基因工程药物——促红细胞生成素

EPO的销售情况 的销售情况
重组促红细胞生成素，也称超级“重磅炸弹” 重组促红细胞生成素，也称超级“重磅炸弹”基因 药物 。 1985年科学家应用基因重组技术，在实验室获得重 年科学家应用基因重组技术， 年科学家应用基因重组技术 组人EPO（rhEPO）， ），1989年安进 Amgen） 年安进（ 组人EPO（rhEPO），1989年安进（Amgen）公 司的第一个基因重组药物Epogen获得 获得FDA的批准 的批准， 司的第一个基因重组药物Epogen获得FDA的批准， 适应症为慢性肾功能衰竭导致的贫血、 适应症为慢性肾功能衰竭导致的贫血、恶性肿瘤或 化疗导致的贫血、失血后贫血等，其市场表现不俗， 化疗导致的贫血、失血后贫血等，其市场表现不俗， 1999年销售值达到 年销售值达到17.6亿美元，2000年19.6亿美元， 亿美元， 亿美元， 年销售值达到 亿美元 年 亿美元 2002年22.6亿美元，2003年24.4亿美元，成为名副 亿美元， 亿美元， 年 亿美元 年 亿美元 其实的“重磅炸弹”基因药物。 其实的“重磅炸弹”基因药物。
安进（ 安进（Amgen）开发的用于治疗恶性贫血症的第二 ） 代促红细胞生成素新产品Arnesp2001年得到 年得到FDA 代促红细胞生成素新产品 年得到 的批准， 年初正式上市。 的批准，Arnesp2002年初正式上市。 年初正式上市 Arnesp：是一种“高糖基化”促红素产品。其促进 ：是一种“高糖基化”促红素产品。 红细胞生成的能力大大优于第一代EPO（促红细胞 红细胞生成的能力大大优于第一代 （ 生成素）产品。第一年上市即大获全胜， 生成素）产品。第一年上市即大获全胜，赢得开们 年全年销售额为4.2亿美元 红，Arnesp2002年全年销售额为 亿美元，2003 年全年销售额为 亿美元， 年全年销售额为15.4亿美元。 亿美元。 年全年销售额为 亿美元 估计在今后3年内 年内， 将创造10亿 估计在今后 年内，Arnesp将创造 亿~15亿美元 将创造 亿美元 的市场销售额并夺取现有EPO生产商的部分市场， 生产商的部分市场， 的市场销售额并夺取现有 生产商的部分市场 其市场前景不可估量。 其市场前景不可估量。
EPO的市场前景 的市场前景
目前，国内已有 多家单位获准生产红细胞 目前，国内已有10多家单位获准生产红细胞 生成素。沈阳三生和上海麒麟鲲鹏（中国） 生成素。沈阳三生和上海麒麟鲲鹏（中国） 生物药业的产品在国内医院的销售额独领风 骚，2001年EPO的国内医院销售总额约为 年 的国内医院销售总额约为 47449万元，2002年为 万元， 年为49508万元，2003年 万元， 万元 年为 万元 年 上半年为28606万元。 万元。 上半年为 万元 估计国内的年市场容量在20到 亿元左右 亿元左右， 估计国内的年市场容量在 到30亿元左右， 但目前年销售额只有区区5亿元左右 亿元左右。 但目前年销售额只有区区 亿元左右。 综上所述， 的市场前景非常可观。 综上所述，EPO的市场前景非常可观 的市场前景非常可观
结果：收集的rHuEPO保留时间约为 保留时间约为45min 结果：收集的rHuEPO保留时间约为45min
比活性约为1.5*10 U/g蛋白 比活性约为1.5*108U/g蛋白；纯度 〉98%（SDS蛋白； 98%（SDSPAGE检测 PAGE检测） 检测） 免疫原性检测： 免疫原性检测：Western blot
步骤太多，对设备及操 、 的七步法： 的七步法 纯化步骤太多， 作要求也较高，不适合工业生产的特点。 作要求也较高，不适合工业生产的特点。 2、Spivik利用凝集素亲和层析纯化 利用凝集素亲和层析纯化EPO：由于凝 、 利用凝集素亲和层析纯化 ： 集素亲和层析凝胶易被杂蛋白不可逆吸附， 集素亲和层析凝胶易被杂蛋白不可逆吸附，使得分 离效果降低，成本增高，也不利于大规模生产。 离效果降低，成本增高，也不利于大规模生产。 3、近年来则利用三步层析法三步纯化基本流程 、 等。
第二步： 第二步：离子交换柱
DEAE型离子交换柱 DEAE型离子交换柱
流程： 流程：
10mmol/L Tris.HCl(pH7.5)缓冲液平 Tris.HCl(pH7.5)缓冲液 缓冲液平 上样 20ml/min（柱结合量20mg/ml） 20ml/min（柱结合量20mg/ml） 10mmol/L Tris.HCl(pH7.5)缓冲液平衡至基线 Tris.HCl(pH7.5)缓冲液平衡 缓冲液平衡至基线 添加NaCl入缓冲液 进行截状梯度洗脱 NaCl浓 入缓冲液， 截状梯度洗脱（ 添加NaCl入缓冲液，进行截状梯度洗脱（NaCl浓 度分别为：50，70，125mmol/L） 度分别为：50，70，125mmol/L）
C6 反相柱（2cm*2cm） （创新生物技术 反相柱（2cm*2cm） 公司） 公司）
流程： 流程：
上样 50ml/min（柱结合量约5mg蛋白/ml介质) 50ml/min（柱结合量约5mg蛋白 介质 蛋白/ml介质) 去离子水平衡至检测基线 去离子水平衡至检测基线 10%~80%乙醇胍 10%~80%乙醇胍线性梯度洗脱 乙醇胍线性梯度洗脱 检测并收集含EPO主峰 检测并收集含EPO主峰 ELISA测定 ELISA测定
EPO的工艺流程 的工艺流程
——②三步纯化基本流程 ② 第一步：反相柱色谱 样品浓缩约96.7% 第一步： 样品浓缩约96.7% 透析 第二步： DEAE第二步： DEAE-离子交换色谱 第三步： 第三步： 分子筛色谱
总回收率 〉30% U/g蛋白 比活 1.5*108U/g蛋白
第一步： 第一步：反相色谱
结果： ELISA检测盒表明 检测盒表明75mmol/L洗脱峰 结果： ELISA检测盒表明75mmol/L洗脱峰
中含EPO 中含EPO
第三步： 第三步：分子筛色谱
Sephacryl S-200 色谱分析 S-
流程： 流程：
上样体积 80ml 流速 2ml/min 柠檬酸钠流动相 20mmol/L 柠檬酸钠- 100mmol/L NaCl 缓冲液
基因工程药物 ——促红细胞生成素 促红细胞生成素 （EPO） ）
EPO 的概念
EPO的用途 的 及其疗效 及其疗效 EPO的纯化历 的 史及工艺流程 EPO的销售情 的 情况及其 及其前景 情况及其前景
什么是EPO？
EPO：是促红细胞生成素（Erythropoietin）的英 ：是促红细胞生成素（ ） 文简称。 文简称。 促红细胞生成素： 促红细胞生成素：最初是从肾脏中分离出来能刺激 前体红细胞增生、分化的一种细胞因子。 前体红细胞增生、分化的一种细胞因子。 人体血液中的促红细胞生成素： 人体血液中的促红细胞生成素：是由肾脏和肝脏分 泌的一种激素样物质，能够促进红细胞生成。 泌的一种激素样物质，能够促进红细胞生成。它与 其受体(EPO-R)结合后共同介导缺氧的生理反应 结合后共同介导缺氧的生理反应。 其受体 结合后共同介导缺氧的生理反应
EPO的 疗效 的
1、肾性贫血患者EPO水平较低，在进行治疗过程 、肾性贫血患者 水平较低， 水平较低 中，往往通过注射EPO来提高体内 往往通过注射 来提高体内EPO水平进行治 水平进行治 来提高体内 从而帮助病人增加红细胞数量，此时EPO水平 疗，从而帮助病人增加红细胞数量，此时 水平 有所上升。 有所上升。 2、其他贫血如缺铁性贫血、巨细胞性贫血患者 、其他贫血如缺铁性贫血、 EPO水平不降低，但也可以使用 水平不降低， 治疗， 水平不降低 但也可以使用EPO治疗，此时浓 治疗 度也会有所升高。 度也会有所升高。 3、再生障碍性贫血和骨髓造血功能不全患者 、再生障碍性贫血和骨髓造血功能不全患者EPO 水平升高。 水平升高。
EPO的工艺流程 的工艺流程
——①三步层析法 ① 1、 染料配基亲和层析→反相疏水层析→离 染料配基亲和层析→反相疏水层析→ 子交换层析; 子交换层析; 2、 染料配基亲和层析→反相疏水层析→分 染料配基亲和层析→反相疏水层析→ 子筛层析; 子筛层析; 3、 反相疏水层析→离子交换层析→分子筛 反相疏水层析→离子交换层析→ 层析。 层析。
EPO的用途 的用途
医疗用途：增加红血球的数目，用于贫血、 医疗用途：增加红血球的数目，用于贫血、 组织断离、早产儿，用在癌学和血液学方面。 组织断离、早产儿，用在癌学和血液学方面。 体育用途(兴奋剂 兴奋剂)： 体育用途 兴奋剂 ：增加训练耐力和训练负 属于国际奥委会规定的违禁药物。 荷，属于国际奥委会规定的违禁药物。在 2008年北京奥运会中第一例的兴奋剂。 年北京奥运会中第一例的兴奋剂。 年北京奥运会中第一例的兴奋剂
2001年，EPO（包括 年 （包括Arnesp）的全球销售额达 ） 21.1亿美元，2002年达 亿美元， 年达26.8亿美元，2003年全世界 亿美元， 亿美元 年达 亿美元 年全世界 EPO的年销售额超过 亿美元。创下生物工程药品 的年销售额超过50亿美元 的年销售额超过 亿美元。 单个品种之最，是当今最成功的基因工程药物。 单个品种之最，是当今最成功的基因工程药物。 强生（ 强生（Johnson&Johnson）公司的促红细胞生成 ） 更是表现不俗， 素Procrit/Eprex更是表现不俗，2001年销售额 更是表现不俗 年销售额 34.42亿美元，2002年销售额 亿美元， 年销售额42.69亿美元， 2003 亿美元， 亿美元 年销售额 亿美元 年销售收入达到39.84亿美元。 亿美元。 年销售收入达到 亿美元
结果：60%乙醇-1mol/L盐酸胍洗出EPO 结果：60%乙醇 1mol/L盐酸胍洗出EPO 乙醇-
透析
透析液：10倍体积的10mmol/L Tris.HCl 倍体积的10mmol/L 透析液：10倍体积的 (pH 7.5)-2%蔗糖缓冲液 7.5)-2%蔗糖缓冲液 透析次数： 透析次数：2 时间： 时间：5~6h