取小鼠脑组织
小鼠脑组织匀浆的制备 -回复
小鼠脑组织匀浆的制备-回复小鼠脑组织匀浆的制备：一步一步回答引言：小鼠是广泛用于生物学研究的模式动物之一。
在研究中，常需要获得小鼠脑组织的匀浆用于分析。
小鼠脑组织匀浆的制备是一个关键步骤，本文将详细介绍制备小鼠脑组织匀浆的方法。
一、实验前的准备工作1.准备工具和材料：- 镊子和剪刀：用于取出小鼠脑部。
- 水浴或热板：用于加热。
- 离心管和离心机：用于离心沉淀。
- 细胞磨机或高压细胞破碎仪：用于破碎组织。
- 甘油：用于保存匀浆样品。
2.准备工作环境：- 消毒实验台面和工具。
- 佩戴一次性手套和口罩。
- 使用无菌工作环境。
二、小鼠脑组织的分离与采集1.选择适合的小鼠：- 根据实验要求选择适龄、适性别的小鼠。
- 使用已通过伦理审查的正规实验动物。
2.麻醉小鼠：- 使用适当的麻醉剂，如异氟醚，使小鼠处于无痛觉和无抵抗状态。
3.解剖小鼠头部：- 使用镊子和剪刀从颅骨处将头剥离。
- 将剥离的头部放于含有冷生理盐水的离心管中。
4.取出小鼠脑部：- 利用镊子和剪刀小心地将小鼠脑部取出，并放入含有冷生理盐水的离心管中。
5.清洗脑部：- 使用冷生理盐水轻轻清洗脑部表面的血液和残留物。
6.分离脑部组织：- 使用镊子和剪刀将小鼠脑部切割成小块，并放入含有冷生理盐水的离心管中。
7.离心：- 将含有脑组织的离心管进行离心，以去除冷生理盐水，留下脑组织。
三、小鼠脑组织的匀浆过程1.加入缓冲液：- 向含有小鼠脑组织的离心管中加入适量的缓冲液，如磷酸缓冲液或PBS 缓冲液。
- 缓冲液的加入可以帮助保持组织的完整性和细胞结构，并防止样品干燥。
2.组织破碎：- 使用细胞磨机或高压细胞破碎仪对脑组织进行破碎。
破碎的程度可以根据实验需求进行调整，但需注意保持样品的温度低于4摄氏度以避免细胞损伤。
3.离心：- 将破碎后的脑组织均质液进行离心，减速离心10-15分钟以沉淀细胞碎片和细胞核。
4.收集上清液：- 使用移液管小心收集上清液，避免带入沉淀物。
脑类器官培养方法
脑类器官培养方法
脑类器官培养方法是一种利用细胞培养技术，将脑组织中的神经元和神经胶质细胞在体外培养成三维结构的方法，可以用于研究神经元和神经胶质细胞在生理和病理情况下的生长、发育、功能等方面的变化。
具体的培养方法包括：
1.收集脑组织：从小鼠、大鼠、猪等动物中取出脑组织，进行分离和清洗。
2.细胞分离：将脑组织中的神经元和神经胶质细胞进行分离，可以采用酶消化法、机械分离法等方法。
3.培养基制备：制备适合神经元和神经胶质细胞生长的培养基，包括营养成分、生长因子和抗生素等。
4.培养：将分离后的神经元和神经胶质细胞在培养基中进行培养，使其自组织形成类器官结构。
5.维持和观察：在培养过程中需要保持细胞的生长状态和培养条件，观察类器官的形态、结构和功能变化。
脑类器官培养方法可以用于研究神经退行性疾病、神经发育异常、毒品成瘾等神经系统相关疾病的机制，也可以用于药物筛选和治疗方法的研究。
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小鼠脑组织单细胞悬液制备
小鼠脑组织单细胞悬液制备小鼠脑组织单细胞悬液制备1. 介绍在神经科学研究中，了解脑组织单细胞的特性对于理解神经系统的功能和疾病机制至关重要。
然而，脑组织是由多种细胞类型组成的复杂结构，并且其中每个细胞都可能具有不同的功能和表型。
为了更好地研究单个细胞的特性，科学家们开发了一种名为小鼠脑组织单细胞悬液制备的方法。
这种方法通过将脑组织分散成单个细胞，并将其分散在悬液中，从而实现对单个细胞的高通量分析。
2. 方法为了制备小鼠脑组织单细胞悬液，需要进行以下步骤：2.1 样本获取需要从小鼠的脑部获取组织样本。
这可以通过小鼠解剖后直接取出脑组织，或者使用小鼠进行体内或体外实验后切割脑部样本来实现。
在获取样本时，应该尽量保持组织的完整性，并避免对组织产生损伤。
2.2 组织解离将获取的脑组织放入含有解离酶的培养液中，如含有DNA酶和组织蛋白酶的消化液。
在适当的温度下对组织进行消化，以分解细胞外基质和细胞间连接，并释放单个细胞。
2.3 细胞分散使用细胞分散装置（如离心机或乳化机）对脑组织进行均匀分散，以获得单个细胞的悬浮液。
这个步骤非常重要，因为它可以确保细胞在悬液中均匀分布，避免细胞之间的聚集。
2.4 细胞筛选对获得的单个细胞进行筛选，去除破碎的细胞碎片和其他非细胞成分。
这可以通过离心或滤波等方法实现。
2.5 细胞保存将获得的单细胞悬液进行处理，并将其保存在适当的条件下，以便进行后续实验。
这可能涉及使用液氮冷冻细胞保存液将细胞冷冻保存，或者将细胞悬液转移到培养皿中进行培养等。
3. 应用通过小鼠脑组织单细胞悬液制备的方法，研究人员可以对单个细胞的基因表达、蛋白质水平和细胞类型等进行高通量分析。
这对于探索脑发育、神经回路连接和神经系统疾病等方面具有重要意义。
3.1 基因表达谱分析通过对脑组织单细胞进行转录组测序，可以获得单个细胞的基因表达谱。
这有助于揭示不同细胞类型的特征基因表达，从而更好地理解神经系统中细胞的多样性和功能。
小鼠脑组织匀浆的制备 -回复
小鼠脑组织匀浆的制备-回复小鼠脑组织匀浆的制备，是一项常用的实验技术，在神经科学研究中具有重要的应用。
该技术可以用于分离和富集脑组织内的特定类型细胞（如神经元、星形细胞等），进而研究其结构、功能和分子机制等。
本文将一步一步介绍小鼠脑组织匀浆的制备方法，并解释其原理和注意事项。
第一步：准备实验器材和材料在进行小鼠脑组织匀浆实验之前，我们需要准备以下器材和材料：1. 小鼠大脑（获取小鼠的脑组织需要进行相应的伦理审批和操作）2. 磷酸盐缓冲液（PBS）：含有适当的盐浓度和pH值，用于缓冲和洗涤组织。
3. 离心管和离心机：用于离心和分离脑组织。
4. 组织破碎器：用于破碎脑组织，如高速均质机或超声波细胞破碎机。
第二步：取得小鼠脑组织首先，用PBS溶液冲洗小鼠的大脑，以去除血液和杂质。
然后，将小鼠的大脑放在清洁的工作台上，用小匀针或刀片将大脑从小鼠头部剥离下来。
注意要小心操作，避免损伤脑组织。
第三步：组织均质将剥离下来的大脑放入预先冷却的PBS缓冲液中，以避免组织的氧化和变质。
然后，将大脑转移到组织破碎器中。
根据实验需要，选择适当的均质方法进行组织均质。
常用的方法包括高速均质机和超声波细胞破碎机。
这些方法可以将脑组织破碎成均匀的细胞悬浮液。
在均质过程中，可以添加一定比例的PBS缓冲液，以保持细胞悬浮液的稀释度和比重。
第四步：离心和分离细胞将均质得到的细胞悬浮液转移到离心管中，并进行离心分离。
一般来说，离心速度和时间的选择应该根据细胞类型和实验目的来确定。
例如，对于富集神经元的细胞悬浮液，可以选择低速离心（如1000 g，10分钟），以沉淀较大的细胞碎片和细胞器。
然后，将上清液转移到新的离心管中，再次进行高速离心（如12000 g，15分钟），以沉淀细胞核和细胞膜。
得到的上清液即为小鼠脑组织的匀浆。
第五步：保存和应用最后，将脑组织匀浆保存在低温的液氮或冰箱中，以便后续实验的使用。
脑组织匀浆可以用于各种实验技术，如蛋白质分析、RNA/DNA提取、细胞培养和酶活性测定等。
小鼠前额叶皮层提取
小鼠前额叶皮层提取
摘要：
1.实验背景
2.提取方法
3.提取过程
4.实验结果
5.结果分析
6.实验意义
正文：
小鼠前额叶皮层提取实验是一项研究小鼠大脑功能的重要实验。
通过提取小鼠前额叶皮层，研究者可以深入了解大脑的神经网络和功能。
本文将详细介绍小鼠前额叶皮层的提取方法、过程以及实验结果和意义。
首先，实验背景部分。
小鼠前额叶皮层是大脑的一个重要区域，参与了许多高级认知功能，如决策、规划、社交行为等。
因此，研究该区域对于理解大脑功能具有重要意义。
其次，提取方法部分。
小鼠前额叶皮层的提取主要采用立体定位技术，通过手术方法获取小鼠大脑前额叶皮层组织。
该方法准确、可靠，为实验研究提供了有力保障。
接下来，提取过程部分。
实验过程中，首先对小鼠进行麻醉，然后使用立体定位仪进行精准定位，将小鼠前额叶皮层切除并收集。
此过程要求精细操作，以保证实验结果的准确性。
实验结果部分，研究者通过对前额叶皮层进行染色和切片，观察其结构和功能特性。
这些结果为后续的实验分析和讨论提供了丰富的素材。
结果分析部分，研究者对实验结果进行了深入的讨论，揭示了前额叶皮层在神经网络中的重要作用，以及与其他大脑区域的关联。
最后，实验意义部分。
小鼠前额叶皮层提取实验为研究大脑功能和神经网络提供了宝贵的实验材料，有助于深入了解大脑的工作原理和高级认知功能的机制。
小鼠vta脑区取材方法
小鼠vta脑区取材方法小鼠VTA脑区取材方法简介：小鼠VTA（腹侧被盖区）是大脑中重要的多巴胺产生区域，对于奖赏行为和成瘾行为的调节起着重要的作用。
因此，研究小鼠VTA脑区的结构和功能对于理解这些行为的神经机制至关重要。
本文将介绍一种常用的小鼠VTA脑区取材方法。
实验材料准备：1. 小鼠（一般选择成年雄性小鼠）；2. 麻醉剂（如异氟醚、氯硝西泮等）；3. 消毒液和外科手术器械；4. 生理盐水和其他所需试剂；5. 固定液（如4%的无水甲醛）。
实验步骤：1. 将小鼠置于麻醉箱中，使用合适的麻醉剂进行麻醉。
确保小鼠完全麻醉后，取出小鼠放在手术台上。
2. 使用消毒液彻底清洗手术台，并戴上手套，准备外科手术器械。
3. 用剪刀将小鼠头部的皮肤剪开，暴露出颅骨。
使用消毒液消毒颅骨表面。
4. 使用骨科钻头小心地钻开颅骨，暴露出脑组织。
在此过程中，应保持脑组织湿润，可使用生理盐水滴在脑表面。
5. 使用显微镊子小心地切割脑膜，暴露出VTA脑区。
6. 使用吸管或注射器将生理盐水或其他所需试剂注入脑腔中，以保持脑组织的湿润和稳定。
7. 使用显微镊子或刀片小心地取出VTA脑区组织样本。
注意避免对其他脑区造成损伤。
8. 将取出的脑组织样本置于固定液中，进行固定处理。
根据实验需求，固定时间可根据需要延长或缩短。
9. 固定完毕后，将脑组织样本转移到适当的保存液中，如PBS缓冲液。
10. 可根据实验需要对脑组织样本进行后续处理，如切片、染色、免疫组化等。
注意事项：1. 在整个实验过程中，应注意保持无菌操作环境，避免外源性污染。
2. 为了减少小鼠的痛苦，应尽量缩短实验时间，并使用适当的麻醉剂和镇痛剂。
3. 实验操作应轻柔、耐心，并尽量避免对脑组织造成损伤。
结论：通过上述方法，我们可以成功地取得小鼠VTA脑区的组织样本，为后续对该区域的结构和功能进行研究提供了基础。
这一方法在行为学、神经科学等领域得到广泛应用，有助于我们更好地理解小鼠VTA脑区在奖赏行为和成瘾行为中的作用机制。
小鼠pcr基因扩增及鼠灌注取脑操作
小鼠PCR基因鉴定一、取材：小鼠出生后3-4周，给小鼠打耳标，并依照雌雄分笼饲养，需要鉴定的小鼠剪尾部、脚趾或耳部边缘，放置好在印管中，并做好相应的标志，放置标本与标志混乱。
处理: (1)将A液一定量加入带有样本的印管中，在98℃孔板中煮1小时（2）取出印管后，再加入B液75 μl二、扩增1.反应体系 Mix 5μlH20 3μlPrimer1 0.5mlPrimer2 0.5ml2.加样先计算出所需总量，加入印管中，混合均匀，离心，摆放好单个PCR管，将上述混合液放入PCR仪，每管9 μl盖紧。
3.扩增打开PCR仪并设置好程序，将PCR管放入PCR仪，扩增，40多分钟可以完成。
4.保存扩增后，取出PCR管，放入冰中保存。
三、琼脂糖凝胶电泳1.制胶：电子天平称取计算后的琼脂糖，小心倒入干净的锥形瓶内（锥形瓶内保持干净）。
加入TAE缓冲液，盖上锡箔纸，加热。
取制胶模具、梳子，安装固定，保证不会漏胶。
戴上手套，取出锥形瓶，掀开锡箔纸，冷却3-4分钟，加入染色剂，贴着远梳子端的制胶模板壁缓慢倒入琼脂糖溶液，若有气泡。
室温放置凝固。
2.上样：胶凝固后，双手缓慢垂直地拔出梳子，避免破坏梳孔。
将胶板放上电泳槽，注意正负极变化，加入1×TAE缓冲液，从胶表面开始缓慢倒入，自然流向两边，然后依次对孔加入对应的DNA样品，剩余样品放入冰箱储存。
3.电泳：合上电泳槽，正负极对好，检查底部是否有气泡升起。
有气泡则电泳开始。
4.成像：观察是否出现条带，若出现条带，则停止电泳，打开凝胶成像系统，对结果进行比对、记录并拍照。
关闭系统，登记实验记录，取出胶并清洗仪器器材。
鼠灌注取脑1、麻醉：根据鼠的体型、重量适量注射麻醉剂，腹腔注射，用手套防止被鼠抓伤，虎口卡住颈部肌肉及其周围肌肉，注射药物时反推针筒活塞以防有空气，针头针刺入鼠腹腔注射药物后，并放回笼中，等待药物起效。
2、开胸：找到剑突，用弯剪在剑突附近把毛剪干净，露出表层皮肤，再沿肋弓朝两边剪开，注意深度，别剪到心脏，待心脏暴露出后，仔细剔除神经，剪掉心包膜，用镊子夹持剑突并将其连胸廓上翻固定，使心脏充分暴露。
小鼠灌注取脑
成年小鼠心脏灌流及取脑组织步骤
实验步骤：
1、小鼠麻醉后立即将其用针头固定在泡沫板上（用针头插住四肢）。
用镊子扯起胸部皮肤，另一只手用剪刀剪开胸腔的皮肤和肋骨，暴露出心脏和肝脏。
2、将注射针头插入小鼠左心室，同时将小鼠肝脏减掉，以使血液流出。
灌注生理盐水，时间维持在1min（10~20ml）灌注液左右，血液排除后四肢、肝脏和舌头会变白。
3、待小鼠四肢、肝脏和舌头变白之后，用4%PFA灌流固定，当PFA 流至大脑处可能会使小鼠尾巴略有反射现象（有时可能没有），此时可将灌流速度下调，以使固定更加充分。
整个PFA灌流时间约为5min。
（固定原理：多聚甲醛可以使蛋白质交联）
4、将导管始端从PFA中拿出，待管中液体流尽后，将心脏上的针头拔下，如果固定的较好，可发现小鼠眼球呈现白色。
将托盘中的血液倒至废液桶内，并准备下一步的取脑操作。
取脑及脱水：
1、剪开头部皮肤，露出白色头盖骨。
将延髓上包被的软骨剪开，除去多余的结缔组织。
需要注意的时，眼睛要由剪刀剪下，不能够直接扯下来，因为眼睛后部连着视神经，如果扯的话有可能会损坏视交叉上核等其他脑部组织。
2、将头盖骨小心剥开，露出白色的脑部，在剥嗅球部位时要格外小心，必要的话可以先将嗅球前部的碎骨留着待进一步固定之后再去除。
3、将头盖骨剥开后，将脑下部连接的神经逐条剪短（可看到视神经交叉），待全部剪断后将脑整个剥离出来。
4、将剥离出来的脑浸泡在4%PFA中，过夜固定。
5、将PFA液换为30%蔗糖进行脱水（防止冷冻切片时形成冰晶和孔洞），初始脱水时脑会浮在蔗糖上面，待完全脱水后脑会沉底。
此时可将脑取出进行冷冻切片。
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丁香园上面总结的方法，排版有点乱。
其实过程与大鼠近似，我的经验是：1.材料准备；大剪刀、眼科剪、眼科镊、大镊子、滤纸、竹签等；2.步骤：处死小鼠，取头颅；剪开皮肤，漏出颅骨；用大尖镊子夹住两侧眼眶，用眼科剪稍剪除颅骨中线；再用眼科镊夹住颅骨从内向外夹，从下向上逐步去除颅骨；当全脑露出时，再用眼科镊去除脑膜和血管；然后用竹签从嗅球处向下取出全脑，即可。
3.注意事项：用力轻柔，否则容易弄破脑部；用剪刀剪颅骨时，一定要贴壁向上剪，否则容易剪破脑部；去除脑膜时，不能硬拉，否则容易弄破大脑；取出全脑时应把头顶朝下，用竹签轻轻取出，离桌面也不要太远、高；若留病理，建议一定要取完整无损的大脑。
做免疫组化的话，稍微麻烦一点儿，因为脑组织含水量多，要固定的好，就需要先灌注。
先麻醉小鼠剪开胸腔，找到心脏，从心尖入针，剪开右心耳先用生理盐水灌注直到从心耳流出来的水清亮了再改用固定液（一般是4%多聚甲醛）灌注至小鼠四肢僵硬小鼠只需要用注射器就行了，我做的25～35g的小鼠一般用50mLNS+30mL多聚甲醛。
具体步骤：常规麻醉小鼠，将其固定，用剪刀剪开胸部皮肤，暴露出皮下组织，剪开时注意钝性分离，以免误伤。
然后用镊子提起剑突，用剪刀剪开胸腔，剪断两侧肋骨，暴露整个胸腔，小心误伤肺及心脏、大血管。
用镊子撕开心包膜，暴露心脏，用眼科剪剪开右心耳，然后提起心尖将准备好的生理盐水注射器插入左心室，注射，注射时小心针头滑脱。
生理盐水灌流至肺和肝的颜色都变成灰白色即可。
然后用多聚甲醛灌流，针孔最好是同一个，多聚灌流时小鼠四肢会抽搐，待抽搐结束，小鼠僵硬即可。
取下小鼠，用剪刀在颈部离断头颅，用剪刀在小鼠头颅中间皮肤剪一刀，将两边皮肤向下翻用手捏住，暴露整个颅骨，用眼科剪从脊髓端插入椎孔，沿着颅正中线剪开颅骨，注意剪刀向上翘一些，以免误伤脑组织，剪开后用弯眼科镊分离颅骨，小心分离，直至暴露整个大脑，然后用弯镊伸入颅底离断颅底神经，就可以取出整个脑子了。
放多聚里固定24h后包埋切片即可。
具体操作如下：实验操作步骤：1)小鼠称重，以每克小鼠0.0025ml 4%戊巴比妥钠剂量的实施腹腔麻醉。
也可以用10%的水合氯醛，3-5ul/g腹腔注射麻醉。
2)将麻醉的小鼠仰放在操作台上，去毛。
3)解剖小鼠，暴露心脏。
4)找到心尖部，左手用镊子提起心尖部，右手或左手将灌流针刺破心尖部进针约0.5cm（最好是用小点的针头，用止血钳固定针尖，剪开右心耳。
5)将灌流器的导管部开口放到生理盐水中里，打开灌流器灌流，直到从右心耳流出的液体为无色，同时小鼠肝脏色淡，肠管肿胀为止，停止灌流。
没有灌流器的用注射器或者吊瓶都可以。
6)将灌流器的导管小心的移至4%多聚甲醛或2.5%戊二醛中，注意不要产生气泡，开始灌流。
此时如果看到小鼠四肢突然紧张，尾部卷曲，说明达到固定效果。
7)灌流大约5分钟，灌流液用量约150毫升左右结束。
（小鼠的用量没这么多）8）取材。
取实验所需的标本。
9）将取出的材料放到事先准备的多聚甲醛（戊二醛）中固定2——4小时后移至30%蔗糖中4度冰箱保存过夜。
我们实验室鼠脑冰冻切片采用4%的多聚甲醛固定，小鼠直接灌注saline20ml，4%多聚甲醛20ml经左心室固定然后取材在4度4%多聚甲醛后固定4-6h，浸20%-30%糖沉底，就可以切片，切片首先需要冰冻切片机，我们的leica1900的，不知道lz那里有没有这个机子，还有一种原始的自己刷冻台的那种，比较麻烦，切片厚度大概选择20-40um差不多开胸时要把肋骨提起，大U字剪开左右肋弓后掀起，血管钳固定一下（以免挡遮视野）；平头针插入后稍许打开输液器开关并迅速剪开充盈的右心耳（可见血涌出），用血管钳将心室和平头针一起钳夹固定再推（但滴速也不能太快以免血管被冲破，使灌流液流进肺里）。
另：开胸时动作尽量要快；针头可以不插入主动脉，留置于左室也行。
试剂名称：4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠所需药品及剂量：A液：多聚甲醛40g蒸馏水400mlB液：Na2HPO4·2H2O 6.88g蒸馏水300mlC液：NaOH 3.86g蒸馏水200m操作过程：A液最好在500ml的三角烧瓶中配制，至多聚甲醛完全溶解后冷却待用。
注意，在溶解多聚甲醛时，要尽量避免吸入气体或溅入眼内。
B液和C液配制好后，将B液倒入C 液中，混合后再加入A液，以1n NaOH或1N HCl 将pH调至7.2～7.4，最后，补充蒸馏水至1000ml充分混合应用范围：光镜和电镜免疫细胞化学研究，用于免疫电镜时，最好加入少量新鲜配制的戊二醛保存期限及温度：4℃冰箱保存备用，长期保存我在很多方面是个新手，经常在园子里逛，学到了很多东西，但同时也看到了关于同一个问题有很多不同的回答，我想结合自己的实验，希望各位老师能就我提出的问题说说自己的经验看法，给我启示，因为很多自己未做过，怕自己哪里操作不恰当而影响实验结果，非常感谢各位老师的不啻赐教！首先，我做的是大鼠（体重约230-250g），模型是大脑中动脉栓塞，在不同的时间点取脑标本，准备做荧光实时定量PCR、Western blot和冰冻切片，我提的问题主要是在于脑标本的取和存方面。
问题如下：荧光实时定量PCR方面：1、标本需要灌注么，有战友说不需要，你是怎么做的，有灌注的话什么溶液灌注，温度？2、标本取下后液氮速冻，然后转-80度冰箱，这样保存一般可以多久？3、抽提后的中RNA放-80度冰箱会很容易降解么，还是说要放液氮？Western blot方面：4、标本用什么溶液灌注，温度？5、同一个标本可以同时用于RT-PCR和Western blot检测么？（如果灌注手段一样的话）冰冻切片方面：6、灌注冲血用什么溶液，温度？7、4%多聚甲醛灌注固定一般灌注多常时间？多少毫升？8、4%多聚甲醛后固定时间是多久为宜？9、蔗糖梯度脱水，蔗糖是用什么配置的，PBS还是PB，浓度是多大的？蔗糖梯度是15%到20%再30%么？在每种浓度里沉底后就换另一种还是？10、我试做过一次，做法为：常规多聚甲醛灌注固定后，再多聚甲醛后固定过夜，然后30%的蔗糖脱水，这些都是用0.1M的PBS配的，结果发现蔗糖脱水3天了都还没沉底（中间换过一次蔗糖溶液）。
有战友提议可以切几块后脱水效果会更好，如果你有跟我做一样的模型标本，你是怎么处理的，如何切？11、还有什么需要注意的地方或tips。
灌注冲血用什么溶液，温度？用的是含有肝素钠的生理盐水。
每瓶500ml的生理盐水加入80mg的肝素钠，肝素钠要避光保存，而且必须使用前临时加入到生理盐水中。
肝素钠生理盐水需要用4度预冷。
我们用注射器推，大概推100ml，10min。
就可以将血液冲干净。
速度要自己掌握。
每支肝素钠每亳升含12500U，相当于100mg，用20ml生理盐水稀释，分装成40支，消毒备用（4℃贮存）。
临用时，注射器吸取肝素钠溶液一支，而后将肝素液来回抽动，使针筒局部湿润，多余肝素液全部排出弃之，注射器内死腔残留的肝素液即可抗凝。
纯的肝素10 mg能抗凝100 ml血液（按1mg等于100个国际单位，10个国际单位能抗凝1ml血液计）。
如果肝素的纯度不高，或过期，所用的剂量应增大2～3倍。
用于试管内抗凝时，一般可配成1%肝素生理盐水溶液，取0.1ml加入试管内，加热80℃烘干，每管能使5～10 ml血液不凝固。
作全身抗凝时，一般剂量为：大鼠2.5～3 mg·(200～300g体重)-1,兔或猫10 mg·kg-1,狗5～10 mg·kg-1。
如果肝素的纯度不高，或过期，所用的剂量应增大2～3倍。
7、4%多聚甲醛灌注固定一般灌注多常时间？多少毫升？一般多聚甲醛灌注20min，100ml。
标准是动物的尾巴会甩动，全身四肢收缩（这是因为蛋白变性所致），一般看起来像动物活过来了一样。
随后就可以将动物的头断掉，来取脑了。
8、4%多聚甲醛后固定时间是多久为宜？这个不一定。
对于石蜡切片，可以固定很久。
但是对于冰冻切片，估计是隔夜或者24h。
但是先固定一晚上后再取出来，将不需要的大脑组织切掉，比如脑干、小脑等等。
擦干，放在蔗糖溶液里。
9、蔗糖梯度脱水，蔗糖是用什么配置的，PBS还是PB，浓度是多大的？蔗糖梯度是15%到20%再30%么？在每种浓度里沉底后就换另一种还是？蔗糖用0.1M的PB配置。
我一般配20%和30%两个浓度。
我个人感觉每个浓度需要沉糖48h。
至少我发现24h是不够的。
沉糖必须完全沉底。
10、我试做过一次，做法为：常规多聚甲醛灌注固定后，再多聚甲醛后固定过夜，然后30%的蔗糖脱水，这些都是用0.1M的PBS配的，结果发现蔗糖脱水3天了都还没沉底（中间换过一次蔗糖溶液）。
有战友提议可以切几块后脱水效果会更好，如果你有跟我做一样的模型标本，你是怎么处理的，如何切？我不知道你是看哪个部位的表达。
如果是海马的话，我建议从前囟-1.40mm到前囟-6.30mm 左右。
确实提的问题很多，看样子还是有所思考，值得赞扬，我也只能说出我个人的经验，讲几个大概的原则，具体细节还要你自己在实验中体会。
RT-PCE与WB都是分子生物学方面的实验，可以共用一个标本，一般不需要灌注，文献上都如此，需要新鲜的脑组织，液氮速冻，-80度保存，半年应该没问题，既然是MCA栓塞，那就要取MCA供血区域，嗅极后3-9mm，如果要分半暗带，园子里有类似的帖子，可查找。
至于不灌注，存留的血液可能会影响结果，我一般断头后用生理盐水把血液冲洗干净，然后再敲开露骨取脑，这样，效果会好些。
至于你的脑组织灌注固定，蔗糖脱水3天还没沉底，可能与脑组织太大及梯度脱水有关，我一般在脱水前用双面刀片沿冠状面将多余的脑组织休掉，20%蔗糖1天，30%蔗糖2天，总共3天就足够了，希望对你有帮助。
你在断头后用生理盐水把血液冲洗干净，然后再敲开露骨取脑，我想没通过灌注应该没办法冲掉脑内血管的血吧？我现在取RT-PCR和WB的标本的做法是：用临床上用的静脉留置针（相对会比较粗些，而且质软不会刺破血管）插到升主动脉快速灌注冰PBS 50ml左右（一般1分钟内灌完），然后快速取脑放入液氮速冻，尽量缩短时间，不知这种做法是否尚可？（个人觉得灌注后的脑标本相对未灌注的会好取些，视野感觉也更好，不会血淋淋的）至于冰冻切片标本的灌注固定已经是按照你和甲醛版主的方法去做了，期待会有好的结果。
我也说两句冰冻切片，灌注用生理盐水还是PBS这个问题不是主要问题，主要作用在于你能否冲干净血管内的血液，而且一般观点认为灌注液最好在10分钟之内冲完（原因可能在于缺血后脑细胞在10分钟后会大量死亡），而且灌注液最好不要用冰冻的（原因有时候冰冻的液体也会使老鼠抽搐，造成你的判断失误）冲洗液的速度越快越好，量要适当控制，过量的话细胞会肿大，一般我们以肝脏变白为标准，如果还不放心的话，再稍微延长点时间，但是最好不要超过10分钟。