实验五 冰冻切片法
冷冻切片技术实验及冷冻切片机的基本操作
v1.0可编写可改正冷冻切片技术实验及冷冻切片机的基本操作实验目的1掌握冷冻切片的方法2掌握冷冻切片的用途实验原理冷冻切片是借助低温使组织冻结达到必定的硬度并经过冰起支撑作用来进行切片的一种方法。
速冻可减小冰晶直径，防止组织细胞损害。
制冷压缩机佛里昂制冷、半导体温差电制冷v1.0可编写可改正实验资料新鲜动物肝脏实验方法1准备将仪器翻开，样品台温度调至 -40 ℃。
2取材组织一定新鲜，尽可能不经水洗。
取材时应防止组织挤压，防备人为设想。
样品大小 5X5X3mm。
3速冻将样品放在样品台上，样品周围加水加固，冷冻5－10min.4切片高升温度至 -15 ℃（视样品而定），约5min 后开始切片，厚度 6-15um。
5制片将切片直接放在载波片上或先放在盛水（固定液）的培育皿中再转移到载波片上。
6染色察看吸干水，加一滴苏木精，加盖玻片，用显微镜察看。
7记录将察看的结果绘于实验报告上，整理自己用过的物件。
附：切片温度的设定脑-12℃肝脏-14℃肾脏-16℃肌肉-20℃皮肤 -25 ℃多脂肪组织-30 ℃经过固定的组织-5 ℃～-10 ℃附：迅速永远制片1固定 70 ％乙醇 5～ 10min ；2水洗 2min ；3苏木精染色 5 ～ 10min；4脱色 %HCl 至变红；5 蓝化变蓝；6 水洗 5 ～ 10s ；7 脱水 70% 2min；8 伊红染色 5 ～ 10min ；9脱水 100%乙醇 2minX2；10透明二甲苯 3min ；11封片中性树胶封片。
冷冻切片机的基本操作：1. 在使用前 2 小时开启电源，并将温度设定在-25 ℃ ;2. 将适合大小和厚度的标本放在蘑菇状杯上，加上冷冻蜡，夹在切片机的固定槽内;3. 准备好玻片，选择切片厚度，摇着手柄，即可做成切片;4. 将做成的切片当心的吸附在玻璃片上;5.使用结束后封闭电源 , 洁净腔体和擦干水气 , 做好使用记录。
6.为让水蒸气蒸发，请不要立刻封闭切片机的上盖移门，应到次日再关。
实验五-冰冻切片法ppt课件
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四、实验结果
观察小鼠肝脏细胞的形态
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五、作业
实验完毕，每人交制好的玻片标本1片，在 标签纸写上玻片名称及自己的姓名和日期；
实验报告（姓名和日期）。
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三、实验步骤
取材：引颈致死法杀死小鼠，取其肝脏，将新鲜肝脏组织切成1~1.5cm×1~1.5cm X 0.3~0.5cm 大小。组织块可不加任何处理，直接进行冰冻切片。另一种方法是组织先经10％中性福马林或 钙福马林固定，再水洗后冰冻切片。若组织用酒精固定，则固定后须用流水彻底除去组织内的 酒精，否则因酒精冰点低，不易冰冻。
切取的组织不能过大，组织过大
快速，用时短。
不容易冻结或者组织冻结不均，
影响切片及染色效果。
组织变化不大。
能很好保存脂肪，类脂等成分。
不容易制作较薄的切片。
能够比较完好地保存各种抗原活性及 组织块在冻结过程中容易产生水
酶类，特别是对于那些对有机溶剂或
的结晶而影响细胞的形态结构及
热的温度耐受能力较差的细胞膜表面
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5
半导体冰冻切片机构造
半导体制冷器 冷台 冷刀
制冷调节器 切片机
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6
一、实验目的
了解半导体冰冻切片机的基本构造； 练习半导体冰冻切片法制片。
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二、实验材料及用品
实验材料：小鼠肝脏 实验用具：载、盖玻片；显微镜；毛笔；半导
体冰冻制冷器、切片机等。 实验药品：甘油明胶液。
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抗原物质的定位，并且组织结构
抗原和水解酶保存较好。
也不如石蜡切片清晰。.Fra bibliotek3冰冻切片的适用范围
实验五 冰冻切片法解析
冰冻切片法简介
冰冻切片法是一种在低温条件下使已固定或 新鲜组织块不经脱水和包埋先进行冰冻快速 冷却到一定硬度，然后在切片机上切片的一 种方法。
冰冻切片的优缺点
优点：
简便，可以不需要对组织固定、脱 水、透明、包埋等手续即可进行切 片，减少了一些中间环节。
快速，用时短。 组织变化不大。 能很好保存脂肪，类脂等成分。 能够比较完好地保存各种抗原活性
半导体冰冻切片机构造
半导体制冷器 冷台 冷刀
制冷调节器 切片机
一、实验目的
了解半导体冰冻切片机的基本构造； 练习半导体冰冻切片法制片。
二、实验材料及用品
实验材料：小鼠肝脏 实验用具：载、盖玻片；显微镜；毛笔；半导
体冰冻制冷器、切片机等。 实验药品：甘油明胶液。
三、实验步骤
及酶类，特别是对于那些对有机溶 剂或热的温度耐受能力较差的细胞 膜表面抗原和水解酶保存较好。
缺点：
不容易做连续切片。 切取的组织不能过大，组织过大
不容易冻结或者组织冻ห้องสมุดไป่ตู้不均， 影响切片及染色效果。
不容易制作较薄的切片。 组织块在冻结过程中容易产生水
的结晶而影响细胞的形态结构及 抗原物质的定位，并且组织结构 也不如石蜡切片清晰。
冰冻切片的温度要适宜，温度过低、过高会导致组织过硬或硬度 不够，从而影响切片质量，产生搓板状、梯田状、厚薄不均，破 碎或粉末状现象。根据器官组织形态结构和组成成分的不同，冰 冻组织切片的温度亦不同。推荐：乳腺、卵巢、子宫等：-20~25℃ 胃肠：-18~-20℃-甲状腺、肝，肾、脾等：-15℃左 右·脂肪组织一般在-35℃以下；
切片：切片厚度一般为10-15um。切下来的切片用湿毛笔从刀上挑起，置于清水中使其展开， 或直接粘于破片上。
冰冻切片制片实验步骤及注意事项
冰冻切片制片实验步骤及注意事项冰冻切片（frozen section）是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度，然后进行切片的方法。
因其制作过程较石蜡切片快捷、简便，而多应用于手术中的快速病理诊断。
冰冻切片制片实验步骤1、组织固定：新鲜组织固定于4%多聚甲醛24h以上。
将组织从固定液取出在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整。
2、脱水：将修切好的组织放于15%的蔗糖溶液内4°冰箱脱水沉底后转入30%的蔗糖溶液内4°冰箱脱水沉底。
3、OCT包埋：将脱好水的组织取出用滤纸将表面水稍吸干后切面朝上放于包埋台上，组织周围滴上OCT包埋剂，将包埋台放在冰冻切片机的速冻台上速冻包埋，OCT变白变硬后即可进行切片。
4、切片：将包埋台固定于切片机上，先粗切将组织面修切平整后即可开始切片，切片厚°8-10μm。
将干净的载玻片平放于切出的组织片上方即可将组织贴于载玻片上。
-20°保存备用。
注意事项1、组织尽可能新鲜、骤冷愈快愈好，才能避免冰晶，常用的骤冷剂有：① CO2气（-78℃）② 丙酮干冰冷却的轻石油醚、乙烷和庚烷（-80℃）③ 液氮（-190℃）④ 液氮冷却的丙烷（-19℃）。
液氮适用于组织化学，较安全。
缺点：组织块易发生龟裂。
2、为防止水解酶和其他物质的移位、弥散，常用4℃、24小时的甲醛固定能很好地保存酶类。
但对许多脱氢酶和转移酶能灭活。
故不宜使用，低温，冷甲醛短时间固定（10分钟左右）固定，可显示琥珀酸脱氢酶。
3、电镜出现后，需要保存细胞的超微结构，以4%缓冲戊二醛（25%戊二醛16ml；0.1M二甲胂酸（pH7.）84ml；蔗糖8g）固定较好。
这些固定液主要用于水解酶，而不适于许多氧化还原酶和转移酶。
冷冻切片法流程
冷冻切片法流程冷冻切片法可是个很有趣的实验方法呢！让我来给你讲讲它的流程吧。
一、准备工作。
咱得先把要用的东西都准备好。
像冷冻切片机得提前检查好，确保它能正常工作。
还有载玻片、盖玻片，这些小物件可不能少。
冷冻剂也得备足了，这就像是给咱们的切片准备的“小冰箱”呢。
另外，取材工具也很重要，像手术刀之类的，要锋利又干净。
标本也是关键，要选取合适的组织，这个组织得具有代表性，就像选演员一样，得挑个能把整个故事讲清楚的“主角”组织。
二、取材。
这一步可不能马虎。
要快速地把组织取出来，为啥要快呢？因为时间一长，组织可能就会发生变化啦。
就像新鲜的水果放久了会烂一样，组织放久了结构可能就不那么准确了。
取出来的组织大小也要合适，不能太大也不能太小。
太大了放不进切片机，太小了又可能切不到想要的结构，就像穿衣服一样，得不大不小刚刚好。
而且在取材的时候，要尽量减少对组织的损伤，这组织可是很“娇弱”的呢。
三、冷冻。
把取好的组织放到冷冻切片机里面冷冻。
这个过程就像是把食物放进冰箱速冻一样。
冷冻的温度得调好，不能太冷也不能不够冷。
太冷了可能会让组织变得太硬，容易碎掉，就像冰块掉地上容易裂一样。
不够冷呢，组织又切不好，软趴趴的怎么能切出漂亮的切片呢。
在冷冻的时候还要注意观察组织的状态，就像看着锅里的菜有没有熟一样。
四、切片。
等组织冷冻好了就可以切片啦。
切片的时候手要稳，就像绣花一样。
切片的厚度也很有讲究，太厚了看不清楚细胞结构，太薄了又容易切坏。
这就需要不断地练习，找到那种恰到好处的感觉。
而且切出来的切片要完整，不能缺边少角的，不然就像漂亮的拼图少了几块，多可惜呀。
五、贴片。
切好的片子要贴到载玻片上。
这个时候要小心操作，就像把小宝贝轻轻地放在床上一样。
要确保片子贴得平平整整的，不能有褶皱，要是有褶皱就像衣服没熨平一样，看着就不舒服，而且还会影响观察呢。
六、染色。
贴片完成后就可以染色啦。
染色剂就像给组织穿上不同颜色的衣服，这样我们就能更清楚地看到不同的结构啦。
冰冻切片法详细步骤
冰冻切片法详细步骤冰冻切片法是组织化学，特别是酶组织化学最常用的切片技术，固定或未固定的组织样品均可进行冰冻切片，新鲜组织冰冻切片对组织细胞内酶类保存最佳，尤其对热、酸、碱、有机溶剂等耐受能力弱的酶和化学物质更加适用。
冰冻切片也是免疫细胞化学研究中常用的切片方法，能够较完好地保存多种抗原，尤其是表面抗原的抗原性。
在冰冻切片中，组织中水分易形成冰晶，往往影响酶和抗原的定位。
一般认为冰晶少而大时，影响较小；冰晶小而多时，对组织结构损害较大，在含水量较多的组织脏器如脑、心肌、骨骼肌中上述现象更易发生。
冰晶形成的主要原因是冷冻速度缓慢，温度偏高，细胞内冷冻不均匀所致，常采取以下措施以减少冰晶的形成。
1. 骤冷通常采用骤冷、速冻(1~10°C/s 的冷冻速度）的方法可减少冰晶形成。
(1) 干冰－丙酮（乙醇）法。
将150~200 ml 丙酮（乙醇）装入小保温杯内，逐渐加入干冰，直至饱和呈黏稠状，再加干冰不再冒泡时，温度可达-70°C ，用一小烧杯(50~100 ml) 装上异戊烧约50 ml, 再将烧杯缓慢置入干冰－丙酮（乙醇）饱和液内，至异戊烧温度达-70°C 时即可使用。
将组织块（大小为1 cmX0. 8 cmX0. 5 cm) 投入异戊烧内速冻30~60s 后取出，或置恒冷箱内以备切片，或置-80°C低温冰箱内贮存。
(2) 液氮法。
将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2 cm) ，如组织块小可适抵加 OCT 包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保待原位切勿浸入液氮中， 10~20 s 组织即迅速冰结成块。
取出组织冰块立即置入-80°C 冰箱贮存备用，或置入恒冷箱切片机冰冻切片。
2. 冷冻保护加入冷冻保护物质以防止冻害，并在冷冻情况下保持细胞和组织的活性。
防止冻害的物质有甘油、二甲亚砜(DMSO) 、蔗糖、甘露糖、聚乙烯吡咯烧酮(PVP) 等。
冰冻切片制作方法与注意事项
冰冻切片制作方法与注意事项一、固定：固定即借助化学试剂是组织和细胞中的有机和无机成分凝固或沉淀，停止发生死后组织变化，尽量保持其活体状态的过程。
固定的方法有浸泡固定法，注射、灌注固定法，蒸汽固定法，本实验用的是注射、关注固定法：某些组织块由于体积过大或固定液极难流入内部或需要对整个脏器或整个动物进行固定，就可采用灌注或灌流固定法。
固定时将固定液直接注入动物的血管，经血管分支到达整个组织或全身，从二十只得到充分固定。
固定液分为单纯固定液和混合固定液。
单纯固定液有甲醛、乙醇、氯化汞、醋酸、苦味酸等，混合固定液包括Bouin液、Zenker液、Carnoy液、中性甲醛液等。
本实验用的固定液为4%甲醛（10%福尔马林）。
固定后的处理：用水配制的固定液固定后应用流水冲洗，可是组织中的固定液随时溢出和随时洗去。
对小动物和脑组织等，应以浸泡为主，即能达到冲洗的目的，又不损害组织。
【注意事项】1.固定要及时。
2.组织块的大小要合适。
3.应有足够的固定液，一般与组织块的比例为20:1，容器勿过小，组织勿过多。
4.固定时间要合适，甲醛固定液一般固定两天左右，第一天要更换一次固定液。
5.要进行促使固定，在固定期间轻轻地搅动组织或摇动容器使组织移动有利于固定液的渗透，适当提高温度也可缩短固定时间。
6.选择合适的固定液。
7.一次取材数量过多时，应对取材部位和顺序进行编号，并及时做好记录。
二、脱水脱水就是用某些溶剂逐步将组织块内的水分置换出来的过程，使用的试剂称为脱水剂。
脱水剂有非石蜡溶剂的脱水剂如乙醇、丙酮等，和脱水兼石蜡的脱水剂如正丁醇等。
本实验所用的是乙醇脱水。
乙醇是最常用的脱水剂，其优点是脱水能力强，即能与水相混合，又能与透明剂相混，并可使组织硬化，便于切片。
缺点是穿透组织的速度快，且容易使组织收缩、变脆。
为克服这一缺点，在一般脱水中，应采用循序渐进的方法，逐步升级，经一系列不同浓度的乙醇，使组织中的水分逐渐被乙醇代替。
冷冻切片方法及注意事项
冷冻切片方法及注意事项冷冻切片是一种常用的组织学研究方法，它能够帮助研究人员观察和分析生物组织的结构和功能。
下面将详细介绍冷冻切片的方法及注意事项。
1.组织采集：首先需要选择适当的生物组织样本，可通过手术切取、尸检或动物献体等方式获得。
2.组织处理：取出组织样本后，应立即进行处理，以防止样本脱水和坏死。
可将组织放入理化盐水或生理盐水中，避免干燥、坍塌或变形。
3.固定组织：使用适当的固定剂对组织进行固定，以保持组织结构的完整性。
常用的固定剂有福尔马林、戊二醛、乙醛等。
固定时间应根据组织大小和厚度进行调节，较小的组织可以固定2-4小时，而较大的组织可能需要24小时以上。
4.预冷冻：固定后的组织应在冷冻前进行预冷冻处理，以提高冷冻切片的质量。
预冷冻的方法包括放入冷冻剂中（如液氮、干冰等）或将其放入冰盒中进行冷藏，使组织完全冷却。
5.冷冻切片：使用冷冻切片机将预冷冻的组织切成薄片。
为了获得更好的切片结果，刀片的角度和厚度需要进行适当的调整。
同时，切制时需要快速而轻柔地移动切片机，以防止组织被拉伸或损坏。
6.切片收集：将切片收集在玻片上，通常使用细长形的切片夹或切片板来收集切片。
确保切片不受损并保持平整。
7.切片保存：将切片放入适当的保存溶液中，如PBS（磷酸盐缓冲液）或甘油等，以防止切片干燥和变形。
可以根据需要选择冷藏或冷冻保存。
冷冻切片需要注意以下事项：1.样本质量：选择新鲜、完整的组织样本，避免坏死、变性或损伤的组织。
2.固定剂选择：选择适当的固定剂进行组织固定，以保持组织结构的完整性。
3.冷冻速度：组织应尽快冷却，以避免组织脱水或破坏。
冷冻速度过慢可能会导致晶体形成，影响切片质量。
4.切片机状态：保持切片机的良好状态，定期检查刀片的锋利度和调整角度，以确保切片的质量。
5.切片技巧：需要轻柔、均匀地切片，避免组织被拉伸或扭曲。
同时，切片过程中需要快速操作，以减少冰晶对组织的破坏。
6.切片收集：收集切片时要避免切片叠加或悬浮，以免影响切片的观察和分析。
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缺点：
不容易做连续切片。 切取的组织不能过大，组织过大 不容易冻结或者组织冻结不均， 影响切片及染色效果。 不容易制作较薄的切片。 组织块在冻结过程中容易产生水 的结晶而影响细胞的形态结构及 抗原物质的定位，并且组织结构 也不如石蜡切片清晰。
冰冻切片的适用范围
在手术进行中，突然发现病人的病变与原诊断，原定手术方案不相符合，或 者怀疑时，需要病理确定。 了解淋巴结内是否有转移的肿瘤细胞，或者转移的程度，以利于确定是否需 要彻底扫除淋巴结或者其它的治疗措施。 在做剖腹探查时所发现的肿块或者异样的组织。 显示组织中的脂肪和脂类物质，这常见于某些病例如脂肪瘤及肉瘤，某些科 研组织等。 某些酶的显示如ATP酶，琥珀酸脱氢酶等。 神经病理学技术中的某些染色法如：Eager氏法，Marchi氏法，Cajal氏法， Hortega氏法和Holzer氏法等。 对某些物质所进行的免疫荧光的研究。
四、实验结果
观察小鼠肝脏细胞的形态
五、作业
实验完毕，每人交制好的玻片标本1片，在
标签纸写上验五 冰冻切片法
冰冻切片法简介
冰冻切片法是一种在低温条件下使已固定或
新鲜组织块不经脱水和包埋先进行冰冻快速
冷却到一定硬度，然后在切片机上切片的一
种方法。
冰冻切片的优缺点
优点：
简便，可以不需要对组织固定、脱 水、透明、包埋等手续即可进行切 片，减少了一些中间环节。 快速，用时短。 组织变化不大。 能很好保存脂肪，类脂等成分。 能够比较完好地保存各种抗原活性 及酶类，特别是对于那些对有机溶 剂或热的温度耐受能力较差的细胞 膜表面抗原和水解酶保存较好。
冰冻切片的种类
冰冻切片的种类较多，有低温恒冷箱冰冻切片法、二 氧化碳冰冻切片法、甲醇循环制冷冰冻切片法、半导 体冰冻切片法等。这些方法，随着时代的变迁，科技 的发展，许多年前被认为是非常重要的技术，现在也 逐步被淘汰了。当然有些技术，如低温恒冷箱冰冻切 片法，正在受到青睐。
半导体冰冻切片机构造
半导体制冷器
冷台 冷刀
制冷调节器
切片机
一、实验目的
了解半导体冰冻切片机的基本构造；
练习半导体冰冻切片法制片。
二、实验材料及用品
实验材料：小鼠肝脏
实验用具：载、盖玻片；显微镜；毛笔；半导 体冰冻制冷器、切片机等。 实验药品：甘油明胶液。
三、实验步骤
取材：引颈致死法杀死小鼠，取其肝脏，将新鲜肝脏组织切成1~1.5cm×1~1.5cm X 0.3~0.5cm 大小。组织块可不加任何处理，直接进行冰冻切片。另一种方法是组织先经10％中性福马林或 钙福马林固定，再水洗后冰冻切片。若组织用酒精固定，则固定后须用流水彻底除去组织内的 酒精，否则因酒精冰点低，不易冰冻。 切片机连接：半导体冰冻切片机的水路和电路按使用说明书要求接好。水流的次序为：自来水 龙头→冷台进水→冷台出水→冷刀进水→冷刀出水→下水。致冷器工作时，应始终保持水流畅 通，要牢牢记住，先通水，后通电；先关电源，后关水，否则将烧坏机器。必须保证一定的流 水量：>400ml/min 将新鲜材料置于冷台上冰冻组织，组织块冻结的硬度与切片的成败有密切关系，如切削后在刀 片上出现白色而脆的飞散碎片，即组织块冻结太硬；若为软弱的粥状则太软，只有适当硬度切 出的切片才能平展成形。这要根据工作经验，控制适当的致冷温度。 切片：切片厚度一般为10-15um。切下来的切片用湿毛笔从刀上挑起，置于清水中使其展开， 或直接粘于破片上。 封片：由于切片染色后不再经过脱水、透明等步骤，因此必须使用水溶性的封片剂，如甘油明 胶液，
注意事项
速冻是冰冻切片的关键，冷冻的速度可有效的减少冰晶的出现， 软组织以及细胞丰富的组织如肝、脾、淋巴结等2-4min；
冰冻切片的温度要适宜，温度过低、过高会导致组织过硬或硬度 不够，从而影响切片质量，产生搓板状、梯田状、厚薄不均，破 碎或粉末状现象。根据器官组织形态结构和组成成分的不同，冰 冻组织切片的温度亦不同。推荐：乳腺、卵巢、子宫等：-20~25℃ 胃肠：-18~-20℃-甲状腺、肝，肾、脾等：-15℃左 右· 脂肪组织一般在-35℃以下； 封片时要做到无气泡，无溢液、标签清楚端正，保证切片的整洁。