实验一、显微镜油镜的使用及简单染色
实验1显微镜的使用细菌的简单染色
很多原来由于在透镜及载片表面的反射和折射而损失的 光线可以进入物镜，使照明亮度提高，改善观察效果。
㈢ 细菌的简单染色
利用单一染料对菌体进行染色的方法称为简单染色。
细菌个体微小，无色透明，不经过染色，常常不容易观 察。经过染色后，菌体与背景颜色形成鲜明的颜色对比，便 于在显微镜下观察细菌的形态、大小和排列方式。
利用同焦现象，在使用高倍镜或油镜等放大倍数高、工作 距离短的物镜时，仅用微动螺旋即可对物像清晰聚焦，从而避 免由于使用粗动螺旋时可能的错误操作而损坏镜头。
4 油镜观察 注意不要因为在下降物镜镜头时用力过猛或者调焦时误
将粗动螺旋向反方向转动而损坏镜头及载玻片。 不可以将高倍镜转动经过加油镜油的区域。
调节目镜间距和屈光度。
瞳距调节
屈光度调节：可以适应双眼视力有差异的观察者。
2 低倍镜观察
养成良好的调焦习惯，先从侧面注视，小心调节物镜靠近 标本，然后用目镜观察，以防操作失误而损坏镜头。
3 高倍镜观察
一般情况下，当物像在一种物镜中清晰聚焦后，转动转换 器将其它物镜转到工作位置，物像保持基本准焦状态，称为物 镜的同焦(parfocal)。
㈠ 普通光学显微镜
微生物个体微小，必须借助显微镜才能观察到，显微镜 是微生物学者不可缺少的基本工具。
普通光学显微镜利用目镜、物镜两组透镜系统来放大成 像，常称为复式显微镜，由机械装置和光学系统两大部分组 成。
1 机械装置 镜座和镜臂：镜座支持整个显微镜，镜臂支持镜筒部分。
镜筒：上接目镜，下接转换器，分为单筒和双筒两种。
目镜：安装在镜筒上端，由两块透镜组成，将物镜成的像 再次放大，但是不增加分辨力，目镜放大倍数过大，反而影响 观察效果。
01油镜的使用和细菌的简单染色法
率。
：
镜口角（即入射角）。
普通光学显微镜Ⅲ
油镜使用的原理
油镜，即油浸接物镜。当光 线由反光镜通过玻片与镜头 之间的空气时，由于空气与 玻片的密度不同，使光线受 到曲折，发生散射，降低了 视野的照明度。若中间的介 质是一层油（其折射率与玻 片的相近），则几乎不发生 折射，增加了视野的进光量， 从而使物象更加清晰。
5.观察完毕，取下标本片，立即用擦镜纸顺一 个方向旋转擦拭镜头上的油。若油已干，应 先用二甲苯滴在擦镜纸上擦净镜头，再用另 一干净擦镜纸拭去镜头上沾有的二甲苯;
6.显微镜擦净后，降低物镜并将其转成八字形， 集光器下降，光圈关上，关闭电源，罩上显 微镜罩
油镜使用注意事项
油镜的识别：油镜头上都有标记；标有100×；镜头 前端有黑、白或红色的圆圈；刻有“III”或Oil等，其 入光孔径也较其他物镜小；
普通光学显微镜Ⅱ
显微镜的放大倍数和分辨率
1.放大倍数=接物镜放大倍数×接目 镜放大倍数
2. 显微镜的分辨率 是表示显微镜
辨析物体（两端）两点之间距离的
能力，可用公式表示为：
D=λ/2n·sin(α/2 )
式中D：物镜分辨出物体两点间的
最短距离。
：可见光的波长（平均0.55m)
n: 物镜和被检标本间介质的折射
常用作简单染色的染料有美蓝、结晶紫、石炭酸复红等。
实验材料
菌种 产气杆菌营养琼脂斜面培养物； 金黄色葡萄球菌营养琼脂斜面培养物
试剂 结晶紫染液、石炭酸复红染液、香柏油、二甲苯、无菌 水
仪器及其它 显微镜、酒精灯，载玻片，接种环，擦镜纸等。
实验流程
制备细菌染色装片
油镜观察
实验步骤
1、 用简单染色法制备细菌染色装片 涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥
实验一 显微镜油浸系物镜的使用
9.用左眼观察目镜，并慢慢转动细调节器至物象清晰为止。
如果不出现物象或者目标不理想要重找，在加油区之外 重找时应按：低倍→高倍→油镜程序。在加油区内重找 应按：低倍→油镜程序，不得经高倍镜，以免油沾污镜 头。
10.油镜使用完毕，先用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头上和 标本上的香柏油擦去，然后再用干擦镜纸擦干净。
实验一 显微镜油浸系物镜的使用
一、实验目的和内容 目的 学习油浸系物镜的基本原理，掌握其使用方法。 内容 1.学习油浸物镜的工作原理和使用方法。 2.用油镜观察枯草芽孢杆菌、四链球菌、白色链球菌、 放线菌染色装片。
二、实验原理 油镜是普通光学显微镜所配置的物镜中放大倍数最大的 一种物镜，与其它物镜相比，它的使用比较特殊，需在 载波片与镜头之间滴加香柏油，这主要有两个原因：
培养基是按照生物生长繁殖所需要的各种营养，用 人工方法配制而成的营养基质。其中含有碳源、氮源、 无机盐、维生素以及水分等。微生物在培养基上生长繁 殖还必须在最适pH范围内才能生长得更好，因此对不 同种类的微生物应将培养基调节到一定的pH值范围。
培养基的种类很多，不同的微生物所需要的培养基不 同。依物理性状可分为液体的、固体的和半固体的三种。 固体培养基是在液体培养基中加入1.5～2%的琼脂，半 固体培养基是加入0.2～0.5%的琼脂。
３.放置玻片标本：把要观察的玻片标本放在镜台上，用 推片器弹簧夹夹住，然后旋转推片器螺旋，将所要观察 的部位调到通光孔的正中。
4.调节焦距：转动粗调节器，使镜台缓慢地上升至物镜距 标本片约5-6mm处，应注意在上升镜台时，切勿在目镜 上观察。一定要从右侧看着镜台上升，以免上升过多， 造成镜头或标本片的损坏,然后，两眼同时睁开，用左 眼在目镜上观察，左手缓慢转动粗调节器，使镜台缓慢 下降，直到视野中出现清晰的物象为止;如果物象不在 视野中心，可调节推片器将其调到中心(注意移动玻片 的方向与视野物象移动的方向是相反的)。如果视野内 的亮度不合适，可通过升降集光器的位置或开闭光圈的
微生物学实验报告
微生物学实验报告(格式标准)(生命科学专业)教师:黎勇目录索引实验一油镜的使用与细菌的简单染色法 3实验二细菌的革氏染色与芽孢染色 5实验三常用培养基的配制7实验四酵母菌霉菌的形态结构观察及酵母死活细胞的鉴别8实验五、微生物大小的测定与显微计数10实验六环境中微生物的检测与分离纯化11实验七细菌鉴定中常用的生理生化反应12实验八(综合实验)化能异养微生物的分离与纯化13课程名称: 微生物学实验班级:化生系生命科学本科实验日期: 指导教师:黎勇实验一油镜的使用与细菌的简单染色法〔目的要求〕学习并熟练掌握油镜的使用技术;观察细菌的基本形态;学习观察细菌的运动性的基本方法。
〔基本原理〕1、 N·A=n·sinα2、 D=λ/2N、A3、目镜可提高放大倍数,但有效放大率取决于镜口率。
已经分辨的物体不放大瞧不清,未分辨物放得再大也瞧不清。
4、用悬滴法或凹玻片法观察细菌的运动性时,可以通过真运动能定向地由一处快速运动来区别于颗粒的布朗运动。
〔器材用具〕显微镜、载玻片、凹玻片、盖玻片、接种环、香柏油、二甲苯、凡士林、吸水纸、擦镜纸;细菌、放线菌等固定装片;培养18小时左右的B、subtilis、 S、arueus 菌斜面培养物;无菌水、生理盐水。
〔方法步骤〕:(一) 油镜的使用镜检装片在中倍(或高倍镜)下找到目的物,并使位于视野正中聚光镜上升到最高位置,虹彩光圈开到最大,镜头转开成八字形在玻片的镜检部位(光斑处)滴一滴香柏油油镜转入正下方侧视小心上升载物台(缩短镜头与装片距离,镜头浸入油中,至油圈不扩大为止镜头几与装片接触) 粗调器徐徐下降载物台(密切注视视野,当捕捉到物像时,立即用细调器校正) 仔细观察并绘图取出装片,清洗油镜:擦镜纸拭去镜头上的香柏油擦镜纸沾少许二甲苯擦去残留(用手指辅助,迅速拭擦一、二次) 用清洁擦镜纸仔细擦干二甲苯(2-3次)。
(二) 细菌的简单染色法:涂片干燥火焰固定染色水洗干燥油镜观察(三) 细菌运动性的观察取洁净盖玻片,四周涂上凡士林滴加一小滴菌悬液凹玻片的凹窝向下盖于盖玻片上翻转观察〔结果分析〕1、画一圆圈表示视野,选取所观察的微生物绘图,注意特殊结构、形状与排列。
显微镜的使用和细菌简单染色
（二）光学显微镜的油镜原理
显微镜的分辨率D：是指显微镜能辨别两点之间 的最小距离的能力，即最小分辨距离。D越小，分 辨率越高。
D=λ/2NA λ为光源光波波长， NA为物镜的数值孔径值
数值孔径值 NA= η sinθ θ为物镜镜口角的半数， η为香柏油的折射率（1.52）
比如：水的折射率1.33， 空气的折射率为1.0 NA香柏油=1.2-1.4， D油镜=0.2μm＞细菌直径0.5μm
光学显微镜的结构示意图
三、实验器材
1、菌种：蜡状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌 2、染色液和试剂：美蓝染液、复红染液 3、器材：载玻片、接种环、酒精灯、擦镜纸、显微镜
四、方法和步骤
1.涂片：在载玻片中央滴一滴蒸馏水，无菌接种环 挑取少量菌体与水滴混合均匀，涂成薄的 菌膜。
6. 干燥：自然干燥或用吸水纸盖在涂片处吸取多余 水分。
7. 观察：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的 视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏 油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观 察细菌的形态。
五、结果观察
蜡状芽孢杆菌的简单染色
五、结果观察
蜡状芽孢杆菌的简单染色
六、实验完毕后的处理
1.将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净， a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。 b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2—3次。 c.再用干净的擦镜纸将镜头擦2—3次。
显微镜的使用和 细菌的简单染色
一、实验目的
1.熟悉光学显微镜使用方法 2.掌握细菌的涂片和简单染色法的 基本方法和步骤
二、基本原理
（一）简单染色基本原理 通常采用碱性染料进行简单染色: 这是因
为细菌在中性、碱性和弱酸性环境中通常带负 电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部 分带正电荷，因此碱性染料（美蓝，结晶紫， 碱性复红等）很容易与细菌结合使其着色。
光学显微镜的使用简单染色及革兰氏染色
光学显微镜的使用简单染色及革兰氏染色摘要显微镜的使用在我们学习微生物等课程中非常重要，历史上显微镜的创造和显微镜的每一次创新都给人类的认知带来了飞跃式的开展；给人类的生活带来了空前的拓展。
在提倡科技创新的今天，显微镜的使用已经成为我们的一项根本技能。
本次试验的主要目的是通过用油镜观察经过复染色的细菌玻片，分辨细菌的革兰氏阴阳性。
通过实验学习光学显微镜油镜的使用原理与方法、细菌的革兰氏染色法及分类鉴定的原理。
为了研究细菌的形态，微生物学家创造了对细菌的染色，用两种以上的称复染，革兰氏创造了复染色法；先后用两种染色剂和媒染剂、脱色剂组合，由此而命名为革兰氏染色。
革兰氏染色不仅可以观察细菌的形态，同时将细菌分为两大类。
一类是染色阳性菌是紫色，另一类染色阴性的是红色。
由于细菌的构造上的差异，形成了不同的染色效果。
了解染色性能有助于临床用药和细菌的鉴定。
关键词显微镜的使用〔Use of Microscope〕革兰氏染色〔Gram stain〕复染〔counterstain〕媒染〔mordant dyeing〕脱色〔discoloration〕一、实验目的1、了解显微镜的构造及使用2、学习显微镜〔特别是白色圈标记的油镜〕的使用方法3、学习并掌握微生物制片及简单染色的根本技术4、初步了解不同细菌的形态特征5、了解革兰氏染色原理，并掌握其方法二、实验原理〔一〕、普通显微镜的根本原理1、根本原理显微镜的放大效能〔分辨率〕是由所用光波长短和物镜数值口径决定，缩短使用的光波波长或增加数值口径可以提高分辨率，可见光的光波幅度比拟窄，紫外光波长短可以提高分辨率，但不能用肉眼直接观察。
所以利用减小光波长来提高光学显微镜分辨率是有限的，提高数值口径是提高分辨率的理想措施。
要增加数值口径，可以提高介质折射率，当空气为介质时折射率为1，而香柏油的折射率为1.51，和载片玻璃的折射率〔1.52〕相近，这样光线可以不发生折射而直接通过载片、香柏油进入物镜，从而提高分辨率。
实验一显微镜的使用和细菌的简单染色
实验程序——细菌简单染色
每位学生一人一组，取大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，各做一块涂片。
蒸 馏 水
涂片
接 种 环
自然干燥
吕 式 美 兰
固定
擦拭
染色 1min
干
水
燥
洗
水洗时不要直接冲菌膜
染色注意事项
• 1.涂片过程中，去生理盐水和细菌不宜过多，
涂菌要均匀，不宜过厚。
• 2.固定时温度不可过高，以载玻片背面不烫
• 普通光学显微镜(NIKON) • 欧林巴斯（OLYMPUS）生物显微镜 • 麦克奥林生物显微镜
镜座 载物台
镜臂
机械装置 标本夹和标本移动尺
显 微
粗调螺旋和细调螺旋
镜 的
聚光镜升降螺旋
构 造
接目镜
接物镜及镜头转换器
光学系统 聚光镜
虹彩光圈
反光镜
显微镜的放大倍数和分辨率
• 1.放大倍数=接物镜放大倍数×接 目镜放大倍数 2. 显微镜的分辨率 是表示显微 镜辨析物体（两端）两点之间距 离的能力，可用公式表示为： D=λ/2n·sin(α/2 ) 式中D：物镜分辨出物体两点间 的最短距离。 ：可见光的波长（平均0.55m) n: 物镜和被检标本间介质的折 射率。 ：镜口角（即入射角）。
• 镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用 高倍镜或油镜观察？
下周实验
实验二 细菌的革兰氏染色 （书中实验十四）
杆菌
炭疽杆菌
破伤风杆菌
肉毒芽孢杆菌
大肠杆菌
杆菌
变形杆菌 绿脓杆菌
大肠杆菌
螺菌
幽门螺杆菌
霍乱弧菌
钩端螺旋体
Spirulina sp. - Filamentous Cyanobacte
微生物实验报告---普通光学显微镜的使用及简单染色、革兰氏染色
普通光学显微镜的使用及简单染色、革兰氏染色郑小煜201100140069生命科学学院生科3班同组者:赵莉、高瑞、刘梦迪2012年10月10日一、实验目的和要求1、学习显微镜的使用方法。
微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌单染色。
2、学习3、初步认识细菌的显微形态特征。
4、学习并掌握细菌革兰氏染色，了解革兰氏染色在细菌分类鉴定中的重要性。
二、实验原理1、细菌的细胞小而透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对他们进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而更能清楚的观察到其形态和结构。
2、油镜:油镜的放大倍数可达100倍，焦距很短，直径很小，但所需的光照度却很大。
为了不使通过的光线有所损失，在使用油镜时须在油镜与玻片之间加入与玻璃折射率相仿的镜油(通常用香柏油)。
且油镜分辨率很高，可达0.2微米左右。
3、通常采用碱性染料进行简单染色，原因在于微生物细胞在碱性、中性及酸性溶液中通常带负电荷，而染料电离后染色部分带正电荷，很容易与细胞结合使其着色;当细胞处于碱性条件下所带正电荷增加时，可采用碱性染料染色。
4、革兰氏染色革兰氏染色法可将细菌分成革兰氏阳性(G?)和革兰氏阴性(G?)两种类型，这是由这两种细菌细胞壁结构和组成的差异所决定的。
首先利用草酸铵结晶紫初染，所有细菌都会着上结晶紫的蓝紫色。
然后利用卢戈氏碘液作为媒染剂处理，由于碘与结晶紫形成碘-结晶紫复合物，增强了染料在菌体中的滞留能力。
之后用95%乙醇作为脱色剂进行处理时，两种细菌的脱色效果不同。
革兰氏阳性细菌细胞壁肽聚糖含量高，壁厚且脂质含量低，肽聚糖本身并不结合染料，但其所具有的网孔结构可以滞留碘-结晶紫复合物，现在一般认为乙醇处理可以使肽聚糖网孔收缩而使碘-结晶紫复合物滞留在细胞壁，菌体保持原有的蓝紫色。
而革兰氏阴性细菌细胞壁肽聚糖含量低，交联度低，壁薄且脂质含量高，乙醇处理时脂质溶解，细胞壁通透性增加，原先滞留在细胞壁中的碘-结晶紫复合物容易被洗脱下来，菌体变为无色，用复染剂染色后又变为复染剂颜色。
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一、实验目的
学习并掌握普通光学显微镜的构造 和油镜的使用技术及维护的基本知 识 学习微生物涂片、单染色的基本技 术 初步认识细菌的形态特征 学习简单的无菌操作技术
二、实验原理1
Hale Waihona Puke 显微镜的构造1.光学部分:目镜 、 物镜 、 照 明装置(聚光镜、 虹彩光圈、 反光镜等)。它使检视物放大, 生成物象。
注意：油镜使用完毕后一定要用二甲苯擦拭镜头
五、实验结果
根据观察，绘制任意两种细菌的 形态图 叙述本实验的注意事项有哪些
D=λ/2n· sin(α/2 )
式中D：物镜分辨出物体两点间的最 短距离。 ：可见光的波长（平均0.55m) n: 物镜和被检标本间介质的折射率。 ：镜口角（即入射角）。
D值越小，分辨率越高，看到的物象越清晰
油镜使用的原理
油镜，即油浸接物镜。当光 线由反光镜通过玻片与镜头 之间的空气时，由于空气与 玻片的密度不同，使光线受 到曲折，发生散射，降低了 视野的照明度。若中间的介 质是一层油（其折射率与玻 片的相近），则几乎不发生 折射，增加了视野的进光量， 从而使物象更加清晰。
二、实验原理2
细菌的单染色
细菌细胞微小，透明，不易观察，需染上颜色。 利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌 体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察 到其形态和结构。
染色前必须固定细菌，其目的是： 一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上。 二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和 化学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原有的 形态。
根据公式D=λ/2n·
sin(α/2 ) ，增大分母，使得D值
减小，分辨率增大。
显微镜保养和使用中的注意事项
1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。 2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布， 以保证光洁度 3.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜， 最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用 油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻 片或损伤镜面。 4.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜 座，不可单手拿，更不可倾斜拿。 5.显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生 霉菌而腐蚀镜片。
三、实验材料
奥林巴斯双筒普通光学显微镜。 吕氏美蓝染色液、石炭酸复红染色液、结晶紫染色 液、香柏油、镜头清洗液（V乙醚:V酒精＝7:3）、 无菌水。 大肠杆菌、藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌的斜面菌种。 载玻片、接种环、酒精灯、香柏油、擦镜纸、吸水 纸。
四、实验步骤
涂片
干燥
固定
染色
水洗
干燥
镜检
无菌操作
二、显微操作
1.低倍镜观察：粗调、细调。依次再进行中倍、高倍观察 2.油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜，在 标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调 至看清物象为止。 3.换片：另换新片，必须从第三条开始操作。 4.用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去镜头上 的油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去残留的油，最 后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体全部复原。
2.机械部分:镜座、镜臂、镜筒、 物镜转换器、载物台、载物台 转移器、粗调节器、细调节器 等部件.它起着支持 调节 固定 等作用.
倒立的虚像
图1-1-2 光学显微镜的成像原理
显微镜的放大倍数和分辨率
1.
放大倍数：物镜放大倍数×目镜放 大倍数 2. 显微镜的分辨率:是表示显微镜辨 析两点之间距离的能力。可用公式 表示为：