siRNA转染常见问题解答
sirna转染常见问题解答
siRNA转染常见问题解答SiRNA导入细胞有以下几种方法：化学转染技术、电穿孔法、磷酸钙共沉淀技术、显微注射和载体导入技术。
选择时应该依据实验条件考虑以下因素：细胞对转入方式的承受能力、细胞对病毒侵染的易感性、细胞的生长特性等。
其中，化学转染技术是目前最为常用的方法，由于电转的方法对细胞损伤比较大，一般不建议选择电转。
针对最常见的化学转染技术，有几种常见的问题以及解决方法。
一、哪种转染试剂效果好？在选择转染试剂时，一般要考虑的是结合特定的细胞株，而不是被导入细胞中的物质。
选择细胞毒性小，转染效率高的转染试剂。
脂质体试剂的毒性较大，建议选择非脂质体的转染试剂，如BIODAI的RFect系列纳米材料转染试剂。
二、转染后出现细胞死亡是什么原因？如何优化转染条件？转染后细胞死亡，原因也是多样的，如脂质体毒性，转染浓度过高，转染前的细胞状态不佳等都可能导致转染后细胞死亡的情况发生，这种情况下就需要适当优化转染条件；在优化转染条件时需要考虑以下因素：转染试剂和细胞特有的自身条件。
例如：siRNA 与转染试剂的比例、转染时间、细胞传代数和细胞密度等。
一般说，转染试剂毒性小，转染时所需的细胞密度就小，如RFect系列siRNA转染试剂一般要求30-50%细胞密度，而lipo2000转染时所需的细胞密度一般在70%左右。
如果经优化后细胞死亡仍很多，应及时考虑更换转染试剂。
三、如何优化siRNA与转染试剂的比例？SiRNA的量与转染试剂的比例需要进行优化，一般选择24孔板进行优化，比较节省各种试剂。
可以在10-100nM之间设定几个siRNA的浓度水平，如30nM，50nM，80nM，100nM。
转染试剂根据说明书推荐的剂量上下浮动各3个浓度。
之后siRNA的量与转染试剂的量进行两两组合，从中选择转染效率最高的组合用于接下来的实验。
如果通过荧光显微镜观察荧光判断转染效率的话，siRNA的最低终浓度不要低于10nM，一般推荐的siRNA终浓度多在50-100nM。
siRNA细胞转染实验操作指南
siRNA细胞转染实验操作指南siRNA产品的最佳工作浓度、转染后检测时间因不同的细胞类型和研究目的而异。
一般推荐的siRNA工作浓度为50nM，检测时间为转染后24~72h。
可以通过设置时间梯度和浓度梯度进行组合实验来选择最优的siRNA工作浓度和检测时间。
由于siRNA过量会对细胞产生毒性，实验建议的siRNA 工作浓度优化的范围为5~100nM。
下面以Lipofectamine 2000转染24孔板的293T细胞为例，选取50nM的siRNA工作浓度，介绍siRNA转染细胞的操作步骤。
若使用其他的转染试剂，请参照对应的产品说明书进行操作。
1.在转染前一天，按1×105~5×105个/孔的量将细胞接种于不含抗生素的完全培养基中，使次日转染时细胞融合度30-50%为宜。
接种时尽量保证每孔细胞的接种数量一致，使细胞均匀地平铺在生长表面。
注意:降低转染时的细胞密度可延长转染和收样的时间间隔，避免细胞过度生长对实验结果造成影响。
可根据细胞特性和实验目的等，调整接种时的细胞密度。
2.每个待转染的细胞样品（每个培养孔），按以下体系配置转染所需的siRNA-Lipofectamine 2000复合物:（1）配制稀释液A:取25pmol siRNA于50ul Opti-MEM无血清培养基中稀释，轻轻混匀。
（*siRNA的用量计算参照表1）（2）配制稀释液B:使用前先将Lipofectamine 2000轻轻混匀，取出1ul于50ul Opti-MEM无血清培养基中稀释，轻轻混匀，室温下孵育5分钟。
注意孵育时间不能超过25min。
（3）孵育完成后，将稀释液A与B轻轻混匀得到siRNA-Lipofectamine 2000复合物，在室温下孵育20分钟。
此时溶液可能会浑浊，属于正常现象。
表1 不同细胞培养板siRNA 转染用量参考表3.将孵育好的siRNA-Lipofectamine 2000复合物分别加到对应的细胞孔中，轻轻混匀。
sirna转染实验步骤及实验要点
sirna转染实验步骤及实验要点siRNA转染实验步骤如下：1.细胞接种：提前一天将细胞种植在24孔板中，以转染时细胞汇合度在30%左右为宜，转染前全培养基总量为0.45ml。
2.转染过程：•取0.67μg (50pmol) 的siRNA，加入一定量无血清稀释液，充分混匀，制成RNA稀释液，终体积为25μl。
注意：无血清稀释液建议采用OPTI-MEM、无血清DMEM或1640。
•取1μl的EntransterTM-R4000，然后加入24μl无血清稀释液体，充分混匀，制成EntransterTM-R4000稀释液，终体积为25μl。
室温静置5分钟。
•将EntransterTM-R4000稀释液和RNA稀释液充分混合（可用振荡器振荡或用加样器吹吸10次以上）混合，室温静置15分钟。
转染复合物制备完成。
•将50μl转染复合物滴加到有0.45ml全培养基（可含10%血清和抗生素）的细胞上，前后移动培养皿，混合均匀。
注意：对本试剂，采用含血清的全培养基有助于提升转染效率。
•转染后6小时观察细胞状态，如状态良好可不必更换培养基，继续培养24-96小时得到结果。
3.观察和检测：根据具体实验需求，可以在转染后的不同时间点观察细胞状态、检测基因表达、蛋白质表达等。
实验要点：1.细胞接种密度要适宜，一般在30%左右汇合度较好。
2.无血清稀释液的选择对于siRNA的稳定性和转染效率至关重要。
建议采用OPTI-MEM、无血清DMEM或1640等品牌。
3.在制备转染复合物时，要保证各个步骤的混合均匀，避免产生气泡。
4.在将转染复合物加入细胞时，要保证细胞的生存环境，避免对细胞造成损伤。
5.在转染后的观察和检测中，要注意保证实验结果的准确性和可靠性。
以上信息仅供参考，建议查阅专业文献获取更准确的信息。
RNAi和siRNA
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1.需要短期抑制还是长效抑制?
1周以内，采用siRNA较好，无需构建载体，节省 时间，还可以采用2次转染的方法，延长RNAi作 用的时间到2周。
2周以上长效RNAi实验，采用shRNA表达载体较 好，效应持续时间长。
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2. 采用SIRNA进行实验的途径
(1) 化学合成：首选的siRNA制备方法，最快、最 方便，成本高，适用于长期使用特定siRNA
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4.哺乳动物系统的RNAI实验
通过转染siRNA：通常在3-7天可以维持较高的基 因表达抑制效应，效应期的长短主要取决于细胞 的增殖速度和siRNA的有效性。大部分RNAi实验 可以在此时间段获得结果，而且可以通过再次转 染获得超过1周的基因表达抑制时间。 通过转染shRNA表达载体，可以获得超过2周的 基因表达抑制时间，在长效RNAi实验时，选择 shRNA表达载体较为合适。
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5.RNAI效应表现
RNAi效应导致的靶基因下调可在mRNA水平和 蛋白水平表现，也可能会在细胞形态等生理学 方面表现。
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第二部分 哺乳动物系统的RNAI实验设计
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主要内容
1. 需要短期抑制还是长效抑制? 2. 采用siRNA进行实验的途径 3. 构建shRNA表达载体进行实验 4. siRNA设计需要注意的问题 5. 脱靶效应 6. 转染是RNAi实验的瓶颈
RNAI和 SIRNA转染
精品文档1内容来自第一部分 RNAi实验基本概念 第二部分 RNAi实验具体设计 第三部分 siRNA转染过程相关问题及解答
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第一部分 RNAI实验基本概念
siRNA转染 Protocol
siRNA转染实验是一种常用的基因沉默技术，其基本原理是通过将小干扰RNA（siRNA）引入细胞，从而在翻译水平上抑制特定基因的表达。
以下是siRNA转染的实验原理、所需试剂和耗材、实验仪器、准备工作、实验方法、注意事项、常见问题及解决方法。
一、实验原理siRNA是一种21-23个核苷酸长的双链RNA，它与靶基因的mRNA 序列互补，通过碱基配对原则与mRNA结合，抑制基因表达。
siRNA 转染实验是通过将siRNA转入细胞内，利用细胞内自然存在的RNA 干扰机制，在转录后水平抑制基因表达。
这种技术具有高效性、特异性和可逆性等特点，被广泛应用于基因功能研究、药物筛选和疾病治疗等领域。
二、所需试剂和耗材1.试剂：o siRNA：针对特定基因的siRNA分子。
o转染试剂：如Lipofectamine、JetPrime等，用于将siRNA转入细胞。
o培养基：如DMEM、F12等，用于细胞培养。
o血清：如胎牛血清，提供细胞生长所需的营养物质。
o抗生素：如青霉素、链霉素等，用于防止细胞污染。
2.耗材：o细胞培养瓶、板：用于细胞培养。
o离心管：用于离心和分离细胞。
o移液器及枪头：用于精确加样。
o过滤器：用于过滤溶液中的杂质。
o无菌水：用于稀释和配制溶液。
三、实验仪器1.实验室搅拌器：用于混合溶液。
2.高速冷冻离心机：用于离心和分离细胞。
3.水浴锅：用于加热溶液。
4.无菌工作台或超净工作台：用于进行无菌操作。
5.分光光度计：用于测量细胞生长状况和转染效率。
6.荧光显微镜：用于观察细胞转染后荧光蛋白的表达情况。
7.CO2培养箱：提供细胞培养所需的气体环境。
8.显微镜：观察细胞的生长状态和siRNA转染后的细胞变化。
9.细胞计数板或细胞计数仪：用于细胞计数，确定细胞的密度和生长状态。
10.酶标仪或多功能读板仪：用于检测细胞因子的浓度。
四、实验准备工作1.确认细胞系和siRNA：实验前要明确所使用的细胞系以及针对的目标基因。
siRNA 使用说明(两篇)
引言概述：siRNA（小干扰RNA）是一种小分子RNA片段，具有靶向特异性和高效沉默靶基因的能力。
本文将详细介绍siRNA的使用说明，主要包括siRNA的设计、转染方法、转染效率的评估、靶基因沉默效果的验证以及操作注意事项。
通过本文的阐述，用户能够更好地了解和掌握siRNA的使用方法，从而实现对目标基因表达的特异沉默。
正文内容：一、siRNA的设计1.确定靶基因：首先需要明确自己要沉默的目标基因，可以通过文献调研、数据库查询等方式确定目标基因。
2.设计siRNA序列：根据目标基因的序列信息，可以使用在线工具或者软件进行siRNA序列的设计。
siRNA的设计需要满足一定的规则，如目标序列的选择、GC含量、二次结构等方面的考虑。
二、siRNA的转染方法1.载体选择：siRNA可以通过多种载体转染到细胞内，如质粒转染、病毒载体转染等。
根据实验需要和细胞特性，选择适合的转染载体。
2.转染试剂：根据实验需要，选择适合的转染试剂，如化学转染试剂、电穿孔法等。
3.转染条件优化：对于每个细胞系和siRNA，转染条件需要进行优化，包括转染试剂浓度、转染时间、细胞密度等。
三、siRNA转染效率的评估1.转染效率的检测：可以通过荧光探针标记siRNA，利用荧光显微镜观察转染效率。
2.实时荧光定量PCR：通过检测靶基因mRNA的降解情况，来评估siRNA的沉默效果。
3.Westernblot：通过检测靶基因蛋白的表达水平，来评估siRNA的沉默效果。
四、靶基因沉默效果的验证1.实时荧光定量PCR：通过检测靶基因mRNA的降解情况，可以验证siRNA的沉默效果。
2.Westernblot：通过检测靶基因蛋白的表达水平，来验证siRNA的沉默效果。
3.功能实验：通过观察细胞的表型变化、增殖能力的变化等方面，来验证siRNA的沉默效果。
五、操作注意事项1.siRNA的保存：应在20°C下保存，避免反复冻融。
2.转染前的细胞处理：细胞的状态和密度对转染效率有影响，应注意细胞的处理方法和细胞密度的选择。
转染讨论
最好同时设计几对，选择效果较好的，别忘了做对照（GFP）,排除非特异性干预2.对于转染后的效应检测，体外直接合成的SiRNA多半在48h检测，也有72H的，但时间再长有可能降解而失去功效。
对于用U6或H1质粒载体体内转录生成siRNA的，因为有一个转录时间，所以检测可以稍靠后；而且，与体外合成的相比，虽然载体也不能大量整合到细胞基因组中，但毕竟不会马上降解，Knockdown的时间效应相对要长，一般一周左右没有问题。
所以可以在检测时做一个时间梯度，使实验数据更加丰满完善一些。
（但要考虑靶细胞生长特性，疯长的可能效果较差）一般在转染后4－6小时补加血清，可以就在你原来的无血清培养基中滴两滴血清。
如果你觉得LF2000可能对你的细胞有毒性作用的话（一般LF2000的毒性不至于很大，可以不用更换培养基，具体看你细胞的生成状态了），你可以把原来的无血清培养基吸出来，更换成含血清的培养基。
在转染后的4－6小时，最好不要动你的细胞，让它安静地躺着，因为此时细胞最为脆弱，不合适的动荡会使其死亡率增加。
lipofectamine2000转染后在6小时左右最好换液且换为有血清的血清，其一因为lipofectamine2000对细胞的毒性作用还是有的，其二可降低因血清的缺乏引起的细胞的死亡。
转染时不加血清是防止血清的干扰作用，转染后可适时加入。
加入过早会引起未转染细胞的优势生长，过晚会引起较多细胞死亡。
可时时观察1/5细胞变圆的时候加入血清。
转染全程都不应加有抗生素的，我刚刚做完LP2000转染的，把我的一点经验告诉你啊： 1.加完脂质体DNA混合物后细胞就出现小黑点，这很正常的，因为LP2000即使毒性再小它也是有毒性的，减轻的办法就是4－5小时把混合物去掉换有血清的新培养基培养，我做之前看有些战友的意见毒性大3小时换也行的。
2.我的是在无血清的DMEM下转的，推荐买OPTI-MEM，但到货一个月，我也没用，不过还可以的3.多摸几个浓度比例，找出最适合的，如果有报告基因就最好了，但是我的也没有。
siRNA的转染
siRNA的转染将制备好的siRNA，siRNA表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法主要有以下几种：1.磷酸钙共沉淀将氯化钙，RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。
磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。
沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。
在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。
2.电穿孔法电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。
将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。
电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。
一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平（50%或更高）的毒性。
3.DEAE-葡聚糖和polybrene带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA分子使得DNA 可以结合在细胞表面。
通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入。
两种试剂都已成功用于转染。
DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。
4.机械法转染技术也包括使用机械的方法，比如显微注射和基因枪（biolistic particl e）。
显微注射使用一根细针头将DNA，RNA或蛋白直接转入细胞质或细胞核。
基因枪使用高压microprojectile将大分子导入细胞。
5.阳离子脂质体试剂在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时，其可以形成微小的（平均大小约100-400nm）单层脂质体。
这些脂质体带正电，可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。
因此使用阳离子脂质体转染的原理与以前利用中性脂质体转染的原理不同。
使用阳离子脂质体试剂，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物。
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siRNA转染常见问题解答
SiRNA导入细胞有以下几种方法：化学转染技术、电穿孔法、磷酸钙共沉淀技术、显微注射和载体导入技术。
选择时应该依据实验条件考虑以下因素：细胞对转入方式的承受能力、细胞对病毒侵染的易感性、细胞的生长特性等。
其中，化学转染技术是目前最为常用的方法，由于电转的方法对细胞损伤比较大，一般不建议选择电转。
针对最常见的化学转染技术，有几种常见的问题以及解决方法。
一、哪种转染试剂效果好？
在选择转染试剂时，一般要考虑的是结合特定的细胞株，而不是被导入细胞中的物质。
选择细胞毒性小，转染效率高的转染试剂。
脂质体试剂的毒性较大，建议选择非脂质体的转染试剂，如BIODAI的RFect系列纳米材料转染试剂。
二、转染后出现细胞死亡是什么原因？如何优化转染条件？
转染后细胞死亡，原因也是多样的，如脂质体毒性，转染浓度过高，转染前的细胞状态不佳等都可能导致转染后细胞死亡的情况发生，这种情况下就需要适当优化转染条件；在优化转染条件时需要考虑以下因素：转染试剂和细胞特有的自身条件。
例如：siRNA 与转染试剂的比例、转染时间、细胞传代数和细胞密度等。
一般说，转染试剂毒性小，转染时所需的细胞密度就小，如RFect系列siRNA转染试剂一般要求30-50%细胞密度，而lipo2000转染时所需的细胞密度一般在70%左右。
如果经优化后细胞死亡仍很多，应及时考虑更换转染试剂。
三、如何优化siRNA与转染试剂的比例？
SiRNA的量与转染试剂的比例需要进行优化，一般选择24孔板进行优化，比
较节省各种试剂。
可以在10-100nM之间设定几个siRNA的浓度水平，如30nM，
50nM，80nM，100nM。
转染试剂根据说明书推荐的剂量上下浮动各3个浓度。
之后siRNA的量与转染试剂的量进行两两组合，从中选择转染效率最高的组合用于接下
来的实验。
如果通过荧光显微镜观察荧光判断转染效率的话，siRNA的最低终浓度
不要低于10nM，一般推荐的siRNA终浓度多在50-100nM。
这里需要说明的是，以
荧光信号的强弱判断siRNA转染效果并不准确，最好采用荧光定量PCR来判断转染效果。
因为siRNA转染成功最客观的标志就是基因表达量的减少，另外，细胞本身会吸附荧光染料，会出现非特异性吸附。
四、关于用于稀释siRNA与转染试剂的无血清培养基
这里是推荐thermo公司的opti-MEM培养基的。
能够提高细胞的转染效率的，尤其是在进行脂质体转染的时候是会很大程度上较少细胞毒性作用。
五、siRNA转染基因敲除效率的测定方法以及注意事项
1.PCR检测mRNA水平的沉默效果，一般推荐在48h到72h检测，48h比较理想，需要具体的摸索时间。
PCR检测沉默效果时，在设计引物的时候最好是将引物设计在沉默位点的两侧，而不是在同侧。
这个是由于RNAi引起的沉默是先进行mRNA 的切割之后造成mRNA的降解。
另外，即使设计在两侧，也不要离沉默位点太远的地方，不然可能会造成对沉默效果的低估。
2.WB检测蛋白蛋白水平的检测，一般在转染后48h到92h间提蛋白检测蛋白水平的沉默效果，检测时间跟你的蛋白的半衰期有关系，具体的时间需要设计时间梯度，一般理想的是在72h最明显。