条件性基因敲除的策略
CDHR2基因条件性敲除小鼠模型的构建及鉴定
CDHR2基因条件性敲除小鼠模型的构建及鉴定夏梓元;蒋华波;王洋;黄美金;陆斌【摘要】目的:构建CDHR2基因条件性敲除小鼠模型,为研究CDHR2基因的生物学功能提供条件.方法:构建CDHR2基因条件打靶载体,电转入小鼠胚胎干细胞(ES 细胞),用G418和GANC筛选阳性细胞克隆.胚胎注射阳性ES细胞入小鼠囊胚,获得嵌合体小鼠.嵌合体小鼠与Cre小鼠交配获得条件性敲除小鼠.分别通过PCR方法和免疫组织化学方法对CDHR2的敲除结果进行验证.结果:成功构建打靶载体,并获得6个正确同源重组的ES细胞阳性克隆.阳性ES细胞克隆注射入C57BL/6J小鼠的囊胚中,获得5只嵌合鼠.嵌合鼠再与Flp小鼠交配,获得6只阳性F1代去Neo 小鼠.去Neo小鼠与Cre小鼠杂交,获得CDHR2基因肠道特异性敲除小鼠.免疫组织化学检测表明,阳性小鼠肠道组织中的CDHR2基因被特异性敲除,而肾脏组织CDHR2基因的表达没有受到影响.结论:成功构建CDHR2基因肠道特异性敲除小鼠,为进一步研究CDHR2基因的作用奠定了基础.%Objective:To construct a CDHR2 conditional knockout mouse model, and to provide conditions for the study on biological function of CDHR2 gene.Methods:The conditional CDHR2 targeting vector was constructed and transfected into mouse embryonic stem (ES) cells by electroporation.The positive ES cells screened by G418 and GANC were microinjected into the blastocysts of C57BL/6J mice.The chimeric mice were obtained and then mated with Cre mice to obtain conditional CDHR2 knockout mice.The phenotype was analyzed by PCR and immunohistochemistry, respectively.Results:The conditional CDHR2 targeting vector was successfully constructed, with six positive clones of ES cells being obtained.The positive clones of ES cells weremicroinjected into blastocysts of C57BL/6J mice with 5 chimeric mice being obtained.The chimeric mice were mated with Flp mice, and 6 positive F1 generation mice without Neo gene were obtained.Finally, such mice were hybridized with Cre mice to obtain intestine-specific CDHR2 knockout mice.Immunohistochemistry assay showed that the CDHR2 gene in intestinal tracts of the positive mice was specifically knocked out.In contrast, the expression of CDHR2 in kidney tissue was notaffected.Conclusions:The successful construction of intestine-specific CDHR2 knockout mice has laid the foundation for provides a basis for further functional study on CDHR2 gene.【期刊名称】《中国临床医学》【年(卷),期】2017(024)002【总页数】5页(P176-180)【关键词】CDHR2;基因敲除;Cre/loxP系统【作者】夏梓元;蒋华波;王洋;黄美金;陆斌【作者单位】第二军医大学药学院生化药学教研室,上海 200433;第二军医大学药学院生化药学教研室,上海 200433;第二军医大学长海医院病理科,上海 200433;解放军成都军区昆明总医院肿瘤科,昆明 650010;第二军医大学药学院生化药学教研室,上海 200433【正文语种】中文【中图分类】R-33原钙黏蛋白(protocadherin,PCDH)家族是属于钙黏蛋白超家族中的一员，可以根据其基因结构分为集簇型PCDH和非集簇型PCDH两类[1]。
基因敲除小鼠的制作方法
一、常规基因敲除鼠( Conventional Knockout )常规基因敲除是通过基因打靶，把需要敲除的基因的几个重要的外显子或者功能区域用 Neo Cassette 替换掉。
这样的小鼠其全身所有的组织和细胞中都不表达该基因产物。
此类基因敲除鼠一般用于研究某个基因在对小鼠全身生理病理的影响，而且这个基因没有胚胎致死性。
二、条件性基因敲除小鼠( Conditional Knockout )条件性基因敲除小鼠是通过基因打靶，把两个 loxP 位点放到目的基因一个或几个重要的外显子的两边。
该小鼠和表达 Cre 酶小鼠杂交之前，其目的基因表达完全正常。
当和组织特异性表达 Cre 酶的小鼠进行杂交后，可以在特定的组织或细胞中敲除该基因，而该基因在其他组织或细胞表达正常。
条件性基因敲除鼠适用范围为：( 1 )该基因有胚胎致死性；( 2 )用于研究该基因在特定的组织或细胞中的生理病理功能。
三、基因敲入小鼠( Knockin )基因敲入小鼠是通过基因打靶，把目的基因序列敲入到小鼠的相应基因位点，使用小鼠的表达调控元件指导目的基因表达。
此类基因敲入鼠一般用于药物的筛选，信号通路的研究等。
一、 ZFN 技术制作基因敲除鼠ZFN 能够识别并结合指定的基因序列位点，并高效精确地切断。
随后细胞利用天然的DNA 修复过程来实现 DNA 的插入、删除和修改，这样研究人员就能够随心所欲地进行基因组编辑。
这在过去是无法想象的，传统的基因敲除技术依赖细胞内自然发生的同源重组，其效率只有百万分之一，而 ZFN 的基因敲除效率能达到 10% 。
利用这些技术进行小鼠基因的定点敲除和敲入，可以把时间从一年缩短到几个月。
这项技术中设计特异性的 ZFN 是最关键的环节，目前研究者采用计算生物学方法设计高特异性的 ZFN，但 ZFN的脱靶( off target )，也就是把不该切的地方切了的问题仍是一个挑战。
也正因为这个原因，利用 ZFN 技术进行小鼠的基因修饰还无法完全取代传统技术。
分子生物学课件：基因敲除
Neo gene Neor基因进入ES细胞的基因组 在G418、单核苷酸类似物的培养 基中，可以存活。
P53 gene Neo gene HSV-Tk
Neor基因和HSV-TK基因同时进入ES 细胞的基因组 在G418培养基中存活，但是含有单核苷 酸类似物培养基中死亡。
2
3A
3B
嵌合体
与阴性小鼠 交配
1
3D
基因敲除的 纯合子小鼠
杂合子小鼠
3C
扩展知识：
上述基因打靶策略虽然实现了目标基因的特异失活， 但基因组中引入了一个外源标记的基因（NeoR), 该基因会 影响机体正常的功能。怎么改进？
有些基因是胚胎生长发育过程中非常重要的基因，一旦被 敲除可导致胚胎发育受损甚至不能发育为一个个体, 针对这 类基因如何采用基因敲除技术进行研究呢？
➢ 如果Tk 基因进入细胞，在含单核苷酸类似物的培养基中生长时会 因为以上分解反应产生的有毒物质而死亡
筛选标志在这个过程中如何发挥作用的？
正负筛选系统பைடு நூலகம்作原理
1. 同源重组
10-5-10-6
Neo HSV-Tk P53 gene
ES cells
P53 gene P53基因被替换
2. 随机插入，非同源重组
如果基因组序列是：
123
待敲除基因
4
基因敲除载体的结构是：
LoxP
TK
4
LoxP
LoxP
Neo
•使待敲除基因位于两个LoxP位点之间
基本流程：
•条件性基因敲除载体的构建 •在ES细胞中进行第一次常规性基因敲除
Genomic DNA:
123
基因敲除小鼠技术
转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，并逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业一、技术介绍与研究进展转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，在小鼠模型构建方面日趋完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样，逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。
尽管如此，传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等，而ZFN和TALEN等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。
二、同源重组技术原理基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，首次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这一技术称为"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"（gene knockout），利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。
同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。
几种基因敲除鼠简介
目录
• 基因敲除鼠概述 • 条件性基因敲除鼠 • 全敲除鼠 • 诱导性基因敲除鼠
01 基因敲除鼠概述
基因敲除鼠的定义
• 基因敲除鼠：通过基因工程技术，将特定基因从 老鼠体内敲除，从而产生具有特定表型特征的转 基因动物。
基因敲除鼠的用途
疾病模型
药物筛选
基因敲除鼠可以模拟人类遗传性疾病 的发生和发展过程，用于研究疾病的 发病机制和治疗方法。
全敲除鼠通常是通过将经过基因 编辑的胚胎干细胞注入早期胚胎 中，然后移植到代孕母鼠体内发
育而成。
全敲除鼠的应用
01
02
03
疾病研究
全敲除鼠可以模拟人类遗 传性疾病，用于研究疾病 的发病机制、病理生理变 化和药物筛选等。
药物研发
全敲除鼠可以用于评估新 药对特定基因缺陷的治疗 效果，加速药物的研发进 程。
部分基因敲除鼠
03
将特定基因部分敲除或敲低，产生具有部分缺失或降低该基因
表达的转基因动物。
02 条件性基因敲除鼠
条件性基因敲除鼠的原理
条件性基因敲除鼠是通过基因打靶技术，将特 定基因的启动子替换为可诱导的启动子，使得 基因的表达只在特定条件下被激活或沉默。
可诱导的启动子通常来源于激素响应元件或化 学诱导系统，如四环素响应系统、干扰素响应 系统等。
药物研发
利用条件性基因敲除鼠可以筛选出 对特定疾病有疗效的药物，缩短药 物研发周期并提高成功率。
条件性基因敲除鼠的优缺点
优点
条件性基因敲除鼠具有高度特异性，可以避免全身敲除基因带来的副作用；同 时，可以在特定时间和空间范围内研究基因的功能，提高实验的可控性和精确 度。
缺点
条件性基因敲除鼠的构建过程复杂，需要较高的技术要求和时间成本；同时， 诱导系统的效果可能受到多种因素的影响，如激素水平、给药方式等。
第九章 基因敲除与药学
三、筛选与鉴定
标记筛选法：正负筛选法(PNS法) 标记筛选法：正负筛选法 法
含正、负两种选择性标记基因，前者插入或取代 载体上同源序列的关键外显子，后者位于同源序列的 外侧。转染ES细胞后 （1）末整合入外源基因(大多数， neo－/HSV-tk－)： 在含G418培养基中（－） （2）随机插入 (neo＋/HSV-tk＋)：在含更昔洛韦的培 养基中（－） （3）同源重组 (neo＋/HSV-tk－)，在含有G418和更 昔洛韦的培养基中生长。
全部“敲 全部“ 除”
受精卵
没能提高 “同源重 组”的效 率
需要成千 上万个受 精卵
天无绝人之路 英国的马丁· 英国的马丁·埃文斯博士
模仿“囊胚”中的微环境， 模仿“囊胚”中的微环境， 让培养皿中的干细胞无限 繁殖下去， 繁殖下去，同时又完整地 保留干细胞的“全能” 保留干细胞的“全能”特 性
成为在实验室条件下成功地繁殖 胚胎干细胞的世界第一人， 胚胎干细胞的世界第一人，为 基因靶向” “基因靶向”技术提供了足够多 的靶细胞
一、条件性基因敲除
利用Cre／LoxP实现靶基因的切除原理
一、条件性基因敲除
条件性基因敲除的程序分为两步： 条件性基因敲除的程序分为两步： 产生目标序列被两个重组酶识别位 点锚定的“ 点锚定的“Loxp floxed”动物 动物 动物与cre转基因 “Loxp floxed”动物与 动物与 转基因 动物杂交， 动物杂交，产生条件性基因敲除动 物
3.磷酸钙法 磷酸钙法
二、基因敲除载体导入ES细胞 基因敲除载体导入 细胞
将待转染的 DNA溶解在磷 溶解在磷 酸缓冲液中， 酸缓冲液中， 加入CaCl2后， 加入 DNA片段与磷 片段与磷 酸钙共沉淀并 形成大的颗粒； 形成大的颗粒； 将此颗粒悬浮 液加入贴壁培 养的细胞中， 养的细胞中， 外源DNA就被 外源 就被 靶细胞所吸收， 靶细胞所吸收， 进而实现转基 因。
基因敲除专题
2.3.2 RNAi的优缺点
步骤 2.1.2 条件性基因敲除法 2.1.3 诱导性基因敲除法 2.1.4 同源重组基因敲除缺点
2.2 利用随机插入突变进行基因敲除 2.2.1 基因捕获法 2.2.2 基因捕获法的优缺点组法敲除靶基因的基本步骤
a． 基因载体的构建： b．ES 细胞的获得 ｃ．同源重组： ｄ．选择筛选已击中的细胞： ｅ．表型研究： f．得到纯合体：
需要敲除的靶基因转录翻译出活性蛋白
2.2.1 基因捕获法
基因捕获法是最近发展起来的利用随机插入突变进行基因敲除的 新型方法。
基因捕获法的基本原理图
2.2.2 基因捕获法的优缺点
利用基因捕获可以建立一个携带随机插入突变和更迅速地进行 小鼠染色体组的功能分析。 缺点是无法对基因进行精细的遗传修饰。
他的表现远不能令人满意，他从来不听从教导，经常固执己见，按照自己的 想法胡搅蛮惨，因此常常陷入到困境里。我知道他立志将来成为一位科学家， 这很不错有 理想有目标，不过根据他现在的表现，这非常荒谬。如果他不能
学会一些简单的生物学常识，将来根本不会有任何机会去做一位专家级的工 作，不管对他自己还是教 他的老师们来说，纯粹是浪费时间
基因敲除定义 实现基因敲除的多种原理和方法 基因敲除技术的应用及缺陷
基因敲除定义：
中文名称：基因敲除 英文名称：gene knock-out;gene knockout 其他名称：基因剔除
条件性基因敲除与敲入ppt课件
构建Cre转基因动物与构建普通转基因动物的方法相
似，最为常用的基因转移方法仍为受精卵雄性原核
显微注射法和胚胎干细胞的囊胚注射法。
20
先将Cre时空特异表达载体线性化后注入雄性原核，使其以随机插入的 方式整合进基因组，然后将该受精卵或早期胚胎植人到假孕母鼠的输 卵管或子宫内。受精卵雄性原核显微注射法的具体步骤简述如下：
3
经典的基因敲除的具体实施方法可以简述如下： 选择需要研究的目的基因的部分或全部DNA片 段，通过分子生物学方法使其产生突变，然后 与相应的载体进行重组，成为靶载体。分离试 验动物的胚胎干细胞，在体外将上述靶载体导 入到胚胎干细胞内，使其与细胞内相似或相同 的序列进行同源重组，替代细胞内原来的基因。 通过一定的筛选方法筛选出发生同源重组的细 胞，再将其注入囊胚腔内；把经过上述处理的 囊胚重新植入到假孕小鼠的子宫内，使其发育 成为一个完整的个体。含有相应突变基因的嵌 合体雄性小鼠与正常雌性小鼠进行交配后，通 过筛选可获得携带该突变基因的纯合子小鼠。
条件性基因敲除与敲入
1
在科学研究中，为了明确某一组织或器官的功能， 常将实验动物体内所要研究的组织或器官切除，进 而根据实验动物的生理指标或功能的变化来推测切 除部分的功能。生命科学发展到今天，人们对于生 命现象的认识已经逐步深入到了分子水平，而上述 的“部分切除—观察整体—推测功能”的研究思想 仍然有效。具体地说，就是在分子水平破坏想要研 究的基因，然后观察生物体的生理指标、功能、整 体形态、组织结构、发育过程的变化等，进而推测 相应基因的功能。这种研究过程称为基因敲除(gene knock out)。此外，为了研究某种疾病与某个基因之 间的关系，常向生物体内人为引入某个基因，然后 观察实验动物出现的各种变化，从而推测疾病与基 因的关系，这种研究方法称为基因敲人(gene knock in)。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
条件性基因敲除的策略
条件性基因敲人是在特定的时期、特定的组织和器官中使某个基因获得表达，可用于研究致病基因的功能或者构建在特定的条件下、特定的组织和器官中表达某个基因的转基因动物模型。
其基本原理和实施方法与前面介绍的条件性基因敲人非常相似，只不过在构建loxP 转基因动物时，靶基因与启动子之间含有一段具有翻译终止密码的基因序列，导致靶基因不能正常翻译。
而这段分割序列的两侧各有一个loxP位点，在Cre重组酶存在的情况下可以使loxP位点之间的分割序列缺失，从而使靶基因获得开放。
这样一个含有靶基因、分割序列和loxP位点的基因片段通常被置于一些持续表达基因(如p―肌动蛋白、还原磷酸甘油醛脱氢酶)的启动子的调控之下，从而使这样一个功能单位在生物体内的各个时期、各种组织和器官中都能够持续获得转录。
但是由于分割序列的存在，靶基因并不能在这些组织中翻译出有功能的蛋白质。
分割序列一般选择绿色荧光蛋白(EGFP)或lacZ的编码序列，这两种基因的产物都可以作为一种标记物，在loxP转基因动物体内标记靶基因的存在。
具体设计如图所示。
条件性基因敲入时，靶基因、分割序列、loxP位点和启动子的排列
构建好这样一个loxP的转基因小鼠后，只要让它和特定的Cre转基因小鼠进行杂交，就可以实现在目标基因的条件性敲人。
条件性基因敲人的具体实施方法与条件性基因敲除大同小异，在此不赘述。