线虫RNAi实验
RNA干涉
RNA干涉(RNA interference，RNAi)是1998年由Fire等在线虫中发现的一种转录后的基因沉默(Posttranscriptional gene silencing，PTGS)机制。
双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)能特异地抑制或沉默目的基因表达，产生如同目的基因突变的缺陷表型，这种由dsRNA介导的基因阻抑作用被称为RNAi。
1990年，美国和荷兰的两个转基因植物实验组，在矮牵牛中发现的一种转基因能同时抑制相应的内源基因以及自身表达的基因沉默现象，当时将这种现象称为共抑制。
到1994 年，由Cogni等在真菌中发现转录后的基因沉默现象，在野生型粗糙链胞霉中转入胡萝卜素基因albino 1或albino 3时，发现在部分实验中，内源性al 1或al 3基因的表达水平反而减弱，称此现象为基因压制(quelling)。
1998年，Fire等在线虫中发现了RNAi现象，并揭示了SuGuo发现正义RNA对基因表达也有抑制作用的原因，认为SuGuo发现的这种现象是由于体外转录制备的RNA中污染了微量的双链RNA，而且dsRNA 能比反义RNA或正义RNA更有效地抑制基因的表达，把由RNA引起的基因表达的抑制称为RNA干涉。
最初普遍认为共抑制、基因压制以及RNAi是机制完全不同的基因抑制现象。
但经过科研人员的不断研究，发现在共抑制、真菌中的基因压制以及RNAi现象之间存在着密切的联系。
都是由RNA引起的转录后的基因沉默，可能有共同的生物学意义和相似的作用机制。
但是共抑制与RNAi并不是完全相同，在植物的共抑制中，dsRNA不仅能引起转录后的基因沉默，而且还能引起转录水平的沉默，其可能机制是dsRNA能引起染色质的重组或甲基化而改变其内源基因的序列。
因此，在植物共抑制中还存在RNAi以外的由RNA指导的DNA 甲基化，而引起转录水平抑制的机制。
dsRNA能特异地抑制目的基因的表达，其广泛存在各种有机体中，包括线虫、果蝇、涡虫、水螅、锥虫、真菌、植物以及哺乳动物。
RNAi实验4 个要素和基本实验路线
RNAi 实验4个要素和基本实验路线RNA 干扰是一种自然发生的基因沉默机制，应用于基因功能研究和临床疾病治疗，就成为一种功能非常强大的工具。
不过，开展RNAi实验并不难，不需要特殊的仪器，RNAi实验所需的4大要素一点不复杂：•对应目标基因的dsRNA(siRNA,长dsRNA，shRNA载体,看实验需要）；•适合的转染或者其他将dsRNA递送进入细胞的方法；•适当的对照；•检测目标基因表达情况的方法1.对应目标基因的dsRNA在非哺乳动物细胞中，直接向细胞导入长双链RNA(dsRNA)，在细胞质核酸酶Dicer的作用下可将长双链RNA降解为21-23bp的小分子干扰RNA(small interfering RNAs，siRNAs)，这些小分子RNAs结合其他元件形成“RNA诱导沉默复合物”(RNA-induced silencing complexes，RISCs)，并引导RISCs 结合到与之互补的mRNA序列上，降解对应的mRNA，从而导致对应蛋白质水平下降，最终导致目标基因表达沉默(见下图：线路1，蓝色)。
对于哺乳动物细胞来说，导入30bp以上的长双链RNA(dsRNA)往往会诱发非预期的抗病毒应答反应，此路不通。
所以常见的做法是直接制备19-23bp左右的siRNAs，将siRNAs转入哺乳动物细胞(线路2，红色)；或者是将短发夹结构RNA(short hairpin RNAs，shRNAs)的DNA表达载体转入细胞，表达产生shRNA，经过Dicer切割后得到siRNA(线路3，黄色)；最后siRNAs同样和其他元件组合成为RNA诱导的沉默复合物RISCs，在siRNA指引下识别对应的mRNA序列并降解mRNA，从而使特定基因表达沉默。
线路1和2均为诱发瞬时基因沉默，持续时间约3－7天，根据目标基因而异，shRNA表达载体则可以建立长效基因沉默的细胞株，进行功能缺失基因组筛选研究，也可用于体内RNAi研究。
RNAi的实验原理和操作实用技术Word版
RNAi的实验原理和操作实用技术几十年来生物学上最重要的进展，也许是关于RNA分子能调节基因表达的发现。
RNA干涉（RNAi）是指双链RNA分子使基因表达沉寂的现象，是在线虫中发现的，在 1998年的一篇Nature论文中被公诸于众。
此后，科学家们明白，RNAi还有其他形式，它既是一种了解基因功能的强大工具，又是很多生物的基因组所采用的一种在演化上来讲很古老的防卫方法。
RN Ai肯定有很多新用途，RNAi还可能具有一些仍然有待去发现的天然功能。
RNAi实验原理与方法近年来的研究表明，将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链R NA(dsRNA)导入细胞，可以使mRNA发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默。
这种转录后基因沉默机制(post-transcriptional gene silencing, PTGS)被称为RNA干扰（RNAi）。
一、RNAi的分子机制通过生化和遗传学研究表明，RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation and effector steps)。
在起始阶段，加入的小分子RNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs, siRNAs)。
证据表明；一个称为Dicer的酶，是RNase III家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因，病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs(siRNAs)，每个片段的3’端都有2个碱基突出。
在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex, RISC）。
激活RISC需要一个ATP依赖的将小分子RNA解双链的过程。
激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA。
RNAi的发现过程
RNAi：A Phasing-Out Technology?
• 显著的脱靶效应和不可预测的 抑制效率
• 其他技术的的出现
RNAi, TALEN, 和CRISPR三者之间的比较
参考文献：Boettcher M , Mcmanus M . Choosing the Right Tool for the Job: RNAi, TALEN, or CRISPR[J]. Molecular Cell, 2015, 58(4):575-585.
Dicer的作用发现
2001年，Ketting等人通过测试
胚胎提取物Dicer的活性，并利用免疫 沉淀、缺失突变体分离、基因转移、 Seam细胞分析、RNAi检验等方法解 释了Dicer在秀丽隐杆线虫RNA干扰 和小RNA合成中的作用。
Dicer可能参与两个不同的过程，这两个过程都需 要将dsRNA加工成小RNA，其中一条途径(ds-RNA 诱导)通过RISC复合物和RNAi导致RNA降解。第二 种途径(依赖于let-7)通过内源性的、短暂的小RNA 及其mRNA靶点之间的相互作用导致翻译的抑制。
“后人改良”：当他们将T4和T7 RNA聚合酶体外转录
制备的单链RNA电泳纯化后再注射于线虫，结果发现只有微弱 的基因抑制作用。而将纯化后的dsRNA 一正义链和反义链的 混合物注入线虫，发现dsRNA能够高效特 异的阻断相应基因 的表达，而且抑制基因表达的效率比单链RNA至少高2个数量 级。该小组将这一现象称为“RNA interference-RNA干扰” 。首次揭开了Guo和Kemphues的谜底。
pSUPER载体是否可以介导基因表达 的稳定抑制？
MCF-7 细 胞 与 含 有 puromycin 抗 性 的 载 体 pSUPER 或 pSUPER-p53 共 转 染 ， 结 果 表 明 ， pSUPER 介 导 的 基 因 敲 除 持 续 时 间 较 长 ， 它 的 转录产物对细胞没有毒性。
RNA干扰(RNAi)
RNA干扰（RNA interference，缩写为RNAi）是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。
当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默[1]。
与其它基因沉默现象不同的是，在植物和线虫中，RNAi具有传递性，可在细胞之间传播，此现象被称作系统性RNA干扰(systemic RNAi)。
在秀丽隐杆线虫上实验时还可使子一代产生基因突变，甚到于可用喂食细菌给线虫的方式让线虫得以产生RNA干扰现象。
RNAi现象在生物中普遍存在。
RNAi与转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing and transgene silencing)在分子层次上被证实是同一种现象发现：RNA干扰现象是1990年由约根森（Jorgensen）研究小组在研究查尔酮合成酶对花青素合成速度的影响时，为得到颜色更深的矮牵牛花而过量表达查尔酮合成酶，结果意外得到了白色和白紫杂色的矮牵牛花，并且过量表达查尔酮合成酶的矮牵牛花中查尔酮合成酶的浓度比正常矮牵牛花中的浓度低50倍。
约根森推测外源转入的编码查尔酮合成酶的基因同时抑制了花中内源查尔酮合成酶基因的表达。
1992年，罗马诺（Romano）和Macino也在粗糙链孢霉中发现了外源导入基因可以抑制具有同源序列的内源基因的表达。
1995年，Guo和Kemphues在线虫中也发现了RNA干扰现象。
1998年，安德鲁·法厄（Andrew Z. Fire）等在秀丽隐杆线虫（C.elegans）中进行反义RNA 抑制实验时发现，作为对照加入的双链RNA相比正义或反义RNA显示出了更强的抑制效果[1]。
从与靶mRNA的分子量比考虑，加入的双链RNA的抑制效果要强于理论上1:1配对时的抑制效果，因此推测在双链RNA引导的抑制过程中存在某种扩增效应并且有某种酶活性参与其中。
实验报告： 线虫RNA干扰的基因沉默
实验一：线虫RNA干扰的基因沉默一、实验目的RNA干扰（RNA interference,RNAi）是一种使基因使失活的有效方法，在线虫中，RNA干扰因为简单而成为研究基因功能的有效手段。
我们利用表达tag-214 dsRNA的大肠杆菌喂食线虫来介导RNAi，以达到鉴定tag-214基因功能的目的。
二、实验背景RNAi是近年来以秀丽线虫的研究为基础而发展起来的一种基因knock down 技术，将体外合成的含有目的基因的dsRNA通过某种方式引入到线虫体内，导致其体内相应的目的基因mRNA降解，从而达到基因沉默的目的。
三、实验原理通过显微注射dsRNA或者把线虫浸入到含有dsRNA的溶液中，或者用能够表达dsRNA的大肠杆菌喂食线虫，可以将dsRNA导入大肠杆菌中。
在大肠杆菌HT115中，含有目的基因发夹结构的质粒，在IPTG的诱导下转录出正义和反义的RNA,两条RNA链通过退火形成dsRNA。
当线虫以此大肠杆菌为食时，就摄取了大肠杆菌合成的dsRNA，并触发了线虫体内RNA干扰的发生。
本实验将利用表达tag-214 dsRNA的大肠杆菌喂食线虫来介导RNAi，以达到鉴定tag-214基因功能的目的。
四、实验材料：1.秀丽线虫（C.elegans）rrf-3突变体（RNAi敏感型）由于线虫的RNA的干扰操作简单快速，且重复性好，已成为鉴定基因功能以及基因间互相作用关系的有效材料。
秀丽线虫属于线性动物门，线虫纲，小杆线虫目，广杆线虫属。
秀丽线虫是一种生活在土壤中的线虫，长约1mm，直径70um，由959个细胞组成。
秀丽线虫具有雌雄同体和雄性个体两种性别。
雌雄同体的线虫有两条X染色体和5对常染色体。
其基因组大小为80Mb，包含13000个基因。
如上左图为秀丽线虫的模式图（上为雌雄同体，下为雄性个体），右图为秀丽线虫的生活史。
线虫具有生活周期短，易培养和保存等优点，由于其身体透明，因此可以在显微镜下跟踪观察每个细胞的命运，是目前遗传学、发育学和细胞生物学研究的重要模式生物。
RNAi技术在昆虫防治中的应用
RNAi技术在昆虫防治中的应用随着生物技术的发展，越来越多的新型技术被广泛应用于各个领域。
其中，RNA干扰（RNA interference, RNAi）技术作为一种可以靶向性地削弱或抑制某些基因表达的新型技术，被广泛应用于生物研究、医学、植物和昆虫防治等领域。
本文将就RNAi技术在昆虫防治中的应用进行详细探讨。
一、RNAi技术的基本原理RNAi技术是一种基于RNA干扰的基因沉默技术，通过外源dsRNA进入细胞内，在RNA酶的参与下将dsRNA分解成21-23nt的小干扰RNA(siRNA)，并结合到RNA诱导剪切复合物中，引发基因表达层面的转录后抑制或靶向RNA分解。
此外，siRNA还与Dicer和Argonaute等蛋白结合，组成RNA诱导沉默复合物(RISC)，靶向降解过程相当于一种非翻译层面的RNA降解。
之后，RNA诱导沉默复合物(RISC)与mRNA结合，从而产生靶向性降解。
二、1、RNAi技术的优势RNAi技术在昆虫防治中的应用优势显著，其中最简单的就是靶向病虫害的特定基因，可以降低昆虫害虫的密度和产量。
同样，RNAi技术对于昆虫的副作用也很少，因为它只靶向特定的基因，而不具有广谱杀虫剂的毒性。
此外，这种技术可以合成含有特定siRNA的RNA序列，使得目标病虫害的基因只能在特定环境下才能表达。
这就为农业生产提供了一个可行的选择，降低了化学杀虫剂的使用率。
2、应用实例目前，在昆虫防治领域中，大量的实例表明RNAi技术具有良好的应用前景。
例如，通过RNAi技术能够有效地降低促生殖因子的表达水平，从而阻止老鼠听力感觉毛细胞的再生和重塑。
而在昆虫防治方面，在油菜品钩虫的防治工作中，使用RNAi技术成功抑制了其关键基因，有效地抑制了华南地区油菜品钩虫的危害。
此外，还有数百种病毒和真菌可以通过RNAi技术抑制其相应的基因，从而实现控制病虫害的目的。
三、RNAi技术在昆虫防治中的前景随着生物技术的不断发展，RNAi技术在昆虫防治领域的应用也在不断取得新的进展。
线虫的实验报告
一、实验背景线虫是一类广泛分布于土壤、水体及动物体内的微小生物，对农业、生态和人类健康具有重要意义。
近年来，线虫的研究逐渐成为生物科学领域的热点。
氧化磷酸化（Oxidative Phosphorylation，OXPHOS）是线粒体中产生ATP的主要途径，对于线虫的生长、繁殖和代谢具有重要作用。
本研究旨在探讨线虫的繁殖能力与氧化磷酸化反应之间的关系。
二、实验材料与方法1. 实验材料（1）松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）；（2）100mmol/L Ca2+溶液；（3）RNA干扰技术相关试剂；（4）荧光定量PCR仪；（5）显微镜等。
2. 实验方法（1）线虫繁殖能力检测：将线虫分为对照组和钙胁迫组，分别用100mmol/L Ca2+溶液处理。
在适宜条件下培养，记录每组的产卵量和校正死亡率。
（2）差异表达基因筛选：利用RNA干扰技术，针对氧化磷酸化途径中的关键基因进行干扰，观察干扰后线虫的繁殖能力变化。
（3）荧光定量PCR：检测干扰后线虫中关键基因的表达水平，分析其与繁殖能力之间的关系。
（4）统计学分析：采用SPSS软件对实验数据进行分析，比较各组间的差异。
三、实验结果1. 线虫繁殖能力检测对照组线虫的产卵量为31.00个卵，校正死亡率为0；钙胁迫组线虫的产卵量为6.75个卵，校正死亡率为10%。
结果表明，钙胁迫显著降低了线虫的繁殖能力。
2. 差异表达基因筛选通过RNA干扰技术，对氧化磷酸化途径中的关键基因进行干扰，发现BXNDUFA2、BXQCR8基因干扰后，线虫的产卵量和校正死亡率显著降低。
3. 荧光定量PCR干扰后，BXNDUFA2、BXQCR8基因在钙胁迫组线虫中的表达水平显著下调，与产卵量和校正死亡率呈负相关。
四、实验结论1. 钙胁迫通过抑制氧化磷酸化反应降低松材线虫的繁殖能力和致病性。
2. BXNDUFA2、BXQCR8基因在氧化磷酸化途径中起关键作用，其表达水平与线虫的繁殖能力密切相关。