条件性敲除的原理
分子生物学思考题答案
1.原核生物DNA具有哪些不同于真核生物DNA的特征？真核生物：①真核基因组庞大。
②存在大量的重复序列。
③大部分为非编码序列(>90％)。
④转录产物为单顺反子。
⑤是断裂基因，有内含子结构。
⑥存在大量的顺式作用元件(启动子、增强子、沉默子)。
⑦存在大量的DNA多态性。
⑧具有端粒(telomere)结构原核生物：①基因组很小，大多只有一条染色体，且DNA含量少。
②主要是单拷贝基因，只有很少数基因〔如rRNA基因〕以多拷贝形式存在。
③整个染色体DNA几乎全部由功能基因与调控序列所组成；④几乎每个基因序列都与它所编码的蛋白质序列呈线性对应状态1.试述基因克隆载体进化过程。
①pSC101质粒载体，第一个基因克隆载体②ColE1质粒载体，松弛型复制控制的多拷贝质粒③pBR322质粒载体，具有较小的分子量（4363 bp）。
能携带6-8 kb的外源DNA片段，操作较为便利④pUC质粒载体，具有更小的分子量和更高的拷贝数⑤pGEM-3Z质粒，编码有一个氨苄青霉素抗性基因和一个lacZ'基因⑥穿梭质粒载体，由人工构建的具有原核和真核两种不同复制起点和选择标记，可在不同的寄主细胞内存活和复制的质粒载体⑦pBluescript噬菌粒载体，一类从pUC载体派生而来的噬菌粒载体2.试述PCR扩增的原理和步骤。
对比DNA体内复制的差异。
原理：首先将双链DNA分子在临近沸点的温度下加热分离成两条单链DNA分子，DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸、合适的Mg2+浓度和实验中提供的引物序列合成新生的DNA分子。
步骤：①将含有待扩增DNA样品的反应混合物放置在高温（>94℃）环境下加热1分钟，使双链DNA变性，形成单链模板DNA②降低反应温度（退火，约50℃），约1分钟，使寡核苷酸引物与两条单链模板DNA结合在靶DNA区段两端的互补序列位置上③将反应混合物的温度上升到72℃左右保温1-数分钟，在DNA聚合酶的作用下，从引物的3'-端加入脱氧核苷三磷酸，并沿着模板分子按5'→3'方向延伸，合成新生DNA互补链与体内复制的差别：①PCR不产生冈崎片段②在高温条件下反应，不需要DNA解旋酶③PCR可经过多个循环④在体外进行，可调控第六章1.基因敲除原理：又称基因打靶，通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改造，具有专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点方法：高等动物基因敲除技术，植物基因敲除技术2.完全基因敲除和条件型基因敲除完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或者动植物个体中的靶基因活性，条件型基因敲除是指通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除3.基因定点突变原理：通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，用于研究某个（些）氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造DNA 调控元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等方法：重叠延伸技术和大引物诱变法第七章1.乳糖操纵子的正负调控（—）阻遏蛋白的负调控①当细胞内有诱导物时，诱导物结合阻遏蛋白，此刻聚合酶与启动子形成开放式启动子复合物转录乳糖操纵子结构基因。
分子生物学综述论文(基因敲除技术)
现代分子生物学课程论文题目基因敲除技术班别生物技术10-2学号 *********** 姓名陈嘉杰成绩基因敲除技术的研究进展要摘基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
此后经历了近20年的推广和应用，直到2007年10月8日，美国科学家马里奥•卡佩奇（Mario Capecchi）和奥利弗•史密西斯（Oliver Smithies）、英国科学家马丁•埃文斯（Martin Evans）因为在利用胚胎干细胞对小鼠基因金星定向修饰原理方面的系列发现分享了2007年诺贝尔生理学或医学奖。
基因敲除技术从此得到关注和肯定，并对医学生物学研究做出了重大贡献。
本文就基因敲除的研究进展作一个简单的综述。
关键词基因敲除、RNAi、生物模型、同源重组前言基因敲除又称基因打靶，该技术通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改制，具有转移性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点。
应用DNA同源重组技术将灭活的基因导入小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cells，ES cells）以取代目的基因，再筛选出已靶向灭活的细胞，微注射入小鼠囊胚。
该细胞参与胚胎发育形成嵌合型小鼠，再进一步传代培育可得到纯合基因敲除小鼠。
基因敲除小鼠模型的建立使许多与人类疾病相关的新基因的功能得到阐明，使现代生物学及医学研究领域取得了突破性进展。
上述起源于80年代末期的基因敲除技术为第一代技术，属完全性基因敲除，不具备时间和区域特异性。
关于第二代区域和组织特异性基因敲除技术的研究始于1993年。
Tsien等[1]于1996年在《Cell》首先报道了第一个脑区特异性的基因敲除动物，被誉为条件性基因敲除研究的里程碑。
该技术以Cre/LoxP系统为基础，Cre在哪种组织细胞中表达，基因敲除就发生在哪种组织细胞中。
2000年Shimizu等[2]于《Science》报道了以时间可调性和区域特异性为标志的第三代基因敲除技术，其同样以Cre/LoxP系统为基础，利用四环素等诱导Cre的表达。
基因敲除技术的原理、方法和应用
基因敲除技术的原理、方法和应用2010-01-24 17:03:43 来源：易生物实验浏览次数：6302 网友评论 0 条1．基因敲除概述2．实现基因敲除的多种原理和方法：2.1.利用基因同源重组进行基因敲除 2.2利用随机插入突变进行基因敲除。
2.3.RNAi引起的基因敲除。
3．基因敲除技术的应用及前景4．基因敲除技术的缺陷关键词：基因敲除1．基因敲除概述：基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。
随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。
2．实现基因敲除的多种原理和方法：2．1．利用基因同源重组进行基因敲除基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。
80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。
1985 年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。
到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型 [1]。
直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。
2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1)：a．基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。
基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。
b．ES 细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。
常用的鼠的种系是１２９及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。
条件性基因敲除的基本原理Cre
条件性基因敲除的基本原理Cre／loxP重组系统条件性基因敲除主要是通过Cre／10xP或者Ftp／FRT重组系统来实现的。
这两个系统都是位点特异性重组酶系统，已发展成为在体内、外进行遗传操作的有力工具。
这两个系统的应用，可以使靶基因的表达或缺失发生在试验动物发育的某一阶段或某一特定的组织器官。
此外，若与控制Cre或Flp表达的其他诱导系统相结合，还可以对某一基因同时实现时空两方面的调控。
1．Cre／loxP系统的原理Cre／loxP系统来源于F1噬菌体，可以介导位点特异的DNA重组。
该系统含有两种成分：①一段长34bp的DNA序列，含有两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的核心序列。
这段34bp序列是重组酶识别的位点，被称为loxP位点(10cus of X—over in P1)。
②Cre重组酶(cyclizationrecombination)，它是一种由343个氨基酸组成的单体蛋白，可以引发loxP位点的DNA重组。
任何序列的DNA，当其位于两个loxP位点之间的时候，在Cre重组酶的作用下要么被缺失(两个loxP 位点的方向相同)，要么方向发生倒转(两loxP位点的方向相反)，如图所示。
Cre／loxP系统的作用机制2．Cre／loxP系统优点Cre／10xP系统之所以在基因敲除中获得了非常广泛的应用，是由该系统的诸多优点决定的：①Cre重组酶与具有loxP位点的DNA片断形成复合物后，可以提供足够的能量引发之后的DNA重组过程，因此该系统不需要细胞或者生物体提供其他的辅助因子；②loxP位点是一段较短的DNA序列，因此非常容易合成；③Cre重组酶是一种比较稳定的蛋白质，因此可以在生物体不同的组织、不同的生理条件下发挥作用；④Cre重组酶的编码基因可以置于任何一种启动子的调控之下，从而使这种重组酶在生物体不同的细胞、组织、器官，以及不同的发育阶段或不同的生理条件下产生，进而发挥作用，这一点也是该系统在应用过程中最为重要的一点。
基因敲除小鼠技术
转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，并逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业一、技术介绍与研究进展转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，在小鼠模型构建方面日趋完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样，逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。
尽管如此，传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等，而ZFN和TALEN等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。
二、同源重组技术原理基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，首次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这一技术称为"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"（gene knockout），利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。
同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。
条件性敲除的原理
条件性敲除的原理（图2，3）：利用Cre／LoxP 和来自酵母的FLP—frt 系统可以研究特定组织器官或特定细胞中靶基因灭活所导致的表型[7]。
通过常规基因打靶在基因组的靶位点上装上两个同向排列的1oxP，并以此两侧装接上loxP 的(“loxP floxed”)ES 细胞产生“loxPfloxed”小鼠,然后，通过将“lo xP floxed”小鼠与Cre 转基因鼠杂交(也可以其他方式向小鼠中引入Cre 重组酶)，产生靶基因发生特定方式(如特定的组织特异性)修饰的条件性突变小鼠。
在“loxP floxed”小鼠，虽然靶基因的两侧已各装上了一个loxP，但靶基因并没有发生其他的变化，故“1oxP noxed”小鼠表型仍同野生型的一样。
但当它与Cre 转基因小鼠杂交时，产生的子代中将同时带有“loxP floxed”靶基因和Cre 基因。
Cre 基因表达产生的Cre 重组酶就会介导靶基因两侧的1oxP 间发生切除反应，结果将一个loxP 和靶基因切除。
这样，靶基因的修饰(切除)是以Cre 的表达为前提的。
Cre 的表达特性决定了靶基因的修饰(切除)持性：即Cre 在哪一种组织细胞中表达，靶基因的修饰(切除)就发生在哪种组织细胞；而Cre 的表达水平将影响靶基因在此种组织细胞中进行修饰的效率。
所以只要控制Cre 的表达特异性和表达水平就可实现对小鼠中靶基因修饰的特异性和程度[9,10]。
在生理学研究中，为了明确某一组织或器官的功能，常将实验动物体内所要研究的组织或器官切除，进而根据实验动物的生理指标或功能的变化来推测切除部分的功能。
生命科学发展到今天，人们对于生命现象的认识已经逐步深入到了分子水平，而上述的“部分切除—观察整体—推测功能”的研究思想仍然有效。
具体地说，就是在分子水平破坏想要研究的基因，然后观察生物体的生理指标、功能、整体形态、组织结构、发育过程的变化等，进而推测相应基因的功能。
这种研究过程称为基因敲除(gene knock out)。
几种基因敲除鼠简介
目录
• 基因敲除鼠概述 • 条件性基因敲除鼠 • 全敲除鼠 • 诱导性基因敲除鼠
01 基因敲除鼠概述
基因敲除鼠的定义
• 基因敲除鼠：通过基因工程技术，将特定基因从 老鼠体内敲除，从而产生具有特定表型特征的转 基因动物。
基因敲除鼠的用途
疾病模型
药物筛选
基因敲除鼠可以模拟人类遗传性疾病 的发生和发展过程，用于研究疾病的 发病机制和治疗方法。
全敲除鼠通常是通过将经过基因 编辑的胚胎干细胞注入早期胚胎 中，然后移植到代孕母鼠体内发
育而成。
全敲除鼠的应用
01
02
03
疾病研究
全敲除鼠可以模拟人类遗 传性疾病，用于研究疾病 的发病机制、病理生理变 化和药物筛选等。
药物研发
全敲除鼠可以用于评估新 药对特定基因缺陷的治疗 效果，加速药物的研发进 程。
部分基因敲除鼠
03
将特定基因部分敲除或敲低，产生具有部分缺失或降低该基因
表达的转基因动物。
02 条件性基因敲除鼠
条件性基因敲除鼠的原理
条件性基因敲除鼠是通过基因打靶技术，将特 定基因的启动子替换为可诱导的启动子，使得 基因的表达只在特定条件下被激活或沉默。
可诱导的启动子通常来源于激素响应元件或化 学诱导系统，如四环素响应系统、干扰素响应 系统等。
药物研发
利用条件性基因敲除鼠可以筛选出 对特定疾病有疗效的药物，缩短药 物研发周期并提高成功率。
条件性基因敲除鼠的优缺点
优点
条件性基因敲除鼠具有高度特异性，可以避免全身敲除基因带来的副作用；同 时，可以在特定时间和空间范围内研究基因的功能，提高实验的可控性和精确 度。
缺点
条件性基因敲除鼠的构建过程复杂，需要较高的技术要求和时间成本；同时， 诱导系统的效果可能受到多种因素的影响，如激素水平、给药方式等。
第九章 基因敲除与药学
三、筛选与鉴定
标记筛选法：正负筛选法(PNS法) 标记筛选法：正负筛选法 法
含正、负两种选择性标记基因，前者插入或取代 载体上同源序列的关键外显子，后者位于同源序列的 外侧。转染ES细胞后 （1）末整合入外源基因(大多数， neo－/HSV-tk－)： 在含G418培养基中（－） （2）随机插入 (neo＋/HSV-tk＋)：在含更昔洛韦的培 养基中（－） （3）同源重组 (neo＋/HSV-tk－)，在含有G418和更 昔洛韦的培养基中生长。
全部“敲 全部“ 除”
受精卵
没能提高 “同源重 组”的效 率
需要成千 上万个受 精卵
天无绝人之路 英国的马丁· 英国的马丁·埃文斯博士
模仿“囊胚”中的微环境， 模仿“囊胚”中的微环境， 让培养皿中的干细胞无限 繁殖下去， 繁殖下去，同时又完整地 保留干细胞的“全能” 保留干细胞的“全能”特 性
成为在实验室条件下成功地繁殖 胚胎干细胞的世界第一人， 胚胎干细胞的世界第一人，为 基因靶向” “基因靶向”技术提供了足够多 的靶细胞
一、条件性基因敲除
利用Cre／LoxP实现靶基因的切除原理
一、条件性基因敲除
条件性基因敲除的程序分为两步： 条件性基因敲除的程序分为两步： 产生目标序列被两个重组酶识别位 点锚定的“ 点锚定的“Loxp floxed”动物 动物 动物与cre转基因 “Loxp floxed”动物与 动物与 转基因 动物杂交， 动物杂交，产生条件性基因敲除动 物
3.磷酸钙法 磷酸钙法
二、基因敲除载体导入ES细胞 基因敲除载体导入 细胞
将待转染的 DNA溶解在磷 溶解在磷 酸缓冲液中， 酸缓冲液中， 加入CaCl2后， 加入 DNA片段与磷 片段与磷 酸钙共沉淀并 形成大的颗粒； 形成大的颗粒； 将此颗粒悬浮 液加入贴壁培 养的细胞中， 养的细胞中， 外源DNA就被 外源 就被 靶细胞所吸收， 靶细胞所吸收， 进而实现转基 因。
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条件性敲除的原理（图2，3）：
利用Cre／LoxP 和来自酵母的FLP—frt 系统可以研究特定组织器官或特定细胞中靶基因灭活所导致的表型[7]。
通过常规基因打靶在基因组的靶位点上装上两个同向排列的1oxP，并以此两侧装接上loxP 的(“loxP floxed”)ES 细胞产生“loxPfloxed”小鼠,然后，通过将“lo xP floxed”小鼠与Cre 转基因鼠杂交(也可以其他方式向小鼠中引入Cre 重组酶)，产生靶基因发生特定方式(如特定的组织特异性)修饰的条件性突变小鼠。
在“loxP floxed”小鼠，虽然靶基因的两侧已各装上了一个loxP，但靶基因并没有发生其他的变化，故“1oxP noxed”小鼠表型仍同野生型的一样。
但当它与Cre 转基因小鼠杂交时，产生的子代中将同时带有“loxP floxed”靶基因和Cre 基因。
Cre 基因表达产生的Cre 重组酶就会介导靶基因两侧的1oxP 间发生切除反应，结果将一个loxP 和靶基因切除。
这样，靶基因的修饰(切除)是以Cre 的表达为前提的。
Cre 的表达特性决定了靶基因的修饰(切除)持性：即Cre 在哪一种组织细胞中表达，靶基因的修饰(切除)就发生在哪种组织细胞；而Cre 的表达水平将影响靶基因在此种组织细胞中进行修饰的效率。
所以只要控制Cre 的表达特异性和表达水平就可实现对小鼠中靶基因修饰的特异性和程度[9,10]。
在生理学研究中，为了明确某一组织或器官的功能，常将实验动物体内所要研究的组织或器官切除，进而根据实验动物的生理指标或功能的变化来推测切除部分的功能。
生命科学发展到今天，人们对于生命现象的认识已经逐步深入到了分子水平，而上述的“部分切除—观察整体—推测功能”的研究思想仍然有效。
具体地说，就是在分子水平破坏想要研究的基因，然后观察生物体的生理指标、功能、整体形态、组织结构、发育过程的变化等，进而推测相应基因的功能。
这种研究过程称为基因敲除(gene knock out)。
此外，为了研究某种疾病与某个基因之间的关系，常向生物体内人为引入某个基因，然后观察实验动物出现的各种变化，从而推测疾病与基因的关系，这种研究方法称为基因敲人(gene knock in)。
实现基因敲除的方法有多种，但基本上都是采用同源重组或随机整合的方法，让一段没有生理功能的DNA片段在细胞内取代正常基因，从而破坏正常基因的功能。
基因敲除主要是在胚胎干细胞(embryonic stem ceils，ESC)水平进行操作。
胚胎干细胞是早期胚胎细胞经体外培养建立的全能细胞系，在体外培养时保持了未分化状态，可以传代增殖，在发育上类似于早期胚胎细胞团的细胞，具有与早期胚胎细胞相似的分化潜能和正常整倍体核型两大特点，是研究哺乳动物个体发育、胚胎分化以及性状遗传机制的理想模型。
首先在这种细胞内进行分子水平的基因操作，之后再使这种已经发生了基因改变的细胞发育成为一个完整的生物体。
这样就可以在整个生物体内实现预期的基因改变。
基因敲除的具体实施方法可以简述如下：选择需要研究的目的基因的部分或全部DNA片段，通过分子生物学方法使其产生突变，然后与相应的载体进行重组，成为靶载体。
分离试验动物的胚胎干细胞，在体外将上述靶载体导人到胚胎干细胞内，使其与细胞内相似或相同的序列进行同源重组，替代细胞内原来的基因。
通过一定的筛选方法筛选出发生同源重组的细胞，再将其注入囊胚腔内；把经过上述处理的囊胚重新植入到假孕小鼠的子宫内，使其发育成为一个完整的个体。
含有相应突变基因的嵌合体雄性小鼠与正常雌性小鼠进行交配后，通过筛选可获得携带该突变基因的纯合子小鼠。
通过上述方法所获得的基因敲除小鼠模型，其身体的各种组织、器官以及小鼠生存的各个时期都携带有突变基因，相应基因的功能也发生了变化。
这是一种非常经典的基因敲除方法，该方法对阐明某些基因的功能做出了十分重要的贡献。
但是，对于某些特殊的基因，该方法往往显得无能为力，这些基因在胚胎发育过程中或者在成熟生物体内具有至关重要的功能。
当这些基因突变后，胚胎往往不能发育至正常分娩，或者即使能够出生也会因为过于严重的生理缺陷而过早夭亡，无法开展后续研究，或者这些基因突变后影响到实验动物的繁殖功能而不能产生后代，进而不能获得携带突变基因的纯合子动物模型。
针对上述问题，近年来出现了一种特殊的基因敲除或敲人方法，被称为条件性基因敲除或敲人(conditional gene kn ock out or knock in)。
这种方法是指在特定的组织细胞或者细胞发育的特定阶段敲除某一特定基因的实验技术。
其优势在于克服了经典基因敲除手段所遇到的上述问题，对于在特定的组织细胞和(或)特定的时间研究特定基因的功能，以及更好地建立人类疾病的动物模型都具有十分重要的意义。