大鼠线栓(MCAO)模型+灌注取脑+TTC染色
针刺结合丹红注射液对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用
针刺结合丹红注射液对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用曾兆禄;韩继超;薛云;马玉奎【摘要】目的：研究针刺结合丹红注射液对大鼠脑缺血再灌注损伤有无保护作用。
方法采用大脑中动脉内栓线阻断法（ MCAO）制备大鼠大脑中动脉脑缺血再灌注损伤模型，缺血2 h后将线拔出实现再灌注，分别于再灌注后立刻静脉注射丹红注射液2 mL／kg，并针刺百会、足三里，每天1次，连续3 d，72 h后采用Zea-Longa的5级4分制评分方法进行神经功能评分，TTC染色法测定脑梗死面积，Western blot法检测缺血侧脑皮层中Bcl-2与Bax的蛋白表达。
结果与模型和单用丹红注射液组比较，针刺结合丹红注射液治疗后大鼠神经功能缺陷评分明显降低，脑梗死面积减少，Bcl-2的蛋白表达增多，Bax蛋白表达减少。
结论针刺结合丹红注射液比单用丹红注射液对大鼠脑缺血再灌注损伤具有更明显的保护作用。
%Objective To investigate the neuroprotective effect of acupuncture combined with a Chinese medicine, Danhong injection, on focal cerebral ischemia/reperfusion injury in rats.Methods Middle cerebral artery ( MCA ) occlusion was prepared by putting a nylon suture in the MCA.The MCA blood flow in the animals was restored at two hours after the MCA occlusion by withdrawing the suture to the external carotid artery (ECA).The acupoints“Baihui”(DU20) and “Zusanli”(ST36) were acupunctured and stimulated by twirling the acupuncture needle after reperfusion, and the rats were also administered with Danhong injectionby intravenous injection, once every day for three days.Zea-Longa scores were recorded to assess the changes of neurological function. The rats were sacrificed at 72 h after reperfusion. Triphenyltetrazolium chloride( TTC) staining was used to measure cerebral infarction size.Western blot was used to test the level of Bcl-2 and Bax in the ischemicpenumbra.Results The acupuncture combined with Danhong injection treatment group displayed markedly lower neurologic deficit scores, reduced ischemic infarct surface, increased expression of Bcl-2 protein, and reduced expression of Bax protein, compared with those inthe model group and Danhong injection alone group.Conclusions Acupuncture combined with Danhong injection show more significant neuroprotective effect than Danhong injection treatment alone on rat models of cerebral ischemia/reperfusion injury.【期刊名称】《中国比较医学杂志》【年(卷),期】2016(026)002【总页数】5页(P62-66)【关键词】针刺;脑缺血再灌注损伤;Bcl-2;Bax【作者】曾兆禄;韩继超;薛云;马玉奎【作者单位】山东省临朐县人民医院，临朐，山东262600;济南市第一人民医院，济南，山东250011;山东省药学科学院，济南，山东250033;山东省药学科学院，济南，山东 250033【正文语种】中文【中图分类】R-33临床上对于缺血性脑血管病的首要治疗原则是尽早重建血液再灌，恢复脑部的血氧供应，使缺血脑组织重新获得营养物质供应并及时地将有害的代谢产物清除掉。
大鼠大脑中动脉缺血再灌注后不同时间点梗死体积的变化
大鼠大脑中动脉缺血再灌注后不同时间点梗死体积的变化王祎媛;方莹莹;周小龙【摘要】目的:在局灶缺血模型中,研究再灌注后0h、6h、24 h、48 h、72 h对大鼠梗死灶体积的影响.方法:将大鼠分为假手术组(sham组)和实验组,实验组在激光多普勒血流仪的监测下进行手术,术后有3分症状的入主,然后随机分为0h组、6h 组、24 h组、48 h组、72 h组.在不同的时间点处死大鼠,行TIC染色,然后计算梗死体积.结果:再灌注24 h之前,随着再灌注时间的延长梗死体积逐渐增大,0～24h,梗死体积变化有显著性差异；但再灌注24 h之后,梗死体积不再发生实质性的增加,24 ～ 72 h,梗死体积无显著性差异.结论:在研究局灶脑缺血梗死体积的实验中,24 h是一个非常重要的时间点.【期刊名称】《赣南医学院学报》【年(卷),期】2012(032)004【总页数】2页(P489-490)【关键词】局灶性脑缺血;梗死体积;时间点【作者】王祎媛;方莹莹;周小龙【作者单位】广东省妇幼保健医院药剂科;南方医科大学基础医学院神经生物教研室,广东广州510010;赣南医学院,江西赣州341000【正文语种】中文【中图分类】R743Abstract:Objective:To study the infarct volum of the brain at different time point(0 h，6 h，24 h，48 h，72 h)after the reperfusion of middle cerebral artery occlusion(MCAO).Methord:The rats were divided into sham group and experiment group，the rats in experiment group were induced MCAO at the monitor of laser Doppler flowmetry，then randomly divided into 0 h group，6 h group，24 h group，48 h group，72 h group at different time point，rats were killed and stained with TTC solution，the infarct volum.Result:Reperfusion before 24 h，the infarct volum is becoming bigger and bigger as the time elapse，but after 24 hours，the infarct volum will not change.Conclusion:In the study of focal cerebral ischemia and infarct volum experiments，the 24h is a very important time point. Key words:MCAO;infarct volum;time point中风以其高发病率、高死亡率、高致残率已经成为严重威胁人类生命与健康的主要疾病之一［1］。
脑卒中动物模型实验原理
脑卒中动物模型实验原理
1.1 缺血性脑卒中
2.1.2 线栓法
实验动物：MCAO大鼠、MCAO小鼠
模型特点：利用线栓闭塞大脑动脉血管，无需开颅，缺血时间和部位易控制，并发症少，是目前使用最广泛的脑卒中模型。
获取方法：可直接购买商品化模型
2.1.2 光化学法
实验动物：大鼠、小鼠
模型特点：无需开颅，重复性较高，病灶部位可控，但缺乏缺血半暗带，无法模拟部分病例的生理变化，适用于慢性脑缺血研究。
获取方法：系统给与光敏剂后，利用高强度光源照射，以激活脑区的光敏剂，产生脑水肿和血小板微血栓，造成局部梗死。
2.1.3 开颅电凝法
实验动物：大鼠、小鼠
模型特点：缺血效果稳定，出血量少，是目前公认的标准大脑中动脉闭塞模型，但开颅存在一定风险。
获取方法：右侧颞下入路进行开颅，采用双极电凝将大脑中动脉闭塞后切断。
1.2 出血性脑卒中
2.2.1 自体注入法
实验动物：ICH大鼠
模型特点：采集自体股动脉血注射至大鼠右侧基底节制作ICH模型，操作简便，出血部位稳定，与人类脑出血病理过程相似。
2.2.2 自发脑出血
实验动物：大鼠
模型特点：将高血压与出血性脑卒中有机结合，适用于高血压引起的脑出血病理生理机制研究。
获取方法：对SHR（自发性高血压）大鼠进行大脑中动脉结扎处
理
2.2.3 胶原酶注入法
实验动物：大鼠、小鼠
模型特点：操作简便，重复性高，与临床脑出血病理生理相似性高，但实验影响因素较多，稳定性较差。
获取方法：将胶原酶通过微量注射器注射入动物尾壳核内。
TTC染色流程
TTC染色流程
TTC染色流程
【实验目的】：通过TTC 染色观察梗死病变及梗死体积。
【实验试剂】：2%红四氮唑溶液，PBS溶液，10%中性甲醛
【实验器械】：-20℃冰箱，脑切片机，取脑器械等
【实验流程】：
1.断头法取脑断头法处死动物后迅速取脑（10min内）,置于0-4℃PBS溶液中
转移，- 20℃冰箱冷冻30 min。
除去小脑、嗅球和低位脑干。
2.切取冠状位脑片,厚度为2 mm,将脑片放入2%红四氮唑溶液中37℃避光水浴
30 min，每5min轻微晃动容器，使充分染色。
3.取出脑片用PBS溶液洗涤3-5min，可马上拍照，用10% 中性甲醛固定脑片
6 h。
4.选择每一切片的尾侧面用病理图文分析系统进行图像分析,测量每片的梗死
面积和总面积,每层梗死体积为该层梗死面积和层厚的乘积,各层的梗死体积之和即为总的梗死体积。
线栓法大鼠大脑中动脉阻断实验(MCAO模型)的经验
线栓法大鼠大脑中动脉阻断实验（MCAO模型）的经验本人现在正在做线栓法大鼠大脑中动脉阻断实验（MCAO模型），这方面的资料我查了一些，这个实验我也作了一段时间，不敢说很专业了，不过现在基本上我能在15min左右完成手术，而且手术过程中不出一滴血，造模后缺血程度基本一致。
虽然前面有很多前辈发了很多MCAO的很专业的贴子，不过我觉得比较凌乱，现在我把我的心得体会和以前的贴子的精华部分奉献给大家，希望这会对将要做这个实验的朋友有一丝的帮助。
虽然做实验总会有郁闷的时候，不过风雨之后总会见到彩虹的，这可以也是我的心得体会。
衷心祝福大家能把实验做的成功、完美！实验前准备麻醉剂：水合氯醛（应较好的控制大鼠体温）保温：60W白炙灯高度为37cm直接照射能使肛温保持在 37℃栓线的制备：1.取熔点为56℃的固体石蜡一块，在瓷杯中加热熔化。
直径为0.24mm、长5cm的鱼线一端5mm长的一段，垂直在熔化的石蜡中迅速浸入并提起，立即凝固的一薄层石蜡可牢固地粘附在鱼线一端的表面，其直径为0.26mm。
就这样，普通的鱼线即可变成规相一致头端光滑圆钝的栓线。
2.在鱼线18mm的位置用涂改液标记一个白色点。
TTC的配制：用0.2mol/L磷酸缓冲液（PBS）配成2%TTC溶液（pH7.5），避光保存体重与栓线直径：线栓直径0.24mm采用的SD大鼠，体重250-300g。
实验方法：动物用10％水合氯醛（35mg/kg）腹腔注射麻醉。
仰卧位固定，颈正中线切口，沿胸锁乳突肌内缘分离肌肉和筋膜，分离左侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA），在CCA远心端和近心端与ECA处挂线备用。
用微动脉夹暂时夹闭ICA，然后近心端结扎CCA、ECA。
然后在距CCA分叉部4mm处剪一小口，将拴线插入到ICA，这时用绕在CCA远心端的细线轻轻系牢拴线。
（不可过紧，否则进线困难，但松了又会出血。
）用眼科镊轻推拴线，从血管分叉处开始算距离，当插入深度在18 mm时（一定要将血管放松至原来状态, 且保证标记点在分叉处,由于标记的是白色的所以很容易看的），紧紧系牢CCA远心端的细线，此时的关键是动作轻柔，不要使ICA有任何的牵拉，否则栓线会脱出ACA，可能会造成缺血失败。
尼莫地平对MCAO／R模型大鼠不同时间点血流灌注量的影响
尼莫地平对MCAO／R模型大鼠不同时间点血流灌注量的影响目的：利用激光散斑血流成像技术观察尼莫地平对大鼠大脑中动脉栓塞模型脑血流灌注量的影响。
方法：成年雄性SD大鼠，采用改良线栓法制备大脑中动脉梗塞/再灌注模型。
利用激光散斑血流成像技术观测造模前，缺血再灌注05、1、2、24h后脑血流灌注量情况，并对选定区域血流进行分析，再灌注24h TTC染色观察脑梗死体积。
结果：造模成功后大鼠右侧脑血流明显减少，灌胃给4mg/kg 尼莫地平后，大鼠局部脑血流渐渐增加，脑梗死面积减少，脑组织含水量减少。
结论：尼莫地平能显著增加MCAO/R模型大鼠血流量。
标签：尼莫地平；脑缺血再灌注损伤；激光散斑血流成像；脑血流量Effect of Nimodipine on MCAO/R Rats Different Time Point Blood PerfusionZHANG Zhixue1，3HUANG Xi1，3LI Yue1，2，3YANG Zhibin1，2，3XIAO Huai1，2，3WU Xiumei1，2，3ZHANG Chenggui1，2，3*1.Yunnan Provincial Key Laboratory of Entomological Biopharmaceutical R&D，Institute of Entomoceutics Research，Dali University，Dali 671000，China；2.Yunnan Provincial 2011 Collaborative Innovation Center for Entomoceutics，Dali University，Dali 671000，China；3.National-Local Joint Engineering Research Center of Entomoceutics，Dali 671000，ChinaAbstract：Objective To study the effect of nimodipine on cerebral blood flow in MCAO/R rats by laser speckle imaging （LSI）. Methods To establish the MCAO/R model in male SD rats by the modified intraluminal filament technique. Measuring the cerebral blood flow before modeling and after ischemia-reperfusion for 05 h，1 h，2 h，24 h by LSI，meanwhile analysing the selected area blood flow，and observing the infarct size after perfusion for 24 h with TTC. Results The cerebral blood flow was decreased in right hemisphere after the models established successfully，and after the intragastric administration of nimodipine with 4 mg/kg，the regional cerebral blood flow of rats gradually increased，the cerebral infarction area reduced，and the brain water content was decreases. Conslusions Nimodipine significantly improve the cerebral blood flow of MCAO/R rats.Keywords：Nimodipine；Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury；Laser Speckle Imaging；Cerebral Blood Flow缺血性腦卒中（Ischemic Stroke，IS）指脑的供血主动脉发生狭窄或阻塞，脑的血液供应出现障碍，导致氧和营养物质的缺乏，从而引起脑的功能异常，脑局部组织坏死[1]。
大鼠线栓(MCAO)模型+灌注取脑+TTC染色
第一部分 线栓模型制作1、实验器材（从左到右）：第一行：干棉球、酒精棉球、10％水合氯醛＋注射器、碘伏＋棉签第二行：三种不同粗细的鱼线（鱼线最好在2.0、2.5mm处各用记号笔作好标记，便于观察进入距离）、弯盘内为手术器材第三行：记号笔、自制拉钩（皮筋+曲别针＋大头针）2、麻醉：可用饮料瓶自制捕鼠器（适用于不敢手抓大鼠的），用于打麻药，根据大鼠的重量选择不同粗细的饮料瓶（太粗了大鼠可在瓶中回头）。
效果图3、麻倒后绑在手术台上。
4、剪去颈前的鼠毛，碘伏消毒。
5、沿经部正中切开皮肤。
说明：切开皮肤前最好将结扎动脉的线事先剪好（后面会用到）。
6、钝性分离皮下组织。
如图：大鼠腹侧可见事先剪好的结扎线。
7、分离到气管前肌后，沿右侧胸锁乳突肌腱向下分离，见到颈动脉鞘后可上拉钩。
8、分离动脉鞘。
如图：分离好后见光滑的颈总动脉。
9、分离出颈总、颈外、颈内动脉，结扎颈总、颈外动脉，注意中间那根线不要系紧，用来插鱼线时防止出血的。
10、夹闭颈内动脉，用眼科剪将颈总动脉剪一小口。
11、插入鱼线，鱼线进入颈内动脉后按图中注释方法插（成功率在90%以上）。
说明：（1）这一步鱼线选择是关键，根据大鼠重量（作的多了后根据动脉粗细就可选择了）选鱼线。
我们的经验是：250g以下的选0.26mm的线，250-300g的选0.26mm蘸腊的或0.28的都可以。
（2）如果遇到鱼线怎么也查不进去的情况，可让大鼠休息一会，换细点的鱼线再试，这种情况不一定都是进到翼腭动脉了，我曾解剖过4例这种情况的大鼠，有三例都是在如颅的地方卡住了，可惜我们手里没有0.24mm的鱼线。
（3）通过实践，我们认为结扎或夹闭翼腭动脉没有必要，按我们的方法，熟练的话，从切开到缝合完毕也就是15分钟，算上准备工作（如麻醉、消毒等）半小时也可以搞定了，这样一上午两人作10只大鼠不成问题。
（4）我们体会最好用蘸腊的鱼线作模型，好处是进线深度控制的好，不容易出现蛛网膜下腔出血。
TTC染色流程
TTC染色流程
【实验目的】：通过TTC 染色观察梗死病变及梗死体积。
【实验试剂】：2％红四氮唑溶液，PBS溶液,10％中性甲醛
【实验器械】：-20℃冰箱，脑切片机，取脑器械等
【实验流程】：
1.断头法取脑断头法处死动物后迅速取脑(10min内），置于0—4℃PBS溶液
中转移，- 20℃冰箱冷冻30 min。
除去小脑、嗅球和低位脑干.
2.切取冠状位脑片,厚度为2 mm，将脑片放入2%红四氮唑溶液中37℃避光水浴
30 min,每5min轻微晃动容器，使充分染色。
3.取出脑片用PBS溶液洗涤3—5 min，可马上拍照,用10% 中性甲醛固定脑片
6 h.
4.选择每一切片的尾侧面用病理图文分析系统进行图像分析，测量每片的梗死
面积和总面积，每层梗死体积为该层梗死面积和层厚的乘积，各层的梗死体积之和即为总的梗死体积。
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第一部分 线栓模型制作
1、实验器材（从左到右）：
第一行：干棉球、酒精棉球、10％水合氯醛＋注射器、碘伏＋棉签
第二行：三种不同粗细的鱼线（鱼线最好在2.0、2.5mm处各用记号笔作好标记，便于观察进入距离）、弯盘内为手术器材
第三行：记号笔、自制拉钩（皮筋+曲别针＋大头针）
2、麻醉：
可用饮料瓶自制捕鼠器（适用于不敢手抓大鼠的），用于打麻药，根据大鼠的重量选择不同粗细的饮料瓶（太粗了大鼠可在瓶中回头）。
效果图
3、麻倒后绑在手术台上。
4、剪去颈前的鼠毛，碘伏消毒。
5、沿经部正中切开皮肤。
说明：切开皮肤前最好将结扎动脉的线事先剪好（后面会用到）。
6、钝性分离皮下组织。
如图：大鼠腹侧可见事先剪好的结扎线。
7、分离到气管前肌后，沿右侧胸锁乳突肌腱向下分离，见到颈动脉鞘后可上拉钩。
8、分离动脉鞘。
如图：分离好后见光滑的颈总动脉。
9、分离出颈总、颈外、颈内动脉，结扎颈总、颈外动脉，注意中间那根线不要系紧，用来插鱼线时防止出血的。
10、夹闭颈内动脉，用眼科剪将颈总动脉剪一小口。
11、插入鱼线，鱼线进入颈内动脉后按图中注释方法插（成功率在90%以上）。
说明：
（1）这一步鱼线选择是关键，根据大鼠重量（作的多了后根据动脉粗细就可选择了）选鱼线。
我们的经验是：250g以
下的选0.26mm的线，250-300g的选0.26mm蘸腊的或0.28的都可以。
（2）如果遇到鱼线怎么也查不进去的情况，可让大鼠休息一会，换细点的鱼线再试，这种情况不一定都是进到翼腭动脉了，我曾解剖过4例这种情况的大鼠，有三例都是在如颅的地方卡住了，可惜我们手里没有0.24mm的鱼线。
（3）通过实践，我们认为结扎或夹闭翼腭动脉没有必要，按我们的方法，熟练的话，从切开到缝合完毕也就是15分钟，算上准备工作（如麻醉、消毒等）半小时也可以搞定了，这样一上午两人作10只大鼠不成问题。
（4）我们体会最好用蘸腊的鱼线作模型，好处是进线深度控制的好，不容易出现蛛网膜下腔出血。
我们曾试过0.26mm 的鱼线（不带腊）在250g以下的大鼠进入深度足有2.5cm
12、成功后结扎中间那根线，可见第一个标记距动脉分叉约2mm。
13、缝合。
14、缝好后用酒精棉球消毒皮肤缝合处。
15、缝好后的效果如图，外面的鱼线最后用记号笔涂黑，便于再灌拔线时观察。
16、将大鼠放回笼内。
17、2小时再灌。
18、醒后看效果，左爪不能伸展（完全醒后可见绕圈或追尾、倾倒），我们的体会，症状2-3分的死亡率高，1-2分的死亡率低，有的大鼠第二天或几天后可无明显症状，但取脑后还是有梗死灶的。
附：一般文献上的MCAO制作方法＋评分标准
局灶性脑缺血再灌注模型的制备根据longa提出的可逆性大脑中动脉闭塞(MCAo)线栓法并根据大鼠脑解剖结构图加以改进制作局灶性脑缺血再灌注模型,以10%水合氯醛0.3ml/kg腹腔麻醉,颈正中切口,暴露颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)及翼腭动脉,将0.26mm单丝尼龙鱼线头端0.5cm用石蜡包被,并于20mm长处标记,全部大鼠均通过右侧CCA切口处插入,翼腭动脉短暂夹闭以防误插,栓线长度自CCA分叉处约18～20mm,根据动物体重而定,栓塞右侧大脑中动脉,然后缝合皮肤,栓线尾端部分固定于皮肤上。
缺血达到2h后小心抽出栓线,即形成再灌注。
假手术对照只是不插入尼龙鱼线,其余步骤同手术组。
在缺血期间及再灌注后2h保持体温在(37±0.5)℃。
模型成功的标志为以大鼠手术麻醉清醒后出现左侧肢体瘫痪,站立不稳,提尾时向一侧转圈为模型成功的判断标准。
神经功能缺失体征评分 参考Longa及Bederson的5分制法在动物麻醉清醒后24h进行评分。
0分:无神经损伤症状;1分:不能完全伸展对侧前爪;2分:向对侧转圈;3分:向对侧倾倒;4分:不能自发行走,意识丧失。
分值越高,说明动物行为障碍越严重。
第二部分 灌注取脑
流程：1)麻醉 2)开胸 3)心脏左心室穿针,剪开右心耳 4)生理盐水冲水 5)4%多基甲醛固定 6)取脑 7)保存或切片.
1 多聚甲醛的配置：
一般方法为：4％多聚甲醛PBS缓冲液配法：称取40g PFA溶于装有500ml DEPC水的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至60～65℃，使成乳白色悬液。
用1.0mol/L的NaOH值至7.0，使呈清亮状（滴加），再加入约500ml PBS，充分混匀（在冰浴或冷水浴中），可再检测一下pH，过滤后定容至1000ml，室温或4℃保存备用。
我们用的方法：加热至60～65℃固然融解的快，不过容易挥发，气味难闻，不是好的选者。
我们是这样做的，感觉不错，在此强烈推荐：先配好pbs，称好相应的多聚甲醛，37c水浴或温箱密封放置2天，就能全溶。
2 灌注所用器皿：一般用输液瓶及输液管，为了提高灌注速度可以用较大号的针头及增加灌注压力。
3 麻醉后开胸：暴露充分些容易心脏穿刺及剪开右心耳。
箭头所指为右心耳。
4心尖插入灌注针头，剪开右心耳，开放静脉血。
5 夹闭腹主动脉：只灌注上肢及头脑，固定的好又快，又省多聚甲醛。
多聚甲醛用100ml以下即可。
6 先灌注生理盐水约100ml，见到老鼠两前肢及两肺变白可改灌注多聚甲醛。
7 灌注成功的标志：刚开始灌注时老鼠前肢剧烈抽动（下肢不抽动证明腹主动脉夹闭完全）；前肢及颈部僵硬；所灌注的脑组织白而硬。
8 取脑过程:剪开皮肤暴露头及颈段，从颈椎处剪断颈髓。
9 分离除去后颈部肌肉
10 用弯钳仔细剔除颅骨
11 分离颅骨时注意硬脑膜，避免硬脑膜划伤脑组织。
12取脑时可以从延髓开始，慢慢分离颅底组织，这样不容易损伤大脑。
13 未灌注的脑
14 灌注后的脑
15 取脑后在多聚甲醛中4c固定4－6小时，取材，脱水，包埋后可长期保存。
16 石蜡包埋后的样本
第三部分 TTC染色
1原理：TTC（2，3，5—氯化三苯基四氮唑）是脂溶性光敏感复合物，1894年首次合成用来检测种子的生存能力，1958年开始用来染色检测哺乳动物组织的缺血梗塞。
它是呼吸链中吡啶—核苷结构酶系统的质子受体，与正常组织中的脱氢酶反应而呈红色，而缺血组织内脱氢酶活性下降，不能反应，故不会产生变化呈苍白。
2 取脑：可麻醉后直接取脑或经生理盐水灌注后取脑。
因为脑组织未用多聚甲醛固定，所以较软，取脑时更应仔细，保持大脑的完整性。
3 －20度冰箱中速冻20分钟左右，便于切片
4 切片：一般切成5－6片，每隔2mm切一片。
第一刀在脑前极与视交叉连线中点处；第二刀在视交叉部位；第三刀在漏斗柄部位；第四刀在漏斗柄与后叶尾极之间。
（参考：张均田，主编.现代药理试验方法）。
如果需计算面积的话，
应切的均匀或用专门的脑槽。
5 降切片置于TTC中，常规浓度为2％，也有用1％或更低浓度的。
6用锡箔纸盖住后，放入37c温箱15～30min，不时翻动脑片，使均匀接触到染色液。
7 染色后效果：为皮层下梗死
8 照相：可用来计算梗死体积等。