急性皮肤刺激性或腐蚀性试验.doc
《动物毒理实验》课件：实验3 皮肤刺激性试验
皮肤刺激强度分级
皮肤局部反应
无刺激性 轻度刺激性
无异常改变 充血、红斑
中等刺激性
红斑，少量小出血点，水肿， 少量丘疹以及小水疱
强刺激性
红斑，皮下出血，水肿，有很 多小水疱并有可能合并成大水 疱，糜烂，表皮剥落，有溃疡 形成等
评分 0 <2
2~6
>6
方法评价
皮肤刺激试验的结果不仅与检测技术有关， 也与试验过程中的质量控制相关。
经4~8h后，除去斑贴物，每24h观察一次各小区皮肤的局部 反应，连续观察4d，按皮肤刺激反应评分（表1），定量地 评定受试化学物对皮肤局部刺激作用的强度。红斑通过肉眼 观察，水肿通过轻轻触摸的方法来评分。
表1 皮肤刺激强度反应评分
皮肤反应强度
评分
无红斑
极轻微红斑（勉强可见）
1
A.红斑和 边界清晰的红斑（明显红斑，淡红至鲜红色） 2
本法与局部全封闭斑贴法不同之处在于： 1.每组的白色家兔数不应少于3只； 2.采用纱布作斑贴物，在无刺激作用的前提下，用半封
闭敷料固定； 3.斑贴不需要在擦伤皮肤上进行； 4.斑贴4h，然后去掉斑贴并清洗皮肤，观察0.5h、1h、
24h、48h和72h后的皮肤反应。 皮肤刺激反应评分同全封闭法。
结果分析
皮肤刺激试验又称皮肤原发性刺激试验。
试验目的
了解受试化学物对皮肤的直接刺激作 用以及刺激强度。
试验材料——实验动物
实验动物：成年白色家兔或白色豚鼠， 首选白色家兔。
在皮肤刺激试验中，动物品种的选择 很重要。目前多选用兔和豚鼠，对于 强刺激或无刺激作用的化学物选用家 兔检测效果好，但对作用缓和的刺激 性化学物，选用豚鼠所获得的试验结 果较准确。
皮肤刺激性腐蚀性试验技术指导原则》起草说明
附件2《皮肤刺激性/腐蚀性试验技术指导原则（征求意见稿）》起草说明为规范开展化妆品和新原料的安全评估工作，根据《化妆品监督管理条例》《化妆品注册备案管理办法》《化妆品注册备案资料管理规定》《化妆品新原料注册备案资料管理规定》及相关法律法规、强制性国家标准和技术规范的要求,国家药监局化妆品监管司组织中国食品药品检定研究院（以下简称中检院）组织起草了《皮肤刺激性/腐蚀性试验技术指导原则（征求意见稿）》（以下简称《技术指导原则（征求意见稿）》）。
现将起草的有关情况说明如下：一、起草的必要性2021年5月1日，《化妆品监督管理条例》和相关配套法规已正式施行。
我国《化妆品安全技术规范》（2015版）中“毒理学试验方法”规定：化妆品新原料需进行皮肤和急性眼刺激性/腐蚀性试验，同时化妆品产品在投放市场前，对于每天使用的化妆品需进行多次皮肤刺激性试验，进行多次皮肤刺激性试验者不再进行急性皮肤刺激性试验；对于间隔1日或数日使用或使用后冲洗的化妆品需进行急性皮肤刺激性试验。
《化妆品注册和备案检验工作规范》《化妆品注册备案资料管理规定》中规定，发用类和芳香类化妆品需要进行急性皮肤刺激性试验；护肤类和彩妆类化妆品需要进行多次皮肤刺激性试验。
此外，该试验可对新原料是否具有皮肤刺激性进行检测或安全评估。
因此，中检院组织制定《技术指导原则》（征求意见稿），以规范应用皮肤刺激性/腐蚀性试验评价化妆品和新原料的皮肤刺激性。
二、制定原则（一）依法依规原则。
《技术指导原则（征求意见稿）》遵循依法依规原则，贯彻落实《化妆品监督管理条例》及配套法规文件中关于化妆品和新原料的法规要求，研究皮肤刺激性/腐蚀性试验的具体要求，切实为化妆品和新原料的安全评估提供技术指导，也为技术审评以及监管提供依据。
（二）公开透明原则。
《技术指导原则（征求意见稿）》起草过程中，坚持“公开透明、广泛参与”原则，充分参考国内外相关法规和技术标准，积极征求监管部门、专家、行业协会意见，同时根据意见反馈情况科学合理地进行修改完善。
毒理学实验讲解
3 、剂量设计
? 受试样品0.5ml(g) ，均匀涂布于受试部 位。如受试样品难以获得，或易产生全身 毒性等原因，用量可适当减少。但为了试 验的一致性，测试面积应力求相等。
4 、试验步骤
1 ）试验前准备 ? 试验前24h ，将实验动物脊柱两侧毛剪去
或剃掉，不可损伤表皮，去毛范围左右各 3cm ×3cm 。24h 后，选择皮肤健康完整 无损的动物进行试验。不应在长有浓密岛 状毛的部位进行受试样品试验。
?剂量设计： ? 预实验：文献LD 50 =50-92mg/kg ? 设置400 、200 、100 、50 、25mg/kg
五个剂量，每剂量 3 只鼠。 ? 找出LD 100 和LD 0 ? 组距i= （lgLD 100 -lgLD 0）/ （n-1 ） ? n是实验组数；i是正式实验中两个相邻剂量
组的剂量对数之差
? A: lg200=2.301 ? B: lgx=2.301-i ? C: lgy=2.301-2i ? D: lgz=2.301-3i ? E: lgw=2.301-4i ? F: lg50=1.690
?1：k系列稀释法 ? 最大剂量组浓度C1 （母液浓度）
C1=200mg/kg=2mg/10g 0.2ml/10g →2mg/0.2ml= 10mg/ml ? 每组最大体积m=20ml （设每只鼠需2ml ） ? k：相邻两组剂量之比=64.89/85.981 =0.75 ? V总=m/ （1-k ）=81.53ml （各组母液和）
应选作实验动物。 – (6) 消化道：无呕吐、腹泻，粪便成形，肛门附近被毛洁净。 – (7) 神经系统：无震颤、麻痹。若动物 (大鼠、小鼠)出现圆圈动
作或提尾倒置呈圆圈摆应放弃该动物。 – (8) 四肢及尾：四肢、趾及尾无红肿及溃疡。
04 南京医科大学卫生分析检测中心-测试能力
所需时间（天）
Needed time (d)
健康毒理
Health Effects
1.
急性经口毒性试验
Acute Oral Toxicity Test
401
401
50~100
25~30
2.
急性经皮毒性试验
Acute Dermal Toxicity Test
402
402
南京医科大学卫生分析检测中心
Center of Hygienic Analysis & Detection，Nanjing Medical University
项目领域
Testing field
序号
No.
项目名称
Name of study
方法号
Method code
OECD编号
OECD code
所需样品量（克）
418
418
100
50
19.
有机磷化合物亚慢性（28天）染毒的迟发性神经毒性试验
Delayed Neurotoxicity of Organophosphorus Substances:28-day Repeated Dose Study
419
419
500
90
20.
急性经口毒性：固定剂量法
Acute Oral Toxicity –Fixed Dose Method
25.
急性经口毒性：上下增减剂量法
Acute Oral Toxicity: Up and Down Procedure
425
425
50
30
26.
致癌试验
Carcinogenicity Studies
GBZ240.6-急性皮肤刺激试验
无红 斑 轻微 红 斑 红斑 和焦痂形成 明显 红 斑
1
72h各 观察时点最高积分均值 ,按 表 2判 定皮肤刺激强度 。
1
皮肤刺激反应评分
评 分
2
中等程度到重度程度 红斑 严重红斑至焦痂形成
GBz/T240.6-2011
表 1(续 )
皮 肤 反 应 无水肿 很轻微水肿 水肿形成
1
评
分
6.4.2 染毒
取受试样 品 0.5mL(g)直 接涂布在皮肤 上 ,用 4层 纱 布 (2.5cm× 2.5cm)和 一层玻璃 纸或类似物 覆盖 ,再 用无刺激性胶布和绷带加 以固定 。对侧皮肤作 为对 照 。采用封 闭试 验 ,敷 用 时间为 4h。 试 验 结束后 ,用 温水或无刺激性溶剂清除残 留受试样 品 。 如怀疑受试样 品可能引起严重刺激或腐蚀作用 ,可 采用分段试验 ,将 三个涂布受试样 品的纱布块 同 时或先后敷贴于一 只家兔背部脱 毛区皮肤上 ,分 别 于涂敷后 3min、 60min和 4h取 下一块纱 布 ,皮 肤涂 敷部位在任 一时间点积分等于 8分 ,即 可停 止试验 。
限 内观察 和评 价 刺激 反 应 的程
作详细的记录 。
1犭
以进行 可 逆 或不 可逆效 应 的观 察 ,以
便进行完整 的评价 ,但 一般不超过
强碱物质 (pH≥ 11),由 于可预见其腐蚀特
性 ,不 必做本试验 ;若 已知受试样 品有很强 的经皮 吸收毒性 (LD5。 ≤ zOO mg/kg体 重 )的 物质不必进行本 试验 ;在 充分并公认 的体外试验结果 中确定可能产生腐蚀或刺 激 毒性 的物质不必进 行体 内试 验 。如果 从受试样 品的结构活性构效关系可 以预见 潜在 的腐蚀毒性 ,则 不必做本试验 。
急性皮肤刺激试验
急性皮肤刺激试验1 目的确定化学品对哺乳动物皮肤局部是否有刺激作用及程度，为制定化学品对皮肤的保护措施提供依据。
2 制定依据《化妆品卫生规范（2007版）》。
3试验方法3.1受试样品处理液体受试物一般不需稀释，可直接使用原液。
若受试物为固体，应将其研磨成细粉状，并用水或其它无刺激性溶剂充分湿润，以保证受试物与皮肤有良好的接触。
使用其它溶剂，应考虑到该溶剂对受试物皮肤刺激性的影响。
需稀释后使用的产品，先进行产品原型的皮肤刺激性/腐蚀性试验，如果试验结果显示中度以上刺激性，可按使用浓度为受试物再进行皮肤刺激性/腐蚀性试验。
受试物为强酸或强碱（pH 值≤2 或≥11.5），可以不再进行皮肤刺激试验。
此外，若已知受试物有很强的经皮吸收毒性，经皮LD50 小于200 mg/kg 体重或在急性经皮毒性试验中受试物剂量为2000 mg/kg 体重仍未出现皮肤刺激性作用，也无需进行急性皮肤刺激性试验。
3.2实验动物和饲养环境多种哺乳动物均可被选为实验动物，首选白色家兔。
应使用成年、健康、皮肤无损伤的动物，雌性和雄性均可，但雌性动物应是未孕和未曾产仔的。
实验动物至少要用4只，如要澄清某些可疑的反应则需增加实验动物数。
实验动物应单笼饲养，试验前动物要在实验动物房环境中至少适应3d 时间。
实验动物及实验动物房应符合国家相应规定。
选用常规饲料，饮水不限制。
3.3 急性皮肤刺激性试验步骤3.3.1 试验前约24h，将实验动物背部脊柱两侧毛剪掉，不可损伤表皮，去毛范围左、右各约3cm×3cm。
3.3.2 取受试物约0.5mL（g）直接涂在皮肤上，然后用二层纱布（2.5cm×2.5cm）和一层玻璃纸或类似物覆盖，再用无刺激性胶布和绷带加以固定。
另一侧皮肤作为对照。
采用封闭试验，敷用时间为4h。
对化妆品产品而言，可根据人的实际使用和产品类型，延长或缩短敷用时间。
对用后冲洗的化妆品产品，仅采用2h 敷用试验。
化妆品安全实验室皮肤刺激性检测结果判读及上报流程
化妆品安全实验室皮肤刺激性检测结果判读及上报流程1.引言本文档旨在介绍化妆品安全实验室中皮肤刺激性检测的结果判读及上报流程。
该流程的目的是确保化妆品在使用过程中对消费者的皮肤不会引起刺激或不良反应。
2.实验室皮肤刺激性检测2.1 测试项目实验室皮肤刺激性检测包括以下项目：红斑、水肿、严重刺激和腐蚀性。
2.2 检测方法和操作流程2.2.1 选择适当的皮肤模型和组织模型进行实验。
2.2.2 在化妆品样品上施加适当的剂量。
2.2.3 定期观察和测量皮肤的反应，包括红斑、水肿等。
2.2.4 结束实验后，使用合适的评分标准对测试结果进行评估。
2.3 数据记录和分析2.3.1 将实验数据记录在实验报告中，包括测试样品信息、实验条件和测试结果等。
2.3.2 结合评分标准对实验结果进行分析和判读。
3.结果判读3.1 判定标准根据相关法规和标准，将实验结果划分为以下几个等级：非刺激、轻度刺激、中度刺激和重度刺激。
3.2 判读流程3.2.1 根据测试结果和评分标准，判定样品的刺激等级。
3.2.2 执行有关刺激等级的相应措施，包括重新优化产品配方、调整使用方法或停止销售。
4.结果上报流程4.1 报告准备4.1.1 准备标准化的实验报告模板，并填写相关测试信息和结果。
4.1.2 确认报告的准确性和完整性。
4.2 报告审批4.2.1 将报告提交给负责审批的主管部门。
4.2.2 主管部门对报告进行审查，确保实验结果和判读符合法规要求。
4.3 报告上报4.3.1 完成审批后，报告将上报给相关部门，如市场监管机构或行业协会等。
4.3.2 上报报告的方式可以是电子邮件、在线上报系统或书面提交。
5.结论本文档概述了化妆品安全实验室中皮肤刺激性检测结果判读及上报流程。
通过严格的测试和判定流程，化妆品企业可以评估其产品对消费者皮肤的刺激性，并采取必要的措施来确保产品的安全性。
这一流程的实施有助于维护消费者的权益，促进行业的可持续发展。
《动物毒理实验》课件：实验3 皮肤刺激性试验
目录
试验原理 试验目的 试验材料 试验方法 结果分析 方法评价
试验原理
局部刺激试验是毒理学试验中的一项重要内 容，对可能具有局部刺激作用的化学物必须 进行此项试验，但对具有强酸（pH≤2 ）或 强碱（pH≥11.5 ）性质的化学物不需做本 试验，因为这些化学物属于腐蚀性物质。另 外，已知具有高毒性的化学物也不必进行皮 肤刺激试验。
凡是杀虫剂、杀真菌剂、杀鼠剂以及具有刺 激性的兽药等化学物均需进行局部皮肤刺激 试验，以保护接触人员的健康。
试验药物的量一般以0.5ml或0.5g为宜，评 价固体受试化学物时不一定要将其配成溶液， 具体可酌情而定。
将表1中A项和B项评分结果相加，凡总分低 于2分者可视为无刺激性或轻度刺激性； 2~6分之间者具有中等刺激性；6分以上者 具有强刺激性。
刺激性极强的物质，试用前需经适当稀释后 再进行斑贴，如稀释用的溶剂本身具有刺激 作用，则需作溶剂对照试验。
另外，也可按表2中的标准来判断试验结果。
表2 皮肤刺激强度分级标准
皮肤刺激强度分级
ห้องสมุดไป่ตู้
皮肤局部反应
无刺激性 轻度刺激性
无异常改变 充血、红斑
中等刺激性
红斑，少量小出血点，水肿， 少量丘疹以及小水疱
强刺激性
红斑，皮下出血，水肿，有很 多小水疱并有可能合并成大水 疱，糜烂，表皮剥落，有溃疡 形成等
评分 0 <2
2~6
>6
方法评价
皮肤刺激试验的结果不仅与检测技术有关， 也与试验过程中的质量控制相关。
皮肤刺激试验又称皮肤原发性刺激试验。
试验目的
了解受试化学物对皮肤的直接刺激作 用以及刺激强度。
试验材料——实验动物
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四、皮肤刺激性/腐蚀性试验
Dermal Irritation/Corrosion Test
1 范围
本规范规定了动物皮肤刺激性或腐蚀性试验的基本原则、要求和方法。
本规范适用于化妆品原料及其产品安全性毒理学检测。
2 规范性引用文件
OECD Guidelines for Testing of Chemicals (No.404, July 1992)
USEPA OPPTS Harmonized Test Guidelines (Series 870. 2500, Aug. 1998 )
3 试验目的
确定和评价化妆品原料及其产品对哺乳动物皮肤局部是否有刺激作用或腐蚀作用及其程度。
4 定义
4.1 皮肤刺激性(Dermal irritation)：皮肤涂敷受试物后局部产生的可逆性炎性变化。
4.2 皮肤腐蚀性(Dermal corrosion)：皮肤涂敷受试物后局部引起的不可逆性组织损伤。
5试验的基本原则
将受试物一次(或多次)涂敷于受试动物的皮肤上，在规定的时间间隔内，观察动物皮肤局部刺激作用的程度并进行评分。
采用自身对照，以评价受试物对皮肤的刺激作用。
急性皮肤刺激性试验观察期限应足以评价该作用的可逆性或不可逆性。
6 试验方法
6.1 受试物
液体受试物一般不需稀释，可直接使用原液。
若受试物为固体，应将其研磨成细粉状，并用水或其它无刺激性溶剂充分湿润，以保证受试物与皮肤有良好的接触。
使用其它溶剂，应考虑到该溶剂对受试物皮肤刺激性的影响。
受试物为强酸或强碱（pH值≤2或≥11.5），可以不再进行皮肤刺激试验。
此外，若已知受试物有很强的经皮吸收毒性，经皮LD50小于200mg/kg体重或在急性经皮毒性试验中受试物剂量为5000mg/kg体重仍未出现皮肤刺激性作用，也无需进行急性皮肤刺激性试验。
6.2 实验动物和饲养环境
多种哺乳动物均可被选为实验动物，首选白色家兔。
应使用成年、健康、皮肤无损伤的动物，雌性和雄性均可，但雌性动物应是未孕和未曾产仔的。
实验动物至少要用4只，
如要澄清某些可疑的反应则需增加实验动物数。
实验动物应单笼饲养，试验前动物要在实验动物房环境中至少适应3d时间。
实验动物及实验动物房应符合国家相应规定。
选用常规饲料，饮水不限制。
6.3急性皮肤刺激性试验步骤
6.3.1 试验前约24 h ，将实验动物背部脊柱两侧毛剪掉，不可损伤表皮，去毛范围左、右各约2cm×3cm。
6.3.2 取受试物约0. 5 mL （g ）直接涂在皮肤上，然后用二层纱布（2.5cm×2.5cm ）和一层玻璃纸或类似物覆盖，再用无刺激性胶布和绷带加以固定。
另一侧皮肤作为对照。
采用封闭试验，敷用时间为4h 。
对化妆品产品而言，可根据人的实际使用和产品类型，延长或缩短敷用时间。
对用后冲洗的化妆品产品，仅采用2 h 敷用试验。
试验结束后用温水或无刺激性溶剂清除残留受试物。
如怀疑受试物可能引起严重刺激或腐蚀作用，可采取分段试验，将三个涂布受试物的纱布块同时或先后敷贴在一只家兔背部脱毛区皮肤上，分别于涂敷后3 min 、60min 和4 h 取下一块纱布，皮肤涂敷部位在任一时间点出现腐蚀作用，即可停止试验。
6.3.3 于清除受试物后的1、24、48和72 h 观察涂抹部位皮肤反应，按表1进行皮肤反应评分，以受试动物积分的平均值进行综合评价，根据24、48和72 h 各观察时点最高积分均值，按表2判定皮肤刺激强度。
6.3.4 观察时间的确定应足以观察到可逆或不可逆刺激作用的全过程，一般不超过14d 。
6.4 多次皮肤刺激性试验步骤
6.4.1 试验前将实验动物背部脊柱两侧被毛剪掉，去毛范围各为2cm×3cm ，涂抹面积2.5 cm×2.5cm 。
6.4.2 取受试物约0.5mL(g)涂抹在一侧皮肤上，当受试物使用无刺激性溶剂配制时，另一侧涂溶剂作为对照，每天涂抹1次，连续涂抹14d 。
从第二天开始，每次涂抹前应剪毛，用水或无刺激性溶剂清除残留受试物。
一小时后观察结果，按表1 评分，对照区和试验区同样处理。
6.4.3 结果评价：按下列公式计算每天每只动物平均积分，以表2判定皮肤刺激强度。
14受试动物数
红斑和水肿积分
每天每只动物平均积分∑=
表 1 皮肤刺激反应评分
7 试验报告
试验报告应以表格形式总结，包括如下内容：
(1) 受试物名称、理化性状、配制方法和用量。
必要时说明受试物的pH 值； (2) 实验动物的种属、品系、性别、体重和来源（注明合格证号和动物级别）； (3) 实验动物饲养环境，包括饲料来源、室温、相对湿度、实验动物房合格证号； (4) 每个动物在每一观察时点的皮肤刺激反应积分；
(5)具体描述除刺激性以外的其它毒性作用；
(6)结论。
表2 皮肤刺激强度分级
表 3 ×××对家兔急性皮肤刺激性试验结果动
物编号性
别
体
重
(kg)
1 h 24 h 48 h 72h
样品对照样品对照样品对照样品对照红
斑
水
肿
总
分
红
斑
水
肿
总
分
红
斑
水
肿
总
分
红
斑
水
肿
总
分
红
斑
水
肿
总
分
红
斑
水
肿
总
分
红
斑
水
肿
总
分
红
斑
水
肿
总
分
1
2
3
4
总积分均值
刺激强度分级
表4 ×××对家兔多次皮肤刺激性试验结果
涂抹
样品
3 4
4 4
5 4
6 4
7 4
8 4
9 4
10 4
11 4
12 4
13 4
14 4
14天每只动物积分均值
每天每只动物积分均值
8 试验结果的解释
急性皮肤刺激试验结果从动物外推到人的可靠性很有限。
白色家兔在大多数情况下对有刺激性或腐蚀性的物质较人类敏感。
若用其它品系动物进行试验时也得到类似结果，则会增加从动物外推到人的可靠性。
试验中使用封闭式接触是一种超常的实验室条件下的试验，在人类实际使用化妆品过程中很少存在这种接触方式。