DNA测序样品要求
DNA测序样品的要求
DNA测序样品的要求未纯化PCR产物的要求1. 片段大于200bp；2.请提供50ml PCR扩增产物(总量1ug-2ug)；3.取3ml样品，应该能够清晰的分辨出目的条带；自带引物，引物浓度为5-10uM,并请注明。
备注纯化后PCR产物的要求1.PCR产物溶于蒸馏水中(请勿溶解在TE溶液中)；2.浓度大于20ng/ml，体积大于10ml，长片段需适当增加量；3.电泳检测条带专一；自带引物。
所有模板均应提供相应的引物信息自带质粒的要求1.质粒溶于30~50ml ddH2O中(请勿溶解在TE溶液中)，电泳检测浓度大50~100ng/ml；2. 建议用相关试剂盒提取质粒；3. 如有可能，同时提供1ml含有相应质粒的菌液备用；4. 需注明载体和插入目的片段长度、以及测序要求。
菌液模板的要求1.说明载体抗性类型，我们提供A mp, Kan, Tet及Chl四种抗生素；2. 其余类型抗生素需自备；应为高拷贝质粒，对于低拷贝质粒，请直接提供约1mg纯化质粒；3. 提供1ml左右过夜培养（12h）的菌液，加15%灭菌甘油，于E ppendorf 管中封口保存，防止交叉污染或渗漏；4. 大量样品测序，建议在一次性塑料培养皿固体培养基上穿刺培养；5. 建议尽量提供穿刺培养或斜面培养的菌种（装在EP管中）。
自带引物的要求1.浓度不低于5pmol/ml(或5umol/L)，溶液体积15-50ml；2. 随机引物（RA PD引物）和简并引物以及引物长度不足15bp不能用于本公司提供如下通用测序引物：M13+，M13-，T7, SP6, T7 ter，BGH rev, pGL3+, pGL3-，pGEX5’，pGEX3’，5’AOX1，3’A OX1 ，a-factor。
其他引物请自带或提供序列由我们合成。
常用载体特征PCR类型测序模板注意事项∙总反应体积建议为50uL或100uL，扩增结束后取3ul用1%左右的琼脂糖电泳检测，应为单一的条带。
DNA测序样品要求
pGEX5'/3', pGL3+/-, Pact2F/R, 27F, 1492R, CMV, U6promoter, S-Tag等
通用引物。
如您需要的引物不在此列，请电话咨询或自带引物，如需生工合成，请注明。
温馨提示：
1.对于甘油菌、穿刺培养菌、以及抽干的质粒可以采用常温运输。
浓度大于30 ng/μl，体积大于10μl，长片段需适当增加提供量；
电泳检测条带单一明亮；
自带引物。
质粒
质粒溶于30-50μl ddH2O中(请勿溶解在TE溶液中)，电泳检测浓度大于
50 ng/μl；
建议用相关试剂盒提取质粒；
如有可能，同时提供1 ml含有相应质粒的菌液备用；
需注明载体全称和插入目的片段长度及测序要求。
2.对于溶解保存的质粒、PCR已纯化和未纯化产物建议冷藏运输。
建议尽量提供穿刺培养或斜面培养的菌种（装在EP管中）。
自带引物
浓度不低于5 pmol/μl(即5μmol/L)，体积20-50μl，并请注明浓度；
随机引物（RAPD引物）、简并引物、长度不足15 bp或大于30 bp引物、
有特殊标记的物或不纯的引物均不能用于测序；
尽可能提供引物全序列、PCR退火温度等信息，以供参考。
菌样
说明载体、抗性类型；我们提供氨苄青霉素，卡那霉素，四环素及氯霉
素四种抗生素；其余类型抗生素需自备并附使用说明；
应为高拷贝质粒，对于低拷贝质粒，请直接提供约1μg纯化质粒；
提供1 ml左右过夜培养（12 h）的菌液，加入终浓度为15%的灭菌甘油，
于EP管中封口保存，防止交叉污染或渗漏；
二代测序质控各参数标准
二代测序质控各参数标准一、引言二代测序（Next-GenerationSequencing，NGS）是一种高通量的基因组测序技术，广泛应用于生物医学研究、农业育种、疾病诊断等领域。
在二代测序过程中，质量控制（QualityControl，QC）是至关重要的一步，其中质控参数的设定和标准是关键。
本文将介绍二代测序质控各参数的标准。
二、样本质量评估1.完整性：样本应保持完整，无断裂或降解。
可通过测定样本的分子量、片段长度分布等指标进行评估。
2.浓度：样本浓度应在合理范围内，过高或过低的浓度都可能导致测序质量下降。
3.特异性：样本应具有特异性，不应包含其他杂质序列。
可通过序列特异性指数（Sequence-SpecificityIndex）进行评估。
三、测序数据质量评估1.序列深度：测序深度是指测得的有效序列数量。
理想情况下，测序深度应覆盖目标区域的每个碱基。
2.覆盖度：覆盖度是指测序序列对目标区域的整体覆盖程度。
理想情况下，应具有广泛的覆盖度，以保证准确性和可信度。
3.质量值分布：测序质量值应在合理范围内，过低或过高的质量值都可能导致错误率升高。
4.碱基错配率：碱基错配率是指非特异性碱基的比例。
应尽可能降低错配率，以保证结果的准确性。
四、质量控制标准1.严格控制样本质量和浓度，确保样本具有特异性。
2.确保测序深度和覆盖度达到预期要求，同时关注质量值和错配率。
3.对数据进行多维度分析，包括序列长度、GC含量、突变位点等，以确保结果的全面性和准确性。
4.根据实验需求和样本特性，制定合适的质控参数标准，并定期评估和调整。
5.建立完善的质控流程和标准，确保实验数据的可靠性和可信度。
五、结论二代测序质控各参数标准的设定和评估是质量控制的关键环节。
通过严格控制样本质量和浓度、确保测序深度和覆盖度、关注质量值和错配率、多维度分析数据等措施，可以提高二代测序的准确性和可信度。
同时，建立完善的质控流程和标准，定期评估和调整质控参数，可以确保实验数据的可靠性和可信度，为后续研究提供有力支持。
DNA测序实验室运行规程
DNA测序实验室运行规程1. 实验室目标本实验室旨在提供高质量的DNA测序服务，并确保实验过程安全、可靠、符合相关法规和伦理规范。
2. 实验室设备与环境要求- 实验室应配备现代化的DNA测序仪器和相关设备，并保持其正常运行状态。
- 实验室应具备适当的环境条件，包括温度、湿度和通风等，以保证实验结果的准确性和稳定性。
3. 实验室操作流程3.1 样本处理- 所有样本必须按照规定的采样方法进行采集，并妥善保存和标识。
- 样本接收后，应及时进行样本预处理，包括去除污染和提取纯净的DNA。
- 样本处理过程中应注意避免交叉污染，采取必要的措施保证样本的纯度和完整性。
3.2 DNA测序实验- 根据测序需求，选择适当的测序方法和试剂，并按照相关操作步骤进行实验。
- 实验过程中应遵守操作规程，保证实验的准确性和可重复性。
- 在实验过程中，应及时记录实验数据和操作细节，并妥善保存。
3.3 数据分析与报告- 实验完成后，应对测序数据进行分析和解读，并生成相应的测序报告。
- 数据分析过程中应遵循科学的方法和标准，确保结果的可靠性和准确性。
- 测序报告应包括必要的信息，如样本信息、测序结果、分析结论等，并按照规定的格式进行编制和提交。
4. 质量控制与质量保证- 实验室应建立质量管理体系，包括质量控制方案和质量保证措施。
- 所有实验操作和数据分析均应符合质量控制要求，并进行记录和审查。
- 实验室应定期进行设备维护和校准，确保其正常工作和准确性。
- 实验室应参加外部质量评估和认证，以保证实验结果的可靠性和可比性。
5. 安全与伦理规范- 实验室应建立安全管理制度，包括样本存储和处理的安全措施，以防止交叉污染和意外泄露。
- 实验室应遵守相关法规和伦理规范，保护参与者的隐私和权益。
- 实验室应建立数据管理和保密措施，确保实验数据的安全性和保密性。
以上为DNA测序实验室运行规程，实验室人员应严格遵守，并不断改进实验流程和质量管理，以提供高质量的DNA测序服务。
DNA的质量监测通常有两个方法
2）DNA的质量监测通常有两个方法：首先OD260/OD280比值应该在1.8左右（1.7-1.9），否则意味着DNA样品中存在大量的蛋白质或RNA污染。
其次，琼脂糖电泳分析时应主要以超螺旋条带为主。
最多不超过三条带（分别为超螺旋DNA，线性化DNA和环状DNA）。
否则意味质粒DNA的质量不高，应该重新制备。
2.限制性内切酶的活性1）限制性内切酶一般需要低温保存，而且反复的升降温过程对酶活性的损害很明显。
因而为了确保在有效期内的限制性内切酶不会失活，限制性内切酶的日常保存和使用应当很小。
2）建议购买具有保温功能的冻存盒保存限制性内切酶（-20度），而且取用限制性内切酶时，也应该使用具有保温功能的冻存盒，尽量防止酶的温度反复出现大的波动。
3.限制性内切酶的用量1）限制性内切酶的单位定义通常为：在合适的温度下，完全消化1ugDNA底物所需的酶量定义为一个单位。
2）在这个单位定义中，有几个不确定因素：首先是底物，不同的酶单位定义是选择的底物可能不同（常用的几个底物DNA包括：Lambda DNA ,AD2 DNA 和一些质粒DNA）；第二个不确定因素是限制性内切酶在底物DNA上的酶切位点的个数。
由于单位定义中要求完全消化，因而底物上某个酶的酶切位点的个数的多少，就直接影响了该酶的单位定义。
3）因而，在进行酶切时，用1ul酶（一般10IU/ul）消化1ugDNA的通常做法是很不科学的，这也导致在实际工作中，大家要进行多次预实验才能确定最合适酶切条件。
4）以前，我推荐了一个在线的双酶切设计软件，double digestion designer, 可以精确地计算酶切时的限制性内切酶的用量。
使用中，能够注意到，用来进行双酶切的两个酶的用量有时竟然相差近20倍（EcoRI + NheI)，而且发现，小片段PCR产物（100-500bp）进行酶切时，需要的酶量比质粒DNA酶切时用量多10倍以上。
5）该软件目前可以免费使用，用户名和密码都是test。
二代基因测序流程和试剂
二代基因测序流程和试剂的步骤和流程引言二代基因测序是一种高通量、高效率的基因测序技术，能够大规模地获取DNA或RNA的序列信息。
本文将详细描述二代基因测序的流程和试剂的步骤和流程，确保流程清晰且实用。
流程概述二代基因测序的流程可以分为样品准备、DNA或RNA提取、文库构建、聚合酶链式反应（PCR）、测序和数据分析等步骤。
下面将详细介绍每个步骤的具体操作和试剂使用。
1. 样品准备样品准备是整个二代基因测序流程的关键步骤，合理的样品准备可以保证后续步骤的顺利进行。
样品可以是组织、细胞、血液等，需要根据研究目的进行选择。
样品准备的步骤包括：1.1 样品收集根据研究目的选择合适的样品，并采用合适的方法进行收集。
例如，对于组织样品，可以通过手术获取；对于细胞样品，可以通过培养或离心分离等方法获取。
1.2 样品保存采集后的样品需要及时保存，以防止样品质量的降低。
常用的保存方法包括冷冻保存和固定保存。
冷冻保存可以使用液氮保存或低温冰箱保存，固定保存可以使用甲醛等试剂进行固定。
2. DNA或RNA提取DNA或RNA提取是获取样品中的核酸的关键步骤，常用的提取方法包括酚-氯仿法、盐酸法和商用试剂盒法等。
下面以商用试剂盒法为例进行介绍：2.1 样品裂解将样品加入裂解缓冲液中，通过离心等方法使细胞或组织破碎，释放出DNA或RNA。
2.2 蛋白酶处理加入蛋白酶将样品中的蛋白质降解，以便后续纯化DNA或RNA。
2.3 DNA或RNA纯化将裂解液加入商用试剂盒中，通过离心等方法将DNA或RNA与其他杂质分离。
根据试剂盒的不同，可以使用硅胶膜或磁珠等材料进行纯化。
2.4 洗脱DNA或RNA将纯化后的DNA或RNA从硅胶膜或磁珠上洗脱下来，得到纯化后的DNA或RNA。
3. 文库构建文库构建是将提取到的DNA或RNA转化为测序所需的文库，常用的文库构建方法包括PCR文库构建法和片段文库构建法。
下面以PCR文库构建法为例进行介绍：3.1 DNA片段制备将提取到的DNA通过限制性内切酶或超声波等方法制备成适当的片段。
二代测序报告放行标准
二代测序报告放行标准一、测序质量测序质量是评估二代测序数据质量的重要指标。
高质量的测序数据对于后续的变异检测和分析至关重要。
在放行标准中，要求测序数据的质量得分大于Q30，以确保变异检测的准确性。
二、样本完整性样本完整性是指测序得到的DNA序列与原始样本DNA的一致性。
在二代测序中，由于PCR扩增和建库等操作可能导致DNA序列的偏移和丢失，因此需要评估样本的完整性。
在放行标准中，要求样本完整性大于90%，以避免由于序列偏移或丢失导致变异检测的误差。
三、测序深度测序深度是指测序得到的总碱基数与参考基因组的碱基总数的比值。
足够的测序深度是确保变异检测灵敏度和特异性的前提。
在放行标准中，要求测序深度大于10X，以满足大多数变异检测的需求。
四、测序覆盖率测序覆盖率是指测序得到的碱基序列与参考基因组的碱基序列的比值。
在放行标准中，要求基因组覆盖率大于95%，以确保变异检测的全面性和准确性。
五、检测变异检测变异是二代测序的主要目的之一。
在放行标准中，要求准确检测到已知的变异位点，并且变异位点的检测灵敏度和特异性均大于99%。
同时，要求对未知变异进行合理注释和解读。
六、数据分析数据分析是二代测序报告的重要组成部分。
在放行标准中，要求数据分析过程符合科学和规范的要求，并且分析结果准确可靠。
同时，要求对数据进行合理的解读和解释。
七、可重复性可重复性是指实验结果的稳定性和可靠性。
在二代测序中，由于操作复杂和数据量大等因素，实验结果的可重复性可能受到影响。
在放行标准中，要求实验结果具有较好的可重复性，以确保数据的可靠性和准确性。
八、生物信息学分析生物信息学分析是二代测序数据处理的重要环节。
在放行标准中，要求生物信息学分析过程符合规范和标准的要求，并且分析结果准确可靠。
同时，要求对生物信息学分析结果进行合理的解读和解释。
九、报告格式报告格式是二代测序报告的重要组成部分。
在放行标准中，要求报告格式规范、清晰、易于理解，并且包括必要的实验和数据分析过程、结果和结论等信息。
临床测序样本筛选原则
临床测序样本筛选原则
临床测序样本筛选原则主要包括以下几点：
1.样本的来源和类型：根据测序目的和目标基因的不同，选择合适的样本来源和类型。
例如，对于遗传性疾病的研究，通常会选择患者的血液或细胞样本；对于肿瘤研究，则可能会选择肿瘤组织样本。
2.样本的代表性：选择的样本应能够代表目标基因或表型的变异情况。
如果目标基因在某些亚型或特定组织中表达，则应选择来自这些亚型或组织的样本。
3.样本的数量和质量：为了保证测序结果的可靠性和可重复性，通常需要足够的样本数量，并确保样本质量良好，无严重降解或污染。
4.伦理和法律考虑：在选择临床测序样本时，应遵守相关伦理和法律法规，确保患者的隐私和权益得到保护。
同时，应获得患者或其监护人的知情同意。
5.成本效益分析：根据测序目的和预算限制，选择合适的样本数量和测序方案，确保能够获得有价值的测序结果，并避免浪费资源和成本。
总之，临床测序样本筛选原则是确保测序结果的可靠性和可重复性的关键因素之一。
在选择样本时，应综合考虑以上因素，并根据具体情况进行权衡和取舍。
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附：测序样品的要求
一、PCR原液
∙片断通常大于200bp；
∙提供浓度大于50ng/ul，体积大于50ul；
∙2ul电泳检测条带清晰无杂带。
二、PCR已纯化
∙PCR产物溶于超纯水中；
∙浓度大于50ng/ul，体积大于20ul；
∙电泳检测条带单一。
三、质粒要求
∙质粒浓度大于100ng/ul，体积大于20ul；
∙建议使用相关试剂盒提取；
∙建议同时提供1ml菌液；
∙大质粒需要注明载体长度。
四、菌液模板要求
∙说明载体的抗性，我们提供Amp 、kan、chl、tet四种抗生素；
∙对于低拷贝质粒请直接提供1ug纯化质粒；
∙提供1ml左右的过夜培养菌液，加15%灭菌甘油，于离心管中封口保存，防止交叉污染或泄漏；∙建议尽量提供穿刺培养的菌种。
五、引物要求
∙浓度5umol/l，体积大于20ul；
∙随机引物和兼并引物不适合测序；
∙尽可能提供引物全序列，PCR退火温度；
∙T7、SP6、M13(+)、M13(-)、T3等通用引物我们免费提供。
样品类型及注意事项。