一个空白管，即其中除了待测溶质以外， 其它的成分完全相同。
测量时，首先以空白管对准光路对仪器调零，既消除 比色皿本身对光的吸收，又消除了非待测物对光的吸收 ，所测值即为待测物造成的光吸收。
4.计算*** （1）标准管法（标准比较法）
实际测定过程中，用一已知浓度的测定物按测定管 同样处理显色，读出吸光度，再根据前式计算。
A标准=ε标准C标准L标准 A样品=ε样品C样品L样品 A：吸光度； ε：摩尔吸光度； C：溶液浓度； L：液层厚度
因标准液和样品液中溶质为同一物质， ε样品= ε标准
一束单色光通过一光吸收介质时，其光强度随吸收光介质的厚度增
加呈指数减少。 I1/I0=e-K1l
2.比尔（Beer）定律
一束单色光通过一光吸收介质时，其光强度随吸收光介质的浓度的
增加呈指数减少。 I1/I0=e-K2C
I0 :入射光强度； I :透射光强度；l ：介质厚度 C ：介质浓度
mbert - Beer定律***
—利用吸收光谱曲线鉴定化合物
吸收光谱曲线：
以不同波长的单色光作为入射光，测 定某一溶液的吸光度，以波长为横轴 ，吸光度为纵轴作图，得到溶液的吸 收光谱曲线。
每种物质有其特征性的吸收光谱， 故可作为定性分析的依据。
•吸 光 度
如何定量？ — Lambert-Beer定律***
1.朗伯（Lambert）定律
室。 实验期间手机必须设置在振动上，上课期间如急需接、打电话请
到走廊上处理。 在实验室内要保持安静，不得嬉闹、大声说话。 认真预习 认真做实验 养成良好的实验习惯（实验中、实验结束后） 值日生工作
实验室安全及防护
预防火灾 预防中毒 外伤
实验室常用玻璃仪器
吸量管***(示教) 试管 烧杯 量筒
因盛标准液和测定液的比色杯径长相同 L样品=L标准
故上二式可写成： A标准/A样品= ε标准C标准L标准/ε样品C样品L样品 C样品=A样品/A标准 ×C标准
•吸光度
（2）标准曲线法
➢ 绘制标准曲线： •浓度
配制一系列已知不同浓度的测定物溶液，按测定管同样方法 处理显色，分别读取各管吸光度。以溶液浓度为横座标，吸 光度为纵座标，在方格座标纸上作图得标准曲线。 ➢ 获取样品的浓度：根据测得样品的吸光度值从标准曲线上
1.5ml离心管中，即为组织蛋白粗提取液。
•注意：实验一用原液，实验三和实验四将原液进行50倍稀释 。
5. 比色皿使用注意事项***
由于紫外光不能透过玻璃比色皿，紫外光区测
量时要用石英比色皿。 同组使用的比色皿必须配套（规格、新旧程度
一致）。 比色皿有2光面与2毛面，光学表面对准光路，
不能有任何污损，否则会引起光吸收的增加。
❖ 比色皿中所盛溶液不能太少，也不能太多，一般