siRNA说明书
siRNA细胞转染实验操作指南
siRNA细胞转染实验操作指南siRNA产品的最佳工作浓度、转染后检测时间因不同的细胞类型和研究目的而异。
一般推荐的siRNA工作浓度为50nM，检测时间为转染后24~72h。
可以通过设置时间梯度和浓度梯度进行组合实验来选择最优的siRNA工作浓度和检测时间。
由于siRNA过量会对细胞产生毒性，实验建议的siRNA 工作浓度优化的范围为5~100nM。
下面以Lipofectamine 2000转染24孔板的293T细胞为例，选取50nM的siRNA工作浓度，介绍siRNA转染细胞的操作步骤。
若使用其他的转染试剂，请参照对应的产品说明书进行操作。
1.在转染前一天，按1×105~5×105个/孔的量将细胞接种于不含抗生素的完全培养基中，使次日转染时细胞融合度30-50%为宜。
接种时尽量保证每孔细胞的接种数量一致，使细胞均匀地平铺在生长表面。
注意:降低转染时的细胞密度可延长转染和收样的时间间隔，避免细胞过度生长对实验结果造成影响。
可根据细胞特性和实验目的等，调整接种时的细胞密度。
2.每个待转染的细胞样品（每个培养孔），按以下体系配置转染所需的siRNA-Lipofectamine 2000复合物:（1）配制稀释液A:取25pmol siRNA于50ul Opti-MEM无血清培养基中稀释，轻轻混匀。
（*siRNA的用量计算参照表1）（2）配制稀释液B:使用前先将Lipofectamine 2000轻轻混匀，取出1ul于50ul Opti-MEM无血清培养基中稀释，轻轻混匀，室温下孵育5分钟。
注意孵育时间不能超过25min。
（3）孵育完成后，将稀释液A与B轻轻混匀得到siRNA-Lipofectamine 2000复合物，在室温下孵育20分钟。
此时溶液可能会浑浊，属于正常现象。
表1 不同细胞培养板siRNA 转染用量参考表3.将孵育好的siRNA-Lipofectamine 2000复合物分别加到对应的细胞孔中，轻轻混匀。
siRNA说明书
产品以冻干粉的形式，常温运输。
收到产品后，请于-20 C〜-80 'C保存，冻干粉可以稳定保存一年。
使用前请瞬时离心，用RNase-freeH 2O或者灭菌ddH20，配制成20gM储存液，分装保存，避免反复冻融（尽量不超过5次）。
表120 gM储存液的配置参考使用前须知为避免外界因素（包括酶，极端pH或者温度条件等）导致产品降解，所有操作请严格遵循RNA操作规则。
实验过程中，产品最好于冰上放置，使用完毕后请于-20 C~-80 C小心保存。
细胞实验方法为了降低细胞密度、试剂用量，转染效率等因素导致的孔间差异，保证实验可靠性和可重复性，一般建议：a. 转染实验中每个转染样品至少设置3个以上复孔；b. 接种细胞时，每孔接种的细胞数量尽量保持一致，并且细胞在各孔的表面平均分布。
1. 转染浓度：siRNA产品最佳工作浓度因不同的细胞类型及研究目的而异。
推荐初始转染浓度为50nM，转染后检测时间为24〜72h。
最佳转染效率一般通过设置时间曲线和浓度梯度进行优化，优化的范围建议为5~100nM。
2. 转染步骤：以Iipofectamine2000（简称Iipo2000）转染siRNA于24孔板，转染浓度为50nM为例，其他规格容器转染请参考表2。
1）转染前一天，接种适当数量的细胞至细胞培养板中，每孔中加入不含抗生素的培养基，使转染时的细胞密度能够达到30~50%（不同细胞生长速度不一样，因此，接种细胞的数量需要根据细胞培养的经验）。
注意: 转染时，细胞密度是影响转染效率的关键因素之一，细胞生长过度会削弱细胞活力，降低细胞的转染效率。
2）对于每个转染样品，请按以下步骤准备siRNA-Iipo2000混合液：a. 稀释siRNA :用50 g 不含血清培养基Opti-MEM I （v1）稀释g I20 gM siRNA储存液，轻轻混匀，室温孵育5min ;b. 稀释Iipo2000 :用50 g不含血清培养基Opti-MEM I （v1）稀释1 g Ilipo2000，轻轻混匀并室温孵育5min ;c. 将a与b轻轻混匀，室温孵育20min（溶液可能会有浑浊，但不会影响转染）。
siRNA 中文操作手册(lipo2000)
THE RNAi COMPANYRNAi 产品使用手册上海吉玛制药技术有限公司Shanghai GenePharma Co.,Ltd.Ⅰ. RNAi 简介 1A. RNAi 实验原理B. RNAi 实验流程C. RNAi 实验所需试剂D. 上海吉玛 RNAi 相关产品Ⅱ. siRNA设计7A. 哺乳动物siRNA设计B. 上海吉玛 siRNA 产品特性C. siRNA oligo 技术数据Ⅲ. siRNA 对照9A. 普通阴性对照B. 荧光标记的阴性对照C. siRNA阳性对照D. 转染试剂对照E. 避免off-target对照Ⅳ. siRNA 转染10A.siRNA 转染的方法B.Lipofectamin2000 转染试剂C.Lipofectamin2000适用的细胞类型D.转染前细胞培养E.Lipofectamin：siRNA/DNA比例F.贴壁细胞转染程序G.悬浮细胞siRNA转染程序H.DNA和siRNA共转染细胞程序I. 体内siRNA导入方法J. siRNA转染常见问题与建议Ⅴ. mRNA水平RNAi效果监测15A. siRNA细胞转染条件优化B. Real-Time PCR RNAi 效果检测C. Real-Time PCR 结果分析Ⅵ. 蛋白质水平RNAi效果监测20A. western-blot原理B.western-blot操作步骤wC.estern-blot上样液的制备D.western-blot常用试剂的配制Ⅶ. RNAi实验常见问题解答22Ⅰ. RNAi 简介A. RNAi实验原理RNA干扰（RNA interfering，RNAi）现象是由与靶基因序列同源的双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）引发的广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。
细胞中的核糖核酸酶III家族成员之一的，dsRNA特异性的核酸酶Dicer将dsRNA裂解成由21-25个核苷酸组成的小干扰RNA (small interfering RNA，siRNA)，随后siRNA作为介导子引起特异性地降解相同序列的mRNA，从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制。
锐博siRNA产品说明书
siRNA使用说明（2009-08）名称：常规化学合成siRNA。
产品简介：常规化学合成siRNA为21-25nt，带有2nt的3'端悬垂的双链小RNA（3'端悬垂通常为dTdT或者UU，也可以选择其他的碱基作为3'端悬垂）。
产品剂量经过严格测算，以摩尔数标明。
产品剂型为冻干粉，即用型的siRNA已经经过去保护、退火、纯化等处理，只要用灭菌的ddH2O或者RNase-free water溶解并配制成20μM液体即可直接用于细胞转染及其他实验。
保存和使用：保存： 液体剂型，siRNA的贮存浓度一般为20μM，-20℃或-70℃保存半年以上；冻干粉剂型，-20℃或-70℃保存一年以上。
开盖前，请先稍稍离心，将粉末收集管底，再用灭菌的ddH2O或者RNase-free water，配制成20μM的液体剂型。
例如：20nmolsiRNA冻干粉，需要加入1ml水溶解（其他剂量可以按照比例计算加水量）。
注意：（1）液体剂型产品，应避免反复冻融（尽量不要超过5次），建议溶解后的产品分装保存。
（2）如果近期不做实验，产品需要长期放置，最好以冻干粉形式保存。
使用： 产品使用时（转染过程），siRNA最好冰上放置，使用完毕，请于-20℃或-70℃小心保存;整个实验过程，要求无RNA酶环境，枪头、EP管都要经DEPC处理；特别提示：荧光标记siRNA要求避光。
使用方法：1. siRNA的转染浓度：推荐的siRNA转染浓度是50nM，客户可根据实验具体情况优化转染浓度，优化的范围可以是10～150nM。
（siRNA及转染试剂的建议用量，请参照“实验指导”）。
2. 使用lipofectamine2000（Invitrogen）转染siRNA的步骤（仅供参考）：(1) 转染前一天，接种适当数量的细胞至细胞培养板中，使转染时的细胞密度能够达到30～50％（不同细胞生长速度不一样，因此，接种细胞的数量需要根据细胞培养的经验），请使用无抗生素的培养基。
siRNA 使用说明
siRNA 使用说明siRNA 使用说明一、简介siRNA（small interfering RNA，小干扰RNA）是一种短双链RNA分子，能够特异性地靶向靶标基因的mRNA，从而抑制基因的表达。
本文档旨在提供有关siRNA的使用说明，包括实验准备、转染方法、验证转染效果等内容。
二、实验准备1、设计siRNA序列：根据目标基因序列，使用专业软件设计siRNA序列，确保合适的靶向位点和抑制效果。
2、合成siRNA：选取可靠的siRNA合成公司，按照其提供的合成方案进行合成，并确保纯度和浓度的准确性。
3、存储siRNA：将合成好的siRNA按照要求进行冻干或溶解保存，避免反复冻融对siRNA的影响。
三、细胞培养1、细胞系选择：选择适合的细胞系进行实验，一般常用的细胞系有HEK-293、HeLa、CHO等。
2、培养条件：按照细胞系的要求，配置好适合的培养基，并添加适当的血清和抗生素。
3、培养状态：维持细胞在良好的状态下生长，保持培养皿内细胞的完整和无菌。
四、siRNA转染1、转染试剂选择：根据不同细胞系的特点，选择适合的转染试剂，如RNMAX、Lipofectamine等。
2、转染条件优化：通过实验室预实验，优化转染试剂的用量、培养时间和上清液收集时间等参数。
3、转染操作步骤：a：将siRNA转染试剂溶解于无血清的培养基中，按照转染试剂说明书的推荐比例进行稀释。
b：将稀释后的转染试剂静置15-30分钟，直至形成转染试剂- siRNA复合物。
c：将复合物滴加到细胞培养皿中，保持培养皿在37°C的培养箱中进行适当的培养时间。
d：收集转染后的上清液，进行进一步的实验。
五、转染效果验证1、Real-time PCR：使用逆转录酶和合适的引物进行实时荧光定量PCR，检测目标基因表达水平的变化。
2、Western blot：通过Western blot实验检测目标蛋白的表达水平是否下调。
3、免疫荧光染色：利用免疫荧光染色技术观察目标蛋白在细胞中的表达情况。
jetPRIME 转染siRNA说明书
JetPRIME 转染试剂转染siRNA简易说明书
第0天：细胞接种
第一天：转染
在有血清存在的情况下转染，
使用JetPRIME缓冲液
以6孔板为例
●在1.5mL或0.5mL的EP管中加入200μL的JetPRIME 缓冲液，然后加入20μM(1.1μL)
的siRNA，旋涡10s后离心（或者用移液器吹打5次混匀）；
●加入4μL的JetPRIME试剂，旋涡10s后离心（或者用移液器吹打5次混匀）；
●室温孵育10min;
●将转染复合物加入到要转染的含血清的培养基中；
●必要时，转染后4h更换细胞培养基；
●孵育24-48h，检测转染效率。
不同规格培养皿的使用量
注：
siRNA enhancer的应用：
在转染复合物加入到所需转染的细胞中后，加入培养基体积的1/1000体积的siRNA enhancer,其他步骤与以前一致；
在6h或4h更换培养基时，也需要加入相应体积的siRNA enhancer（培养基体积的1/1000）。
荧光siRNA产品使用说明
荧光siRNA产品使用说明RN：R11077.1 产品简介荧光标记的siRNA是检测转染效率、优化转染方法最常用的一种方法。
荧光标记的siRNA转染细胞后，可以直接使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜观察，也可以通过流式细胞仪检测，确定是否有效转染及转染效率的高低。
荧光标记的siRNA还可用作追踪siRNA在胞内的定位及分布的情况。
运输保存产品以冻干粉的形式储存于棕色管中，常温运输。
收到产品后，请于-20℃~-80℃保存，冻干粉可以稳定保存一年。
使用前瞬时离心，用RNase-free HO或灭菌ddH2O，配制成20μM储存液，分装避光保存，避免反复冻融（不超过5次）。
2表1 20μM储存液的配置参考注：所有过程请注意避光！使用方法使用前须知1）我们提供三种荧光基团标记的siRNA，进行实验前请先了解检测仪器的配置和参数，选择合适的荧光标记。
表2 锐博生物荧光标记siRNA可选荧光2）请先熟悉转染操作，以快速准确的完成荧光标记siRNA的转染。
3）储存、使用过程中及检测过程中请注意避光。
4）检测前请先熟悉检测仪器的操作，若使用荧光显微镜或激光共聚焦检测，检测时不宜同一位置曝光时间过长，应对好焦后马上拍照，防止曝光时间过长而荧光淬灭。
1，转染具体操作请参考使用的转染试剂说明，最好设置合适的转染试剂浓度及荧光标记siRNA浓度梯度，综合考虑转染率及转染试剂副作用，以选择合适的浓度进行RNAi实验。
以下为以riboFectTM CP Reagent 转染siRNA于24孔板，转染浓度为50nM为例：a. 稀释siRNA：用50μl 1X riboFectTM CP Buffer（v1）稀释1.25μl 20μM siRNA储存液（v2），轻轻混匀，室温孵育5min。
b. 混合液制备：加入5μl riboFectTM CP Reagent（v3），轻轻吹打混匀，室温孵育0～15min。
c. 将riboFectTM CP混合液加入到443.75μl细胞培养基（v4）中，轻轻混匀。
SiRNA 使用说明
因此，接种细胞的数量需要根据细胞培养的经验)，请使用无抗生素的培养基。 注意：转染时，细胞密度是影响转染效率的关键因素之一，细胞生长过度会削弱细胞活力，从而降低细胞的转染效率。而 细胞密度过低则可能达不到生长的要求，也会因此影响转染效率。 (2) 对于每个转染样品，按如下步骤准备 siRNA-lipo2000 混合液(试剂的用量和体积，请参照“转染 siRNA 用量参考”)： a. 稀释转染试剂 lipo2000：使用前，将 lipo2000 转染试剂轻轻摇匀，然后取适量，用不含血清的优化培养基(Opti-MEM I
E-mail: support@
1
Tel: 020-32290221
实验指导
96-well 24-well 12-well 6-well
表 1 使用 lipofectamine2000(invitrogen)转染 siRNA 用量参考(siRNA 转染浓度为 10-100nM) V1：细胞培养液体积；V2: siRNA-lipo2000 混合液总体积
siRNA 使用说明
产品简介：
常规化学合成 siRNA 为 21-25nt 的双链小分子 RNA。即用型的 siRNA，已经经过纯化、退火等处理，只要用灭菌的 ddH2O 或 RNase-free water 溶解并配制成 20µM 液体即可直接转染细胞。 产品剂型为冻干粉，产品剂量经过严格测算，以摩尔数标明。
使用： 产品使用时，siRNA 最好冰上放置，使用完毕后，请于-20℃或-70℃小心保存;整个实验过程，要求无 RNA 酶环
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使用前须知
为避免外界因素(包括酶，极端pH或者温度条件等)导致产品降解，所有操作请严格遵循RNA操作规则。
实验过程中，产品最好于冰上放置，使用完毕后请于-20℃~-80℃小心保存。
细胞实验方法
为了降低细胞密度、试剂用量，转染效率等因素导致的孔间差异，保证实验可靠性和可重复性，一般建议：
a. 转染实验中每个转染样品至少设置3个以上复孔；
b. 接种细胞时，每孔接种的细胞数量尽量保持一致，并且细胞在各孔的表面平均分布。
1. 转染浓度：
siRNA产品最佳工作浓度因不同的细胞类型及研究目的而异。
推荐初始转染浓度为50nM，转染后检测时间为24~72h。
最佳转染效率一般通过设置时间曲线和浓度梯度进行优化，优化的范围建议为5~100nM。
2. 转染步骤：
以lipofectamine™2000(简称lipo2000)转染siRNA于24孔板，转染浓度为50nM为例，其他规格容器转染请参考表2。
1) 转染前一天，接种适当数量的细胞至细胞培养板中，每孔中加入不含抗生素的培养基，使转染时的细胞密度能够达到30~50% (不同细胞生长速度不一样，因此，接种细胞的数量需要根据细胞培养的经验)。
注意：转染时，细胞密度是影响转染效率的关键因素之一，细胞生长过度会削弱细胞活力，降低细胞的转染效率。
2) 对于每个转染样品，请按以下步骤准备siRNA-lipo2000混合液：
a. 稀释siRNA：用50μl不含血清培养基Opti-MEM®Ⅰ(v1)稀释1.25μl 20μM的siRNA储存液，轻轻混匀，室温孵育5min；
b. 稀释lipo2000：用50μl不含血清培养基Opti-MEM®Ⅰ(v1)稀释1μl lipo2000，轻轻混匀并室温孵育5 min；
c. 将a与b轻轻混匀，室温孵育20min(溶液可能会有浑浊，但不会影响转染)。
注意：稀释好的lipo2000长时间放置可能导致转染试剂活性的降低，应尽量在25min之内与稀释好的siRNA 混合。
另在混合试剂时，请勿剧烈吹打或振荡，手指轻弹管壁即可，过度用力可能会破坏脂质体的结构，甚至影响siRNA-lipo2000混合物的形成。
3) 将siRNA-lipo2000混合液加入含有细胞的400μl培养基(v2)的培养孔中，轻轻混匀；
4) (可选)培养4~6h后，将孔中含siRNA-lipo2000混合液的培养基移去，更换新鲜培养基；
5) (可选)进行其他必要的特殊处理(如加药处理)；
*：实验参考用量示例; †：当实验涉及DNA共转时参考
3. 效果检测：
转染完成后24~72小时均可进行siRNA沉默效果检测，最佳检测时间与细胞类型，转染试剂，检测目的等相关。
1) RNA水平的检测：mRNA是检测siRNA沉默效率的最佳指标，siRNA转染后24~72h即可检测到靶基因mRNA表达明显降低，检测方法宜采用qPCR检测方法。
注：引物设计质量很重要；
2) 蛋白水平的检测：蛋白是RNAi沉默效率的重要指标，其检测手段主要为Western-blot等。
检测时间受细胞内蛋白质表达量、半衰期等因素的影响，一般为48~96h，甚至更长时间之后多点采样；
3) 功能筛选：应用EdU细胞增殖、EdUTP细胞凋亡等检测方法进行siRNA对细胞功能的直接筛选。