实验五 冰冻切片法解析
冷冻切片方法及注意事项
冷冻切片方法及注意事项一、实验前准备清理实验台及仪器。
开启冷冻切片机并将冷冻切片机预降至所需温度（- 15~-20 ℃*）。
准备好处理好的载玻片、刀片、胶水以及药品。
二、取材解剖之后迅速取出所需的新鲜组织，用干纱布或滤纸擦干后不需固定直接取材（24×24×2mm*）,以防形成冰晶造成切片中形成形状不一的空泡,使细胞内结构移位。
（注：取材中目的标本既要明确也要确保其结构的完整性，应避免不必要的脂肪及坏死组织附着;要尽量剔除毛发、硬骨或钙化物;保乳手术切缘由于脂肪组织较多,取材厚度最好不要超过3mm，厚者冰冻费时，大者难以切完整。
甲状腺及淋巴结组织要带全组织被膜并除去多余的脂肪组织。
）三、冷冻切片1、取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上冰冻，用吸热器压住组织，至包埋剂与组织冻结成白色冰体即可切片（1~3分种）。
2、将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。
3、调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10μm间。
4、调好防卷板。
制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。
切片时，以切出完整、平滑的切片为准。
切好的组织在干净的玻片上黏附时顺着一个方向稍微用力轻轻一带,可避免组织摊片过程中皱折,保证组织结构的完整及切片的美观。
注：①包埋剂的选用：包埋剂是对冷冻切片质量一重要影响因素，包埋剂用量要适宜，过多或过少都会影响标本冷冻质量。
常用的有三种包埋剂OCT剂、B超藕合剂以及普通胶水。
B超藕合剂适用于细胞丰富质地较嫩的组织,普通胶水或OCT剂适用于纤维丰富质地偏硬组织。
（OCT包埋剂骤冷时固化，其冷冻速度和软硬韧度与组织相近，其还具有水溶性，不影响染色等优点。
）②组织块过小：先将少量胶挤在托架上预先放在冰冻机中冷冻,约30秒钟左右待胶凝固时将小组织放上,组织周围再加一些胶,再次置于冷冻机中冷冻,这样组织被垫高,就能快速切出高质量的切片。
冰冻切片详细说明解读
冰冻切片详细说明切片技术最早期是从冰冻切片开始，后来逐步有了发展和更新，冰冻切片弥补了石蜡切片和火棉胶切片之不足，石蜡切片和火棉胶切片需时太久，且在制片中要使用许多化学试剂，石蜡切片还需要加温过程，因而某些重要的不稳定的组织成分如脂类、酶以及抗体等，可能被溶解和破坏。
冰冻切片过程较简单，无须经过上述步骤，组织中的水分起着包埋剂的作用，组织经固定或不固定即可进行冰冻切片，切片厚度一般可在6-8微米，组织没有收缩，易保持生活时原有状态，是保存脂肪组织，许多神经组织特殊染色方法和组织化学方法，特别是酶的活性十分理想的切片方法，对于外科临床诊断和现代免疫荧光诊断，冰冻切片也很重要。
其缺点是组织过大不易冰冻，连续切片困难。
5微米以下切片不易成功。
但是随着现在冰冻包埋液的不断改进，已经能切出少于3微米的切片一、直接冰冻切片法冰冻切片多用于新鲜组织、甲醛固定组织和冰箱冷藏组织等。
组织块不经任何包埋剂而直接放在制冷台上冷却后再进行切片。
1．恒冷箱切片就是将组织在恒冷箱的切片机切片。
目前恒冷箱切片机的品种较多。
此种切片适用于科研和教学上的连续切片。
要求预先开动电源（预冷准备），配多种固定组织台，以便更换组织。
2．甲醇制冷器制冷箱为附有带导管的制冷台和制冷刀的甲醇循环装制，其冷却速度比较快，属于开放式，作一般常规冰冻切片用。
3．二氧化碳冰冻法将组织用蒸馏水洗后，放在冰冻切片机的冷冻台上，加蒸馏水少许。
打开冷冻台的二氧化碳开关，二氧化碳气体喷出，待组织出现冷霜时，将二氧化碳关闭，即可切片。
若组织冷冻过硬则切片易碎；组织冷冻硬度不足，则切片呈粥糜状，需用间歇方法继续冷却。
硬度一般在刚开始解冻时最合适，应迅速切片。
4．半导体致冷冰冻切片法将组织置半导体致冷台上，滴加少许蒸馏水，调好切片机的厚度。
先接通热器的循环流水，然后接通电源，电源的正负极切勿接反，用整流电源控制温度。
二、明胶冰冻切片法明胶包埋法一般多用于冰冻切片易破碎的组织，特别是某些有树枝状突起的组织，当其切片后投入水中时，常常引起分散，甚至发生丢失，某些间隙较多的组织，有时会因发生散乱而失去相互间的联系，可形成移位现象。
实验五-冰冻切片法ppt课件
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四、实验结果
观察小鼠肝脏细胞的形态
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五、作业
实验完毕，每人交制好的玻片标本1片，在 标签纸写上玻片名称及自己的姓名和日期；
实验报告（姓名和日期）。
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三、实验步骤
取材：引颈致死法杀死小鼠，取其肝脏，将新鲜肝脏组织切成1~1.5cm×1~1.5cm X 0.3~0.5cm 大小。组织块可不加任何处理，直接进行冰冻切片。另一种方法是组织先经10％中性福马林或 钙福马林固定，再水洗后冰冻切片。若组织用酒精固定，则固定后须用流水彻底除去组织内的 酒精，否则因酒精冰点低，不易冰冻。
切取的组织不能过大，组织过大
快速，用时短。
不容易冻结或者组织冻结不均，
影响切片及染色效果。
组织变化不大。
能很好保存脂肪，类脂等成分。
不容易制作较薄的切片。
能够比较完好地保存各种抗原活性及 组织块在冻结过程中容易产生水
酶类，特别是对于那些对有机溶剂或
的结晶而影响细胞的形态结构及
热的温度耐受能力较差的细胞膜表面
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半导体冰冻切片机构造
半导体制冷器 冷台 冷刀
制冷调节器 切片机
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一、实验目的
了解半导体冰冻切片机的基本构造； 练习半导体冰冻切片法制片。
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二、实验材料及用品
实验材料：小鼠肝脏 实验用具：载、盖玻片；显微镜；毛笔；半导
体冰冻制冷器、切片机等。 实验药品：甘油明胶液。
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抗原物质的定位，并且组织结构
抗原和水解酶保存较好。
也不如石蜡切片清晰。.Fra bibliotek3冰冻切片的适用范围
冰冻切片实验步骤
全部试验步骤1取颖组织于4%多聚甲醛固定24 小时230%蔗糖脱水48 小时以上3-250C 包埋〔冰冻切片机内〕4冰冻切片冰冻切片步骤冰冻切片免疫组化染色步骤：冰冻切片4~8μm，室温放置30 分钟后，入4℃丙酮固定10 分钟，PBS 洗，5 分钟×3 次。
用3%过氧化氢孵育5~10 分钟，以消退内源性过氧化物酶的活性。
PBS 冲洗，5 分钟×2 次。
下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤。
(见我发的前面的帖子)你确定你是冰冻切片吗！冰冻切片不能用热修复啊！！以下是我的步骤：1冰冻切片室温放置30 分钟后，入4℃丙酮固定10 分钟，PBS 洗，5 分钟×3。
用3％过氧化氢孵育5~10 分钟，PBS 洗，5 分钟×2。
25~10％正常山羊血清〔PBS 稀释〕封闭，室温孵育10 分钟。
倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2 小时或4℃过夜。
3PBS 冲洗，5 分钟×3 次。
4滴加滴加其次代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育30 分钟。
PBS 冲洗，5 分钟×3 次。
5滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30 分钟。
6PBS 冲洗，5 分钟×3 次。
7显色剂显色〔DAB〕。
8自来水充分冲洗，复染，封片。
冰冻切片免疫组化染色用的灭活内源性过氧化物酶，最好是用3%H2O2/甲醇溶液，室温20 分钟。
此配方不易产生脱片。
配制方法是在9ml 甲醇中加30%H2O2 1ml，混匀后使用，每次颖配制。
冰冻切片免疫组化染色步骤冰冻切片4~8mm，室温放置30 分钟后，入4℃丙酮固定10 分钟，PBS 洗，5 分钟×3。
用3％过氧化氢孵育5~10 分钟，消退内源性过氧化物酶的活性。
PBS 洗，5 分钟×2。
下接免疫组化染色操作步骤。
DAB 显色，显色时放置在白色纸上，观看显色程度以终止DAB 反响，最好把玻片置于显微镜上找到可能的阳性显色区域滴加DAB ，观看到阳性区和阴性区差异后终止，此时最 好有计时，以便于今后重复试验把握显色时间〔一般显色时间 2s-10min ，显色时间过长玻片两侧放置浸湿的卫生纸或棉球。
冰冻切片实验技术
实验技术：组织切片的制备点击次数：350 发布日期：2009-11-9 来源：长沙赢润仅供参考，谢绝转载，否则责任自负组织切片的制备二）切片方法-细节注意1 切片方法的选择光镜和免疫组化研究的切片一般为5μm，而神经组织切片为20-100μm，有利于追踪神经纤维的走行。
1.1 冰冻切片是免疫组织化学中最常用的一种切片方法，能够最大量的保存抗原、操作简便，主要适用于不稳定的抗原（如检测细胞膜的某些抗原成分），但标本来源受限。
冰冻切片时,组织中水分易形成冰晶,影响抗原定位。
冰晶小而多，对组织结构损害大。
因此可采用以下措施减少冰晶的形成：①速冻，缩短组织从-33～-43℃的时间。
具体方法是：⑴干冰-丙酮（乙醇）法：将150-200ml丙酮（乙醇）装入小保温杯内，逐渐加入干冰，直至饱和呈粘稠状，再加干冰不冒气泡时，温度可达-70℃。
用一小烧杯（50-100ml）内装异戊烷约50ml，再将烧杯缓慢置入干冰丙酮（乙醇）饱和液内，至异戊烷温度达-70℃时即可使用。
将组织（约1cm×0.8cm×0.5cm）t投入异戊烷内速冻30-60s后取出，置-80℃低温保存或置恒冷冰箱内以备切片；⑵液氮法：将组织块平放于软塑料瓶盖或特制小盒内（直径约2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾。
此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。
取出组织块后立即置入-80℃冰箱贮存或作恒冷切片。
②将组织置于20%-30%蔗糖溶液中1-3天，利用高渗吸收组织中水分，减少组织含水量。
冰冻切片一般用恒冷切片机。
切片后如不染色，必须将切片吹干，贮存于低温冰箱内，进行短暂预固定干燥后贮存于低温。
【目的】组织标本必须首先被制成组织切片，再经过染色处理，然后才能在显微镜下进行临床诊断和科学研究。
【原理】苏木素染色结合伊红染色是常规组织学染色技术，也称为H & E染色。
冰冻切片制片实验步骤及注意事项
冰冻切片制片实验步骤及注意事项冰冻切片（frozen section）是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度，然后进行切片的方法。
因其制作过程较石蜡切片快捷、简便，而多应用于手术中的快速病理诊断。
冰冻切片制片实验步骤1、组织固定：新鲜组织固定于4%多聚甲醛24h以上。
将组织从固定液取出在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整。
2、脱水：将修切好的组织放于15%的蔗糖溶液内4°冰箱脱水沉底后转入30%的蔗糖溶液内4°冰箱脱水沉底。
3、OCT包埋：将脱好水的组织取出用滤纸将表面水稍吸干后切面朝上放于包埋台上，组织周围滴上OCT包埋剂，将包埋台放在冰冻切片机的速冻台上速冻包埋，OCT变白变硬后即可进行切片。
4、切片：将包埋台固定于切片机上，先粗切将组织面修切平整后即可开始切片，切片厚°8-10μm。
将干净的载玻片平放于切出的组织片上方即可将组织贴于载玻片上。
-20°保存备用。
注意事项1、组织尽可能新鲜、骤冷愈快愈好，才能避免冰晶，常用的骤冷剂有：① CO2气（-78℃）② 丙酮干冰冷却的轻石油醚、乙烷和庚烷（-80℃）③ 液氮（-190℃）④ 液氮冷却的丙烷（-19℃）。
液氮适用于组织化学，较安全。
缺点：组织块易发生龟裂。
2、为防止水解酶和其他物质的移位、弥散，常用4℃、24小时的甲醛固定能很好地保存酶类。
但对许多脱氢酶和转移酶能灭活。
故不宜使用，低温，冷甲醛短时间固定（10分钟左右）固定，可显示琥珀酸脱氢酶。
3、电镜出现后，需要保存细胞的超微结构，以4%缓冲戊二醛（25%戊二醛16ml；0.1M二甲胂酸（pH7.）84ml；蔗糖8g）固定较好。
这些固定液主要用于水解酶，而不适于许多氧化还原酶和转移酶。
冰冻切片制作方法与注意事项
冰冻切片制作方法与注意事项冰冻切片是一种常见的制备生物组织切片的方法，其原理是将生物组织迅速冷冻并切割成极薄的切片，用于研究组织的形态结构和组织学变化。
下面是冰冻切片的制作方法和注意事项。
一、冰冻切片的制作方法：1.组织采集：选择需要研究的组织，如动物器官或植物部位，通常用组织固定剂进行固定处理，以保持组织的形态结构。
2.组织预处理：将固定的组织转移到含有蔗糖或蔗糖与聚乙二醇的冰冻液中，浸泡一定的时间使组织与冷冻液充分均匀接触，便于组织快速冷冻。
3.冰冻：使用液氮或刀片冷冻架等快速冷冻设备，将组织迅速冷冻至-20℃以下，使组织中的水分迅速形成冰晶，避免组织的形态结构变化。
4.切割：将冷冻的组织置于切片机或切片微波机上，用冷冻刀片将组织切割成薄片，通常厚度为10-30μm。
5.将切割好的切片用刷子或微型镊子移至载玻片上，通常用蛋白质固定剂或聚甲醛进行固定处理，以保持切片的形态结构。
6.干燥：将固定好的切片置于干燥器中，用适当的温度和时间干燥切片，使其充分固定在玻片上。
7.染色：根据需要可对切片进行染色处理，常见的染色方法有HE染色、银染色、免疫组化染色等。
二、冰冻切片的注意事项：1.快速冷冻：为了保持组织的形态结构和避免变形，必须采用快速冷冻的方法，将组织迅速冷冻至-20℃以下。
液氮和刀片冷冻架是常用的设备。
2.切片设备：选择适合的切片设备，如切片机或切片微波机。
刀片的选择也十分重要，常见的冰冻刀片有钢刀、玻璃刀和蜡刀，选择合适的刀片可以提高切片质量。
3.切片厚度：切割时要控制好切片的厚度，通常为10-30μm。
切片太薄容易导致组织切面不完整，切片太厚则不能得到清晰的显微镜图像。
4.切片技巧：切片技巧也很重要，需要稳定的手部技巧和耐心。
在切割时要保持刀片的稳定，避免划伤或碎裂组织。
5.切片保存：切好的切片需要妥善保存，可以用普通干燥器或冷冻干燥器进行干燥，避免切片变形和水分损失。
6.染色方法：根据需要选择合适的染色方法。
冰冻切片实验技术
实验技术：组织切片的制备点击次数：350 发布日期：2009-11-9 来源：长沙赢润仅供参考，谢绝转载，否则责任自负组织切片的制备二）切片方法-细节注意1 切片方法的选择光镜和免疫组化研究的切片一般为5μm，而神经组织切片为20-100μm，有利于追踪神经纤维的走行。
1.1 冰冻切片是免疫组织化学中最常用的一种切片方法，能够最大量的保存抗原、操作简便，主要适用于不稳定的抗原（如检测细胞膜的某些抗原成分），但标本来源受限。
冰冻切片时,组织中水分易形成冰晶,影响抗原定位。
冰晶小而多，对组织结构损害大。
因此可采用以下措施减少冰晶的形成：①速冻，缩短组织从-33～-43℃的时间。
具体方法是：⑴干冰-丙酮（乙醇）法：将150-200ml丙酮（乙醇）装入小保温杯内，逐渐加入干冰，直至饱和呈粘稠状，再加干冰不冒气泡时，温度可达-70℃。
用一小烧杯（50-100ml）内装异戊烷约50ml，再将烧杯缓慢置入干冰丙酮（乙醇）饱和液内，至异戊烷温度达-70℃时即可使用。
将组织（约1cm×0.8cm×0.5cm）t投入异戊烷内速冻30-60s后取出，置-80℃低温保存或置恒冷冰箱内以备切片；⑵液氮法：将组织块平放于软塑料瓶盖或特制小盒内（直径约2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾。
此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。
取出组织块后立即置入-80℃冰箱贮存或作恒冷切片。
②将组织置于20%-30%蔗糖溶液中1-3天，利用高渗吸收组织中水分，减少组织含水量。
冰冻切片一般用恒冷切片机。
切片后如不染色，必须将切片吹干，贮存于低温冰箱内，进行短暂预固定干燥后贮存于低温。
【目的】组织标本必须首先被制成组织切片，再经过染色处理，然后才能在显微镜下进行临床诊断和科学研究。
【原理】苏木素染色结合伊红染色是常规组织学染色技术，也称为H & E染色。
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冰冻切片法简介
冰冻切片法是一种在低温条件下使已固定或 新鲜组织块不经脱水和包埋先进行冰冻快速 冷却到一定硬度，然后在切片机上切片的一 种方法。
冰冻切片的优缺点
优点：
简便，可以不需要对组织固定、脱 水、透明、包埋等手续即可进行切 片，减少了一些中间环节。
快速，用时短。 组织变化不大。 能很好保存脂肪，类脂等成分。 能够比较完好地保存各种抗原活性
半导体冰冻切片机构造
半导体制冷器 冷台 冷刀
制冷调节器 切片机
一、实验目的
了解半导体冰冻切片机的基本构造； 练习半导体冰冻切片法制片。
二、实验材料及用品
实验材料：小鼠肝脏 实验用具：载、盖玻片；显微镜；毛笔；半导
体冰冻制冷器、切片机等。 实验药品：甘油明胶液。
三、实验步骤
及酶类，特别是对于那些对有机溶 剂或热的温度耐受能力较差的细胞 膜表面抗原和水解酶保存较好。
缺点：
不容易做连续切片。 切取的组织不能过大，组织过大
不容易冻结或者组织冻ห้องสมุดไป่ตู้不均， 影响切片及染色效果。
不容易制作较薄的切片。 组织块在冻结过程中容易产生水
的结晶而影响细胞的形态结构及 抗原物质的定位，并且组织结构 也不如石蜡切片清晰。
冰冻切片的温度要适宜，温度过低、过高会导致组织过硬或硬度 不够，从而影响切片质量，产生搓板状、梯田状、厚薄不均，破 碎或粉末状现象。根据器官组织形态结构和组成成分的不同，冰 冻组织切片的温度亦不同。推荐：乳腺、卵巢、子宫等：-20~25℃ 胃肠：-18~-20℃-甲状腺、肝，肾、脾等：-15℃左 右·脂肪组织一般在-35℃以下；
切片：切片厚度一般为10-15um。切下来的切片用湿毛笔从刀上挑起，置于清水中使其展开， 或直接粘于破片上。
封片：由于切片染色后不再经过脱水、透明等步骤，因此必须使用水溶性的封片剂，如甘油明 胶液，
注意事项
速冻是冰冻切片的关键，冷冻的速度可有效的减少冰晶的出现， 软组织以及细胞丰富的组织如肝、脾、淋巴结等2-4min；
取材：引颈致死法杀死小鼠，取其肝脏，将新鲜肝脏组织切成1~1.5cm×1~1.5cm X 0.3~0.5cm 大小。组织块可不加任何处理，直接进行冰冻切片。另一种方法是组织先经10％中性福马林或 钙福马林固定，再水洗后冰冻切片。若组织用酒精固定，则固定后须用流水彻底除去组织内的 酒精，否则因酒精冰点低，不易冰冻。
研组织等。 某些酶的显示如ATP酶，琥珀酸脱氢酶等。 神经病理学技术中的某些染色法如：Eager氏法，Marchi氏法，Cajal氏法，
Hortega氏法和Holzer氏法等。 对某些物质所进行的免疫荧光的研究。
冰冻切片的种类
冰冻切片的种类较多，有低温恒冷箱冰冻切片法、二 氧化碳冰冻切片法、甲醇循环制冷冰冻切片法、半导 体冰冻切片法等。这些方法，随着时代的变迁，科技 的发展，许多年前被认为是非常重要的技术，现在也 逐步被淘汰了。当然有些技术，如低温恒冷箱冰冻切 片法，正在受到青睐。
冰冻切片的适用范围
在手术进行中，突然发现病人的病变与原诊断，原定手术方案不相符合，或 者怀疑时，需要病理确定。
了解淋巴结内是否有转移的肿瘤细胞，或者转移的程度，以利于确定是否需 要彻底扫除淋巴结或者其它的治疗措施。
在做剖腹探查时所发现的肿块或者异样的组织。 显示组织中的脂肪和脂类物质，这常见于某些病例如脂肪瘤及肉瘤，某些科
切片机连接：半导体冰冻切片机的水路和电路按使用说明书要求接好。水流的次序为：自来水 龙头→冷台进水→冷台出水→冷刀进水→冷刀出水→下水。致冷器工作时，应始终保持水流畅 通，要牢牢记住，先通水，后通电；先关电源，后关水，否则将烧坏机器。必须保证一定的流 水量：>400ml/min
将新鲜材料置于冷台上冰冻组织，组织块冻结的硬度与切片的成败有密切关系，如切削后在刀 片上出现白色而脆的飞散碎片，即组织块冻结太硬；若为软弱的粥状则太软，只有适当硬度切 出的切片才能平展成形。这要根据工作经验，控制适当的致冷温度。
封片时要做到无气泡，无溢液、标签清楚端正，保证切片的整洁。
四、实验结果
观察小鼠肝脏细胞的形态
五、作业
实验完毕，每人交制好的玻片标本1片，在 标签纸写上玻片名称及自己的姓名和日期；
实验报告（姓名和日期）。