关于小鼠脑冰冻切片
各种组织冰冻切片、取材,染色等具体操作方法(连载一 脑、肠、眼球)
各种组织冰冻切片、取材，染色等具体操作方法(连载一脑、肠、眼球）1.做脑组织的冰冻切片在前期的处理过程中很重要，因为脑组织非常软。
不但要做前固定，最好是做全身灌注固定后，如果不做全身灌注固定，很难取出一个完整的大脑组织。
再段头取脑置4度4％多聚甲醛（或西奈山环保组织固定液）中后固定24小时，然后依次置入剃度PB蔗糖溶液脱水，剃度可以设为15%，20%，30%分别过夜沉底即可。
设剃度脱水是为了避免组织块冰晶的产生。
冰晶在组织片上表现为圆形或椭圆行的空洞，影响实验结果。
在做切片时可以做简单的HE染色即可分辨出是否有冰晶。
防止冰晶的另一实验注意点是在做切片前的包埋过程，要求速冻，一般放-20度下15分钟即可，温度高如室温或者4度是达不到速洞效果的，温度太低如放在液氮罐中又导致组织块的碎裂。
而且产生冰晶。
2.如果想要作出满意的漂亮的实验结果，特别是免疫双标共聚焦，那就要求更高，实验的每一步都要很严格，不是我说法夸张，是因为做共聚焦要避免自发荧光的问题，而实验的每一步都可能产生自发荧光，比如4％多聚甲醛灌注液，PB蔗糖等都可以产生让我们头痛的自发荧光问题，根据我的实验经验，国产的多聚甲醛作实验很容易产生自发荧光，难以避免，不过据我导师讲，他在国外做共聚焦不存在这些问题，所以我个人认为你不妨先做单标试试看，能避免自发荧光，那最大的难题就解决了。
西奈山环保组织固定液可以降低自发荧光背景。
3.是否做漂片还是贴片的问题，脑组织两种方法都可以，唯独共聚焦例外，做共聚焦要求片子一般为30-50um，厚片才能达到三维重建的效果。
一般的贴片文献上提到的是20-30um用漂片，此法要求抗体用量较大，最好买国外原装的浓缩液。
不过我做的脑片切过4um的做一般的普通免疫荧光可以。
楼上的几位同仁说得不错。
就我们实验室的操作方法以及个人的体会说上几点：1.如果灌注固定较好的话，完全可以省去后固定这个步骤。
神经组织常规的固定液为4%的多聚甲醛，如果在其中再加入0.25-0.5%的戊二醛增加其固定时的交联作用，那么固定的效果就会更好些，脑或脊髓标本就会更硬些；我们一般用1000ml多聚甲醛固定至少2小时。
小鼠组织冰冻包埋
实验结果：
将包埋的组织分组分盒存放于-80℃深冻冰箱。
注意事项：
1、用OCT胶包埋组织时要均匀，不要留有气泡；
2、包埋时去额叶半脑按照“冠状切面额极朝上放置并、包埋”，一侧的小脑脑干按照“时装切面，中线面朝上放置、包埋”心肺肝肾等组织按照“水平切面，横截面较小侧向前放置、包埋”；
3、“沉糖”的时间不宜过长。
冰பைடு நூலகம்包埋
实验目的：
将小鼠大脑、前脑、小脑脑干、心脏及肺组织进行冰冻包埋。
实验器材：
液氮、锡箔纸、冰冻切片包埋剂OCT、镊子。
实验步骤：
1、取材当天把所需要包埋的组织放入4%多聚甲醛过夜；
2、将包埋筐放入15%蔗糖溶液过夜（4℃存放），再将包埋筐放入30%蔗糖溶液过夜（4℃存放）；
3、“沉糖”完成后，可进行冰冻包埋；
4、将包埋组织放于托盘中（托盘用锡箔纸包裹）；
5、将托盘放入液氮中，浸没组织，持续3-5s后捞出，如此重复3-4次左右，待脑组织从半透明变为白色即可（组织浸没与液氮的时间不能过长，避免组织碎裂）；
6、组织经液氮速冻后立即用锡箔纸包裹（标注实验编号），放入-80℃；
7、切片之前30min将组织从-80℃冰箱中取出，放入-20℃冰箱中解冻；
脑组织冰冻切片漂片法与石蜡切片贴片法的免疫组化效果比较
脑组织冰冻切片漂片法与石蜡切片贴片法的免疫组化效果比较钟琴;张燕翔;钱锋;杨波;任伯绪【摘要】目的：：比较脑组织冰冻切片与石蜡切片免疫组化的效果。
方法：健康雄性昆明小鼠20只，腹腔注射匹罗卡品诱导癫痫持续状态模型。
24h后成功模型小鼠脑灌注固定，断头取脑，随机分别取8只行冰冻切片40μm (A组)与石蜡切片4μm (B组)，采用羊抗鼠 DCX (1：200)抗体，以 SABC 法进行免疫组化染色。
结果：A组阳性神经元数目与B组比较差异有统计学意义(P<0.05)，且 A组镜下视野切片染色更加清晰，对比良好。
结论：脑组织切片免疫组化染色采用冰冻切片漂片法效果更为可靠。
【期刊名称】《长江大学学报（自然版）理工卷》【年(卷),期】2015(000)036【总页数】3页(P95-97)【关键词】冰冻切片;石蜡切片;免疫组化;癫痫【作者】钟琴;张燕翔;钱锋;杨波;任伯绪【作者单位】长江大学医学院，湖北荆州 434023;长江大学医学院，湖北荆州434023;长江大学医学院，湖北荆州 434023;长江大学医学院，湖北荆州434023;长江大学医学院，湖北荆州 434023【正文语种】中文【中图分类】R361随着神经科学的不断发展，脑组织免疫组化技术越来越多地应用于神经学研究。
由于脑组织本身具有柔软、含水量大等特点，其石蜡切片的免疫组化染色结果易出现切片染色不清楚、脱片、假阳性、假阴性等问题[1]，很难得到高质量的脑组织免疫组化切片。
本实验采用癫痫持续状态模型(status epilepticus, SE)，用免疫组化的方法检测海马齿状回下区编码微管相关蛋白(DCX)阳性神经元的表达，对比脑组织冰冻切片漂片法与石蜡切片贴片法免疫组化的效果，以期更好的开展实验研究工作。
1.1 对象健康雄性昆明小鼠20只，体质量(30±5)g，由湖北省实验动物研究中心提供；东莨菪碱、匹罗卡品由Sigma公司提供；免疫组化ABC试剂盒、DCX羊抗鼠一抗、驴血清、驴抗羊二抗由Santa cruze公司提供。
免疫组化-小鼠脑切片protocol(改正)
免疫组化实验材料：需要进行观察的脑片存放位置：一抗、二抗、DAPI放在冰箱一层;山羊血清放于冰箱二层。
所用试剂：10%山羊血清；PBST（PBS+%Triton）；一抗（1:1000）；二抗（1:500）；PBS（配制方法：将一个1L的烧杯洗净晾干，称量8g NaCl， KCl, Na2HPO4, KH2PO4放至烧杯中，向烧杯中添加800ml ddwater，放在磁力搅拌器上搅拌，调PH至，后定容至1L）；DAPI（用PBS配制，1:10000）；抗荧光淬灭封片液仪器或器皿：24孔板（洗净晾干，为了便于后续操作，要将24孔板盖子和板子上画一条横线以防止盖子盖错，在盖子上划线对24孔板按照其作用（如：装有洗一抗用的PBST的孔，则标明PBST（洗一抗用））进行分区）；室温摇床实验步骤：1、封闭：将冷冻切片所得的脑片进行封闭，封闭用1ml山羊血清+9ml PBST，每孔加800微升，将脑片用玻璃钩取出放入24孔板中，放于4℃过夜。
2、封闭完成后，用玻璃钩将脑片取出放于添加了一抗（1:1000，一抗用封闭液配制）（rabbit or mouse or chicken）的24孔板中进行孵育，置于室温摇床，8h（记得计时），之后放于4℃过夜。
（一抗有两种，即单克隆抗体和多克隆抗体。
单克隆抗体特异性较强，但亲和性较弱；多克隆抗体特异性较弱，但亲和性较强）3、用一抗孵育后，将脑片用玻璃钩取出，放于添加了800微升PBST的24孔板中进行洗涤，洗3次，每次15分钟，每次洗涤后都要将脑片重新用玻璃钩取出放于添加了新的PBS的24孔板中，放于室温摇床。
4、之后，将脑片从含PBST的24孔板中取出，放入添加了二抗（1:500，一般用封闭液配）的24孔板中，放在室温摇床上孵育2h，每孔加800微升。
（二抗一般根据一抗来选择，如一抗为鼠源的，二抗就选择抗鼠的；一抗为兔源的，二抗就选择抗兔的）5、二抗孵育后，将脑片用玻璃钩取出，放于装有PBST的24孔板中洗5次，每次洗涤都要将脑片取出放于呈有新的PBST的24孔板中，每次15分钟，放于室温摇床。
病毒注射后小鼠组织器官的固定、切片与荧光观察.doc
小鼠组织器官的固定、切片与荧光观察
病毒注射后小鼠组织器官的固定、切片与荧光观察
带GFP/RFP等荧光蛋白的腺相关病毒（AAV）、腺病毒等注射感染动物后，需要对目标脏器进行固定、冰冻切片以观察荧光。
由于动物的血液细胞往往会影响荧光观察的效果，因此，取材脏器时一般需要对小鼠进行灌流排血，然后进行全身灌流固定。
一、灌流排血与固定
1剪开胸腔，暴露心脏。
2吊瓶里装入遇冷生理盐水，将输液针刺入左心室（心尖处），打开输液阀。
3右心房上剪一小口，使血液和灌洗液可以排出。
4灌入约50ml生理盐水后，观察从右心房流出的液体已经变成无色透明，说明血液已经冲洗干净。
5不要从心脏上拔出输液针，换一个装有预冷过的4%多聚甲醛的吊瓶继续输液。
当多聚甲醛输入体内时，小鼠会剧烈抽搐。
6待抽搐停止后，再持续输5分钟，多聚甲醛即可将小鼠体内各脏器充分固定，牵拉四肢有僵硬感。
此时已经固定完毕，可以取材。
注：现在一般也可用灌流泵通过心脏进行全身灌流
二、包埋与冰切：
直接取固定的小鼠肝脏组织放入4%PFA中后固定过夜，20%蔗糖脱水2天，OCT包埋后，冰切成10um切片，然后用封片液封片后观察。
1。
冰冻切片漂片
免疫荧光操作步骤（漂片，冰冻切片）免疫组化步骤：1.将脑片放到，6孔板（或12孔板），按照二抗说明书，加3%双氧水封闭10min（如果是从切片保护液取出，则要用PBS洗一遍）；（二抗不同，操作步骤有差别），本实验室使用的二抗试剂盒为中杉金桥超敏二步法试剂盒；2.吸去双氧水，PBS洗两遍，将脑片周围的水用吸水纸或卫生纸擦净，注意不要碰到脑片；3.然后按照一抗说明书，将一抗按比例稀释，加入稀释后的一抗，一般，大鼠脑片一张需50微升一抗稀释液，小鼠脑片为30微升；注意不要让液体流到边上；如果流到边上，要重新加或者加大量，使脑片完全浸入液体；4.然后，4℃，过夜（18h或者24h），不建议使用37℃；5.然后，PBS洗净两遍；剩下步骤见二抗试剂盒说明书。
6.DAB配方为：10mgDAB固体加到20ml0.01MPBS，临用时加100-200微升30%双氧水，注意避光。
7.显色10min，看片子染色深浅情况适当调整显色时间。
一般3分钟显色就比较明显，如果20分钟仍未显色，则看下面的参考。
8.然后PBS洗两遍，转移到载玻片，自然晾干。
干燥天气2-3h，潮湿天气3-4h。
9.脱水：70%酒精3min，95%酒精3min，100%酒精3min，100%酒精2min，二甲苯2min，二甲苯3-5min。
如果片子上盐分较多，在70%酒精前在双蒸水1min。
免疫荧光步骤及注意事项：1，将脑片放到6空板的山羊血清封闭液中，封闭20-40min；（如果是从切片保护液取出，则要用PBS洗一遍）2，吸去山羊血清，PBS洗两遍，将脑片周围的水用吸水纸或卫生纸擦净，注意不要碰到脑片；3，然后按照一抗说明书，将一抗按比例稀释，加入PBS稀释后的一抗，一般，大鼠脑片一张需50微升一抗稀释液，小鼠脑片为30微升；注意不要让液体流到边上；如果流到边上，要重新加或者加大量，使脑片完全浸入液体；4，4℃，过夜（18h或者24h），不建议使用37℃，如果荧光亮度不强，可以延长孵育时间到48或72小时；5，然后，PBS洗净两——三遍，按照二抗说明书稀释的荧光二抗，室温孵育2小时。
石蜡切片、冰冻切片及振动切片的区别
石蜡切片、冰冻切片及振动切片的区别一、石蜡切片把修好的蜡块装在旋转切片机上，即可进行切片（sectio n）。
切片必须保持切片刀锐利，切片厚度通常为 5〜7um也可根据染色需要切成不同厚度，一般不旋转式切片机超过10um切好的蜡带，放人40C左右的温水中将蜡片展平。
良好的切片应无刀痕、裂痕，切片厚度均一平整。
切片如有上述问题，在进行免疫组织化学染色时会出现假阳性现象。
为能得到平整无皱褶的组织切片。
可采用两次展片，即先将组织切片漂浮在 30%的乙醇溶液中进行第一次展片，然后将切片捞起，再次放人45〜50C的水浴中进行第二次展片，乙醇的浓度和水温可视组织不同和石蜡熔点的高低自行调整。
此过程是利用乙醇溶液与水之间的张力差展开切片的皱褶。
为防止脱片，载玻片要涂黏片剂。
对HE染色的切片, 可在载玻片上涂抹薄层蛋白甘油，但蛋白甘油因含蛋白易导致非特异性免疫反应，故用于免疫组织化学染色的切片常用多聚赖氨酸、3—氨丙基一乙氧基甲硅烷等处理。
二、冰冻切片冰冻切片（fiozen section）是酶组织化学和免疫组织化学染色中最常用的一种切片方法，其最突出的优点是能够较完好地保存细胞膜表面和细胞内多种酶活性以及抗原的免疫活性，尤其是细胞表面抗原更应采用冰冻切片。
新鲜组织和已固定的组织均可作冰冻切片。
为了得到高质量的冰冻切片，选择好的冰冻切片机和配套的一次性刀架是保证切片质量的关键。
组织在切片前需要冰冻，而冰冻过程容易使组织中的水分形成冰晶，从而影响抗原定位。
一般认为，冰晶体积大而量少时，影响较小；冰晶体积小而量多时，对组织结构损害较大。
含水量较多的组织中较易出现冰晶。
1 •防止组织中冰晶形成的方法（1）速冻：使组织温度骤降，减少冰晶的形成。
方法包括：1）干冰一丙酮（乙醇）法：将150〜200ml丙酮（无水乙醇）装入小保温杯内，逐渐加入干冰，直至饱和呈黏稠状，再加干冰不再冒泡时，温度可达-70 C,用一小烧杯内装异戊烷约50ml，将此烧杯缓慢置人干冰一丙酮（或无水乙醇）饱和液内，至异戊烷温度-70 C时即可使用。
小鼠vta脑区取材方法
小鼠vta脑区取材方法小鼠VTA脑区取材方法简介脑区取材是研究神经科学中至关重要的步骤之一。
而小鼠VTA（腹侧被盖区）是一个具有重要生理功能的脑区，因此其取材方法尤为重要。
本文将详细介绍几种常用的小鼠VTA脑区取材方法。
方法一：冰冻切片法1.准备工具和材料：小鼠脑，乙醇，刀片，冰冻剂（如乙脑）。
2.将小鼠的脑取出并迅速冷冻。
3.利用刀片将冷冻的小鼠脑切片，切得越薄越好。
4.将切片收集起来放入乙醇中浸泡，以去除残留的冰冻剂。
5.制备好的小鼠VTA脑区切片即可用于后续研究。
方法二：脑电图指导法1.准备工具和材料：小鼠，脑电图仪器，电极。
2.将小鼠进行麻醉操作，将电极植入小鼠脑内。
3.进行脑电图记录，根据脑电图上的信号变化找到VTA脑区的位置。
4.通过电极位置引导，取出VTA脑区样本。
方法三：免疫组织化学法1.准备工具和材料：小鼠脑，加权剂，抗体。
2.将小鼠的脑取出并固定在福尔马林中。
3.进行脱水、透明化等处理，以使脑组织适合免疫组织化学操作。
4.制备适当浓度的抗体，对小鼠脑组织进行免疫染色，以标记VTA脑区。
5.根据免疫染色结果，准确取出VTA脑区进行后续实验。
方法四：多色荧光染色法1.准备工具和材料：小鼠脑，荧光染料。
2.将小鼠的脑取出并固定在福尔马林中。
3.进行脱水、透明化等处理，使脑组织适合染色。
4.制备多种荧光染料的混合液，对小鼠脑组织进行染色，以区分VTA脑区。
5.利用荧光显微镜观察染色结果，准确定位并取出VTA脑区。
方法五：遗传学标记法1.准备工具和材料：转基因小鼠。
2.鉴定具有特定遗传学标记的小鼠品系，如tdTomato表达转基因小鼠。
3.麻醉小鼠，取出脑组织。
4.根据遗传学标记的特异性，轻松找到VTA脑区，取出样本。
总结本文介绍了几种常用的小鼠VTA脑区取材方法，包括冰冻切片法、脑电图指导法、免疫组织化学法、多色荧光染色法和遗传学标记法。
选择合适的方法取样，对于研究VTA脑区的生理功能具有重要意义。
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1 冰冻切片先固定还是先切片，是否需要置于室温放置30分钟，针对脑组织具体用什么固定剂和固定步骤比较好？
我们实验室鼠脑冰冻切片采用4%的多聚甲醛固定，小鼠直接灌注saline20ml，4%多聚甲醛20ml 经左心室固定然后取材在4度4%多聚甲醛后固定4-6h，浸20%-30%糖沉底，就可以切片，切片首先需要冰冻切片机，我们的leica1900的，不知道lz那里有没有这个机子，还又一种原始的自己刷冻台的那种，比较麻烦，切片厚度大概选择20-40um差不多
2 有人说石蜡切片的清晰度比冰冻切片更高，是否属实？
由于石蜡切片的厚度在4-6um之间，这是冰冻切片远远达不到的境界，这要根据你的实验选择，神经元的直径一般在10-12um之间，这样冰冻切片如果做双标最好选择免疫荧光。
但是冰冻切片抗原保护的比石蜡好。
3 脑组织的冰冻切片怎么保存最好？
冰冻切片一般现切现做，如果实在要保存就浸泡在0.01mpbs4度保存最多一个星期，尽量切完片子就做。