柯萨奇病毒A组16型研究进展_王一平
2008年柯萨奇病毒A组1 6型昆明分离株
区发生重组。 【关键词】柯萨奇病毒Ａ组１６型；全基因组；序列分析
Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ Ａ１６ ｓｔｒａｉｎ ＫＭＭ０８ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｉｎ Ｋｕｎｍｉｎｇ。Ｃｈｉｎａ ｉｎ ２００８ ｉ垤Ａ Ｓｈａｏ－ｈｕｉ，ＰＡＮ Ｙｕｅ，ＨＥ Ｃｈｕｎ—ｙａｈ，ＣＨＥＮ ｊｕｎ－ｙｉｎｇ，ＳＨＩ Ｈａｉ－ｊｉｎｇ， ＪｓＥ，ⅣＱｉａｎｇ—ｍｉｎｇ．ＬＩ Ｑｉ．ｈａｎ．ｙｕｎｎａｎ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｎ Ｓｅｖｅｒｅ ｌｒｔｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｐｅｋｉｎｇ Ｕｎｉｏｎ
【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】 Ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｍｓ Ａ１６；Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ
ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．０２５４—６４５０．２０１２．０２．０２１ 基金项目：国家重大科技专项（２００８ＺＸｌ０００４—０１４） 作者单位：６５０１１８昆明，中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室 通信作者：李琦涵，Ｅｍａｉｌ：ｑｉｈａｎｌｉ＠２１ｃｎ．ｃｏｍ
柯萨奇病毒A16型的监测报告
比 例法药敏结果 为判 断标 准 , 则变 色液 体培 养基 法 测定 S 、 H、 R、 E 耐药 性与 比例 法测 定结 果的 符合 率分 别 为 100% 、 96. 9% 、 98. 1% 、 97. 5% 。综上所 述 , 变 色液体培 养基快速检 测 M T B 及其耐药性 较之 L J 培养 和比例 法有 以下 优点 : 简 便、 快速、 经 济、 实用 , 不需特殊仪器 , 适用于 基层结核 菌实验 室 的分离培养、 鉴定以及耐药试验和 M IC 测定 [ 4] 。变色液体 培 养基可将药 敏试验 从 L J 培 养基 28d 缩短为 2~ 6d, 且能 快 速检测一些新的药物对分枝杆菌的 M IC, 以治 疗难治性结 核 和非结核分枝杆 菌感 染 [ 5, 6] 。总之 , 使 用变 色液 体培 养基 简 便、 价廉、 快速 , 与 BA CT EC 法 和荧 光 法 [ 7] 相 比 不需 特殊 仪 器 , 在检测痰标本结核菌及耐药 性方面有 较高的敏 感性和 特 异性。 参
收稿日期 2010 07 13 ( 编辑 凌风 )
柯萨奇病毒 A 16 型的监测报告
扈晓晴 摘要 广东省南雄市人民医院检验科 512400 目的 : 对本地区柯萨奇病毒 A16 型 ( Cox A 16) 进行监 测。 方法 : 对 42 例手 足口病患 者的咽拭子、 粪便 采用实
时荧光 RT P CR 检测方法式进行检测。 结果 : 查出 6 例柯萨奇病毒 A 16 型感染。幼儿 园适龄儿童 为 Cox A 16 高危 人群 , 4~ 8 月为发病高峰期 。结论 : 通过对柯萨奇病毒 A 16 型进行监测 , 可实行早发现、 早诊断 , 避免疾病爆发流行。 关键词 柯萨奇病毒 A 16 型 监测 高峰期 幼儿园适龄儿童 中图分类号 : R516 文献标识码 : B 文章编号 : 1001 7585( 2010) 12 1501 02 ( EV 71) 和 A 组 柯萨 奇病毒 ( Co x A ) 、 埃 可病 毒 ( Echo ) 的某 些血清型。近年来柯萨 奇病毒 A 16 型 ( cox sackiev irus A 16, Co x A 16) 引起的手足 口病有增多趋势。因此 , 笔者对就诊我 院的 H FM D 患儿进 行 CO X A 16 的监测。现报告如下。 1 1. 1 材料与方法 标本的采集 随机抽 取 2008 年 7 月 - 2009 年 6 月间
柯萨奇病毒A组16型TaqMan一步法荧光定量RT-PCR快速检测方法的建立
１ 个拷 贝／ ， ０ 与常规 Ｐ Ｒ相 比， Ｃ 敏感性提 高 １０倍 。组 内和组 间重复性 实验的 变异 系数 小于 ２ ０ ％。该检 测方 法
特异性 强， 与肠道病毒 ７ ｌ型、 萨奇病毒 Ｂ组 ５型、 柯 脊髓灰质 炎病毒 、 肠道 病毒 ７ ５型 、 登革热病毒 、 霍乱 弧茵 ０ 、 １
（ 收稿 日期 ：０ １一 ８— ３ 编辑 ： 劲娜 ） ２１ Ｏ ２ 罗
柯 萨奇 病 毒 Ａ组 １ ６型 Ｔ ｑ ｎ一 步 法荧 光定 量 ａＭａ Ｒ Ｔ—Ｐ Ｒ快 速检 测 方 法 的建 立 术 Ｃ
蔡丽娟 ， 陈瑶， 杜红延，陈骊嘉， 李明
南 方 医 科 大 学 生 物技 术 学 院 （ 州 ５０ １ ） 广 １５５
ｗａ ｅ ａ ｌｔ ｎ ｆｒ ｕ ｒｓｃ８ ｌ ｅ ａｉ ｔｍｏ ｒ： ｃｉｉａ ｅｕｔ ｖ ｂａｉ ｏ ｎｅｅ ｔｂｅ ｈ ｐ ｔ ｕ ｕｓ ｏ ｃ ｌ ｃ ｌｒｓ ｌｓ ｎ
ｗ ［ ］ ｏｆ ｒｃＩＥ ｎ Ｊபைடு நூலகம்．Ｃ ｎ Ｐ ｏ Ｅ ＥＥ ｇＭｅ ｉｌ ｏ ， ０ ０， ０ ０ ２ ５ ｄＢｏ Ｓｃ ２ １ ２ １ ： ７ １—
【 摘要】 目的 建立一种快速、 灵敏、 特异和准确的一步法荧光定量 Ｒ Ｐ Ｒ方法用于检测柯萨奇病毒 Ａ Ｔ— Ｃ
组１ ６型 （ ｏｓｃｉ ｉ ｓｓ ６ Ｃ ｘ ｌ ） 方 法 Ｃ ｘａｋ ｖ ｕｅ ， ｏＡ ６ 。 ｅｒ Ａ１ 根 据 Ｇ ｎ ａｋ登 录 的 Ｃ ｘ １ ｅ Ｂｎ ｏＡ ６基 因序 列 ， 用 生 物 学 软 件 进 行 同 应 源性 序 列 比 对后 ， 出 Ｃｘ ６ 高度 保 守 且 特 异 的 核 苷 酸 区域 ｐｌ ｒｔ ｎ基 因 ， 计 特 异 性 引 物 和 Ｔ ｑ ｎ探 针 ； 选 ｏＡ１ ｏ ｐｏ ｉ ｙ ｅ 设 ａ Ｍａ 构 建 重组 质 粒 作 为 阳性 标 准 品 ， 立检 测 Ｃ ｘ ６的 Ｔ ｑ ｎ荧光 定 量 Ｒ Ｐ Ｒ方 法 ， 对该 方 法 的 特 异 性 、 感 建 ｏＡ１ ａＭａ Ｔ— Ｃ 并 敏 性 、 复性 进 行 评 价 。 结 果 成 功 建 立 了 Ｃ ｘ １ 重 ｏＡ ６的 Ｆ Ｑ—Ｐ Ｒ检 测 方 法和 定 量 标 准 曲线 ， 方 法 最 低 检 测 限 为 Ｃ 该
柯萨奇病毒A组16型VP1蛋白的原核表达
柯萨奇病毒A组16型VP1蛋白的原核表达[摘要] 目的构建重组质粒柯萨奇病毒A组16型（coxsackievirus group A type 16，CA16）VP1，并进行原核表达及鉴定。
方法用PCR方法扩增CA16 VP1序列，构建其重组表达质粒pET21b-CA16 VP1，并转入大肠杆菌E. coli BL21（DE3）进行诱导表达及纯化，SDS-PAGE鉴定表达及纯化产物，间接ELISA方法检测重组蛋白CA16 VP1的抗原性和有效性。
结果成功原核表达并纯化了CA16 VP1蛋白，可与小鼠抗CA16病毒血清特异性结合，与太原市老年人群中部分血清存在高反应性。
结论CA16 VP1蛋白获得成功表达，ELISA检测具有良好的抗原性和有效性，为CA16诊断试剂盒的研究奠定基础。
[关键词] 柯萨奇病毒A组16型；VP1蛋白；原核表达；酶联免疫吸附[中图分类号] R373.2；R392-33 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2014）14-0069-04手足口病（Hand foot and mouth disease，HFMD）是一种全球性的传染病，自1957年新西兰首次报道以来[1]，世界各地均有不同程度的流行[2-5]。
近年来，手足口病疫情呈不断上升的趋势，尤其在亚太地区。
2008年，我国将其列为法定丙类传染病进行监测，目前HFMD的发病率和死亡率在丙类传染病中仍居首位。
引起HFMD的肠道病毒有20多种，其中柯萨奇病毒A组16型（coxsackievirus group A type 16，CA16）和EV71最为常见[6]，其他肠道病毒像CA4、CA5、CA9、CA10、CB2和CB5也可以引起[7]。
CA16 基因组全长7410 bp，其中VP1基因长891 bp，编码297个氨基酸残基[8]，CA16 VP1含有许多线性中和表位，VP1基因与肠道病毒血清型完全对应，可作为肠道病毒属内不同血清分类依据，也可作为小RNA病毒科分类依据[9]。
柯萨奇病毒A组16型的研究进展
第37卷第6期2020年12月医学研究与教育Medical Research and EducationVol. 37 No. 6Dec., 2020丨本文引用：马士恒，李明.柯萨奇病毒A组16型的研究进展[J].医学研究与教育，2020,|37(6)：7-13. DOI：10.3969/j.issn.l674-490X.2020.06.002. \柯萨奇病毒A组16型的研究进展马士恒，李明(河北大学附属医院感染性疾病科，河北保定071000)摘要：柯萨奇病毒A组16型（Coxsackievirus A group 16 strain，CA16)感染在中国很常见，CA16在流行过程中不断发生变异，其致病性与肠道病毒71型有明显差异。
CA16可诱导产生多种微小核糖核酸，影响炎性信号通路的传导，导致病理损害的发生。
目前已成功建立了小鼠、树駒、猕猴CA16感染模型，可用于评估抗CA16药物和疫苗效果。
检测方面，多重实时逆转录聚合酶链反应可针对手足口病进行高灵敏度检测和快速分型，胶体金免疫层析法可用于现场的快速诊断。
多种单价、多价的CA16疫苗在动物实验中诱导出有效的免疫。
关键词：柯萨奇病毒A组16型；手足口病；致病性；动物模型DOI：10.3969/j.issn.l674-490X.2020.06.002中图分类号：R512.5 文献标志码：A文章编号：1674-490X(2020)06-0007-07Advances on Coxsackievirus A group 16 strainM A Shiheng,L I M ing(Department of Infectious Diseases,Affiliated Hospital of Hebei University,Baoding071000, China) Abstract：Coxsackievirus A group 16 strain (CA16) infection is very common in China.CA16 constantly mutated in the epidemic process,and its pathogenicity is significantly different from enterovirus 71 (EV71 ).CA16 can induce a variety of microRNAs (miRNAs)and affect the transmission of inflammatory signaling pathways, leading to pathological damage.A t present,CA16 infection models in mice,tree shrews and macaques have been successfully established,which can be used to evaluate the effect of anti CA16 drugs and vaccines.In tenns of detection,multiplex real-time RT-PCR can he used for high-sensitivity detection and rapid typing of HFMD,and colloidal gold immunochromatographic assays can be used for rapid diagnosis.A variety of monovalent and multivalent CA16 vaccines can induce effective immunity in animal experiments.Key words：Coxsackievirus A group16 strain；hand,foot and mouth disease；pathogenicity；animal model柯萨奇病毒 A组 16 型（Coxsackievirus A group 16 strain,CA16)属于微小核糖核酸（microRNA，miRNA)病毒科，人肠道病毒属。
1株人感染柯萨奇病毒A组16型B1b亚型的分离和鉴定
[J]．A n a e r o b e,２０１６,９(２):７８Ｇ８０．[１１]N A G YE．A n a e r o b i c i n f e c t i o n s:u p d a t eo n t r e a t m e n t c o nＧs i d e r a t i o n s[J]．D r u g s,２０１０,７０(７):８４１Ｇ８５８．[１２]B R O O K I．S p e c t r u m a n dt r e a t m e n to fa n a e r o b i ci n f e cＧt i o n s[J]．J I n f e c tC h e m o t h e r,２０１６,２２(１):１Ｇ１３．[１３]MA D S E NIR,J U S T E S E N U S．B a c t e r e m i aw i t hB a c t eＧr o i d e s p y o g e n e sa f t e rac a tb i t e[J]．J C l i n M i c r o b i o l,２０１１,４９(８):３０９２Ｇ３０９３．(收稿日期:２０２０Ｇ０９Ｇ０２㊀修回日期:２０２０Ｇ１２Ｇ２３)个案分析１株人感染柯萨奇病毒A组１６型B１b亚型的分离和鉴定∗杜加亮,刘㊀艳,于晴川,张㊀永,赵荣荣,赵㊀岩,韩㊀菲,刘悦越ә中国食品药品检定研究院,北京１０２６２９㊀㊀关键词:柯萨奇病毒;㊀手足口病;㊀乳鼠;㊀R D细胞D O I:１０．３９６９/j．i s s n．１６７３Ｇ４１３０．２０２１．１０．０２９中图法分类号:R４４６．５文章编号:１６７３Ｇ４１３０(２０２１)１０Ｇ１２７６Ｇ０５文献标志码:C㊀㊀柯萨奇病毒A１６(C VＧA１６)是小R N A病毒科肠道病毒属的成员,是引起婴幼儿手足口病(H F M D)的常见病原体之一[１].C VＧA１６是含有约７．４k b基因组的正义单链R N A病毒,其基因组包含５ᶄ端非翻译区(５ᶄU T R)㊁结构蛋白编码区P１㊁非结构蛋白编码区P２/P３及３ᶄ非翻译区(３ᶄU T R).P１编码４种结构蛋白(V P１㊁V P２㊁V P３㊁V P４),P２和P３分别编码７种非结构蛋白(２A㊁２B㊁２C㊁３A㊁３B㊁３C㊁３D)[２].随着研究的不断深入,在分子流行病学方面,基于V P１基因的完整序列,C VＧA１６可以在系统发育上分为A㊁B㊁C和D４个基因组[３Ｇ６].基因组B可以进一步分为B１~B４这４个基因亚型,其中B１基因亚型还可以细分为B１a~B１d[３,７].在基础研究方面,利用反向遗传学技术构建感染性克隆[８],能够在体外对病毒基因组进行突变㊁缺失㊁嵌合等操作后,获得表型㊁性状发生变化的拯救病毒,为研究其基因的结构与功能㊁病毒复制机制㊁致病机制及筛选候选疫苗提供了崭新的途径.在疾病预防控制方面,单价肠道病毒７１型(E VＧA７１)疫苗无法预防其他病原体引起的H F M D及其他相关疾病,应研发多价H F M D疫苗[９],而E VＧA７１和C VＧA１６交替或共同流行可引发世界多个国家或地区H F M D暴发.本研究从C VＧA１６的分离㊁鉴定㊁系统进化分析㊁检测方法建立和全基因组克隆构建等方面进行了一系列研究,以期为C VＧA１６病毒的分子流行病学和基础研究提供有利的工具.１㊀材料与方法１．１㊀细胞㊀R D细胞为人恶性胚胎横纹肌瘤细胞,为本实验室保存.细胞培养液为含有１％(v/v)LＧ谷氨酰胺(２００mm o l/L)㊁２．５％(v/v)N a H C O３溶液(７．５％)㊁１０％(v/v)胎牛血清和１％(v/v)双抗的G i bＧc oDＧM E M培养液.１．２㊀材料㊀一步法荧光定量P C R试剂盒(R R０６４)和一步法反转录P C R(R TＧP C R)试剂(R R０５７)购自T a K a R a公司,Q I A a m p V i r a lR N A M i n i试剂盒购自Q I A G E N公司.粪便处理液为含有终浓度为５００U/ m L青霉素和５００μg/m L链霉素的磷酸盐缓冲液(P B S).１．３㊀病毒分离㊀粪便标本来源于临床诊断为H F M D 和实验室诊断为C VＧA１６感染的患者.取粪便标本１g加入１０m L粪便处理液中,涡旋混匀３０s,４０００r/m i n离心３０m i n,取上清,除菌过滤后接种于R D细胞.在倒置显微镜下每日观察细胞病变情况,７d后观察若未出现细胞病变,盲传两代,直至出现超过７５％的细胞病变后,将其在 ７０ħ以下冻存.１．４㊀分离毒株的分子生物学鉴定㊀步骤１．３中的冻存液反复冻融３次后,吸取２００μL,按照Q I A a m p V iＧr a lR N A M i n i试剂盒说明书的步骤提取病毒R N A.按照一步法反转录P C R试剂(R R０５７)说明书,利用C VＧA１６特异性引物C AＧV P１ＧF和C AＧV P１ＧR(终浓度均为１０μm o l/L),进行一步法反转录P C R扩增V P１基因(反应条件为９４ħ预变性５m i n;９４ħ变性３０s㊁５０ħ退火３０s㊁７２ħ延伸１m i n㊁３５个循环;７２ħ充分延伸７m i n),探针引物信息见表１.目的条带经１％琼脂糖凝胶电泳鉴定后测序验证,并参照文献与G e n B a n k中的已知基因型和亚型的毒株序列进行比对,利用M e g a软件构建N e i g h b o u rＧj o i n i n g系统进化树.１．５㊀病毒滴度检测㊀将长成致密单层的V e r o细胞６７２１ 国际检验医学杂志２０２１年５月第４２卷第１０期㊀I n t J L a bM e d,M a y２０２１,V o l．４２,N o．１０∗基金项目:国家科技重大专项(２０１８Z X０９７３９Ｇ００２).ә㊀通信作者,EＧm a i l:y y l i u＠n i f d c．o r g．c n.㊀㊀本文引用格式:杜加亮,刘艳,于晴川,等．１株人感染柯萨奇病毒A组１６型B１b亚型的分离和鉴定[J]．国际检验医学杂志,２０２１,４２(１０):１２７６Ｇ１２８０．用０．２５％胰蛋白酶消化,制成浓度为２ˑ１０５/m L 的细胞悬液备用;同时将待测病毒进行１０倍系列稀释,取稀释度为１０－１０~１０－３的病毒液按每孔５０μL 接种细胞,每个稀释度设置８个复孔;然后立即将细胞悬液按每孔５０μL 加入９６孔板;同时设置细胞对照(１００μL 细胞悬液＋１００μL 病毒稀释液),３６ħ培养７d 后观察细胞病变.以能使细胞发生病变的病毒最高稀释度作为终点.在显微镜下观察到细胞病变记为 ＋ ,否则记为 － .按B e h r e n s ＧK Är b e r 公式计算出分离病毒株的病毒滴度(l o g C C I D ５０)＝L d (S ０．５),其中:L＝实验中使用的最低稀释度的l o g值;d ＝稀释梯度的l o g 值;S ＝终判时阳性部分的总和(即出现C P E 的细胞孔所占的比例之和).１．６㊀分离毒株对乳鼠的致病性㊀将增殖后的病毒悬液反复冻融３次,然后在４ħ㊁１２０００r /m i n 条件下离心１０m i n ,取上清液.实验用７d 龄B a l b /c 乳鼠由中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所提供,同时设实验组和对照组,５只/组,实验组注射病毒液２０μL (１００C C I D ５０),对照组注射等量培养液,颅内注射,逐日观察并记录乳鼠发病情况.１．７㊀全基因组克隆构建㊀参照步骤１．４中的方法提取病毒R N A ,利用分片段引物(见表１),扩增全长基因.目的条带经１％琼脂糖凝胶电泳鉴定回收后,与pE A S Y ＧT ３载体连接.转化D H ５α大肠埃希菌感受态后,经过蓝白斑筛选㊁酶切鉴定和测序验证,提交G e n B a n k.根据全长序列酶切位点分析,选择合适的酶切位点将全长序列分两段扩增克隆至p V A X 载体,构建全基因组克隆,酶切鉴定和测序验证.１．８㊀检测方法建立１．８．１㊀R T ＧP C R 方法建立㊀针对V P １设计引物探针,见表１,设计一步法R T ＧP C R .１ˑT a qm a nu n i Ｇv e r s a lm a s t e rm i x Ⅱ２５μL ;C A ＧF (２０μm o l /L )㊁C A ＧR (２０μm o l /L )和C A ＧP (２０μm o l /L )各５μL ,R N A５μL ;反应条件:５０ħ２m i n ;９５ħ１０m i n ;９５ħ１５s ,５５ħ１m i n ;４０个循环.１．８．２㊀质粒参考品制备㊀将V P １编码基因克隆入pE A S Y ＧT ３载体作为质粒参考品.质粒纯度符合要求吸光度(A )２６０/２８０为１．８~２．０)后作为备用参考品原液.质粒拷贝数(c o p y /μL )按照以下公式计算:(６．０２ˑ１０２３)ˑ(质粒浓度n g /μL ˑ１０－９)/(质粒长度b pˑ６６０).本研究中使用稀释至１０６㊁１０５㊁１０４㊁１０３㊁１０２c o p y /μL 的质粒作为参考品.表１㊀㊀探针引物信息名称碱基序列(５ᶄ－３ᶄ)位置长度(b p )作用C V ＧA １６ＧF １T T A A A A C A G C C T G T G G G T T G T １Ｇ２１１４２５全长扩增C V ＧA １６ＧR １G C A C C A A C C T G A C C A G G C T G １４０６Ｇ１４２５１４２５全长扩增C V ＧA １６ＧF ２G C T C A G T T C C A C T A C C T G T A T １２３８Ｇ１２５８１９０５全长扩增C V ＧA １６ＧR ２G A T G C T A A A A G T G C C C A T C A T ３１２２Ｇ３１４２１９０５全长扩增C V ＧA １６ＧF ３A C C C G C C A G C T C A A G T G T C A G２９９４Ｇ３０１４１８３２全长扩增C V ＧA １６ＧR ３C A C C T C T A T A T C G C A G T C C A T４８０５Ｇ４８２５１８３２全长扩增C V ＧA １６ＧF ４A G A G A A A G G A G T G T C T T T C A C ４６９６Ｇ４７１６１４９５全长扩增C V ＧA １６ＧR ４T A G C T G G T T T G C A T A G T G G A G６１７０Ｇ６１９０１４９５全长扩增C V ＧA １６ＧF ５A T T C T A T G A T G T G T T T G A G G G６０２２Ｇ６０４２１３８５全长扩增C V ＧA １６ＧR ５G C T A T T C T G G T T A T A A C A A A T７３８６Ｇ７４０６１３８５全长扩增C V ＧA １６Ｇ１G C G T T T A A A C T T A A A A C A G C C T G T G G G T (P m e I )１Ｇ１８３６３１全基因组克隆构建C V ＧA １６Ｇ３６３１A G C A A G C A T G A G A T G G G A T T G A T A T３６０７Ｇ３６３１３６３１全基因组克隆构建C V ＧA １６Ｇ３５７５T T T G T G G G A G C T A G T G A G T A T T A C C ３５７５Ｇ３５９９３８５７全基因组克隆构建C V ＧA １６Ｇ７４０６G G G C G G C C G C T T T T T T T T T T T T T T T G C ＧT A T T C T G G T T A T A A C A A A (N o t I )７３８７Ｇ７４０６３８５７全基因组克隆构建C A ＧV P １ＧF G G G G A T C C T A T T G C A G A T A T G ２４４１Ｇ２４６１８９１质粒参考品C A ＧV P １ＧR T C C C A A T G T T G T T A T C T T G T C ３３１１Ｇ３３３１８９１质粒参考品C A ＧF T C G C T C C T T G A C T G C G T T G C２４９１Ｇ２５１０１０７检测方法建立C A ＧRC T G T C T C C G C A G C T T G T A G T G C２５７６Ｇ２５９７１０７检测方法建立C A ＧPF AM ＧC A AG T A C T G C C T A C A G C T G C C A A C A C T G ＧT AMA R A２５０９Ｇ２５３７１０７检测方法建立７７２１ 国际检验医学杂志２０２１年５月第４２卷第１０期㊀I n t J L a bM e d ,M a y ２０２１,V o l ．４２,N o ．１０２㊀结㊀㊀果２．１㊀人感染C V ＧA １６分离株的生物学特征㊀成功地从H F M D 患者的粪便标本中分离到１株C V ＧA １６(B J １２０８).该病毒在R D 细胞中培养时可以观察到明显的致细胞病变现象,见图１;在R D 细胞增殖后的病毒滴度为６．８l o g CC I D５０/m L ;以１００C C ID ５０(２０μL )的病毒量在B a l b /c 乳鼠颅内注射后可以观察到典型的后肢瘫痪症状,见图２.㊀㊀注:A 为人感染C V ＧA １６接种R D 细胞;B 为细胞对照.图１㊀㊀人感染C V ＧA １６分离株在R D 细胞上的细胞病变现象(ˑ１０)㊀㊀注:A 为人感染C V ＧA １６感染小鼠;B 为正常小鼠对照.图２㊀㊀B a l b /c 小鼠注射人感染C V ＧA １６分离株后的肢瘫痪症状２．２㊀人感染C V ＧA １６分离株的分子生物学特征㊀分段扩增(图３)测序后拼接获得该病毒的完整基因组序列(G e n B a n k A c c e s s i o n N o ．:J X ５０７８０８),全长７４０６b p ,包括７４５b p 的５ᶄU T R ㊁６５７９b p 的蛋白编码区(编码２１９３个氨基酸)及８２b p 的３ᶄU T R .根据C V ＧA １６V P １序列构建的系统进化树显示,该病毒分离株为B １b 亚型,且与俄罗斯２００７年分离株(K C ８７９５０１)具有最近的亲缘关系,见图４.但是与其他病毒相比,明显不同的是该分离株在V P １编码蛋白中(６８８~６９０b p 处)缺少一个蛋氨酸,见图５.但从其生物学特征来看,该缺失并不影响病毒复制和感染能力.㊀㊀注:M １为D L ２０００D N A 标记物;M ２为１k b l a d d e r ;泳道１Ｇ２㊁３Ｇ６㊁７Ｇ８㊁９Ｇ１３㊁１４Ｇ１８分别是C V ＧA １６F １~F ５５个P C R 扩增片段T A 克隆的酶切鉴定结果.图３㊀㊀C V ＧA １６B J １２０８全基因组分段扩增片段T A克隆的酶切鉴定结果２．３㊀全基因组克隆构建㊀对全基因组进行酶切位点分析,利用一个单酶切位点(E c o R V )及基因组中未含有的两个酶切位点(P m e I 和N o t I ),将基因组分成两个片段依次扩增克隆和连接至载体p V A X １中,构建全基因组克隆p V A X １ＧC A １６.经酶切(P m eI ＋E c o R V )(约３．６和６．９k b 两个片段,见图６)和测序验证了基因组克隆后未发生基因突变.㊀㊀注:һ表示本研究中的病毒分离株B J １２０８.图４㊀㊀进化树分析图５㊀㊀C V ＧA １６B J １２０８V P １编码区核苷酸比较(部分)２．４㊀检测方法㊀由４次重复检测结果可见,质粒标准品的浓度对数与循环阈值(C t 值)在１０２~１０６c o pＧ８７２１ 国际检验医学杂志２０２１年５月第４２卷第１０期㊀I n t J L a bM e d ,M a y ２０２１,V o l ．４２,N o ．１０y /μL 呈现明显的线性相关(Y ＝－１．６０２l n (X )＋３６．８７３,R ２＝０．９９９９),可用作该毒株的定性检测和病毒增殖滴度定量检测.㊀㊀注:１为未酶切质粒对照;２为质粒经P m e I ＋E c o R V 双酶切;M 为D N A 标记物.图６㊀㊀酶切鉴定电泳图３㊀讨㊀㊀论㊀㊀本研究成功从H F M D 患者的粪便标本中分离到１株在体内(B a l b /c 乳鼠)和体外(R D 细胞)均具有典型生物学特征的B １b 亚型C V ＧA １６(B J １２０８)病毒.建立了一套从病毒分离㊁鉴定㊁系统进化分析㊁全基因组扩增和克隆到荧光定量检测方法建立的技术平台,为该类病毒的后续研究提供了参考.虽然C V ＧA ６㊁C V ＧA １０等病原体在亚洲㊁美洲和欧洲逐渐取代E V ＧA ７１和C V ＧA １６成为引起H F M D暴发或流行的主要病原体,但是传统的病原体仍然不能被忽视[１０].C V ＧA １６感染可导致多种疾病,从轻度H F M D ㊁疱疹性咽峡炎㊁上下呼吸道疾病到严重并发症,如脑炎㊁瘫痪㊁脊髓炎㊁脑膜炎,甚至死亡.C V ＧA １６的基因型和基因亚型众多,但是型别与疾病严重程度之间的关系尚不十分明确.C V ＧA １６病毒B １b 亚型在我国多个省份均有报道[１１],并且田晓灵等[１２]发现内蒙古自治区不同临床症状患者中分离出的C V ＧA １６代表株在分子基因型/基因亚型及亲缘进化关系树分布上虽无明显差异,但大部分的重症病例和死亡病例感染病毒都分布在B １b 分支中.本研究中分离到的B １b 亚型C V ＧA １６(B J １２０８)病毒来源于重症患者的粪便标本,这提示在疾病监测过程中应重视收集基因型/亚型与疾病严重程度的关系数据,为疾病的治疗及疫苗毒株的选择提供依据.通常认为,C V ＧA １６的V P １编码区氨基酸序列相对于其他肠道病毒较为保守,且与其抗原性密切相关[１３].因此,这一区域发生的氨基酸特性改变可能对蛋白质空间结构有一定的影响,从而导致毒力的改变[１４Ｇ１７].本研究中的分离株B J １２０８虽然在V P １编码蛋白中(６８８~６９０b p 处)缺少一个蛋氨酸.但从其生物学特征和临床来看,该缺失并不影响病毒复制和感染能力.得益于反向遗传操作技术的成功应用,可以从基因型的改变来研究表型的变化.以往研究多是利用T ７聚合酶系统以线性化的重组质粒为模板进行体外转录反应得到C A １６病毒基因组R N A ,并将C A l ６基因组R N A 转染至适宜细胞获得拯救病毒.而以C MV 为启动子实现病毒拯救的策略可以利用哺乳动物细胞内天然的Ⅱ类R N A 聚合酶来实现转录,在操作上更为简捷[１８],可以用于研究基因突变㊁缺失或插入等改变对病毒性状的影响.pV A X l 是在载体p c D N A ３．１的基础上改建而成的一种新型真核表达载体,是美国食品药品监督管理局(F D A )批准的唯一一个可以用于D N A 疫苗的载体.该质粒含有的强启动子p C MV 和B G H p o l y A 信号可以在哺乳动物细胞中高水平表达重组蛋白[１９].与经典的T ７启动子相比,少了体外转录的步骤.本研究利用p V A X l 作为载体构建了全基因组克隆,下一步工作是在此基础上对全基因组克隆进行改造,如在５ᶄ和３ᶄ端增加核酶来提高剪切精确度等[２０],实现病毒拯救,以期为病毒基因型和表型关系的研究提供更便捷的工具.本研究建立了一个基于C V ＧA １６病毒的分离鉴定体系,以期为复杂多样的H F M D 病原体的相关研究提供更多的参考.参考文献[１]赵云,蔡晶娟,彭程,等．手足口病病毒核酸及抗体检测的比较研究及应用[J ]．国际检验医学杂志,２０２０,４１(１４):１６７８Ｇ１６８１．[２]MA O Q Y ,WA N G Y P ,Y A O X ,e ta l ．C o x s a c k i e v i r u sA １６:e p i d e m i o l o g y ,d i a gn o s i s ,a n dv a c c i n e [J ]．H u m V a c Ｇc i n I mm u n o t h e r ,２０１４,１０(２):３６０Ｇ３６７．[３]P E R E R A D ,Y U S O F M A ,P O D I N Y ,e ta l ．M o l e c u l a rp h y l o g e n y ofm o d e r n c o x s a c k i e v i r u sA １６[J ]．A r c hV i r o l ,２００７,１５２(６):１２０１Ｇ１２０８．[４]C A R R I O N G ,HU AMA NJL ,S I L V A M ,e t a l ．M o l e c u l a re p i d e m i o l o g y ofc o x s a c k i e v i r u s A １６s t r a i n sf r o m f o u r s e n t i n e l s u r v e i l l a n c es i t e si n P e r u [J ]．I n tJI n f e c tD i s ,２０１６,５２:８３Ｇ８５．[５]HA S S E LC ,M I R A N D A ,F A R K A S A ,e t a l ．P h y l o g e o gＧr a p h y o fc o x s a c k i e v i r u s A １６r e v e a l s g l o b a l t r a n s m i s s i o n p a t h w a y s a n d r e c e n t e m e r g e n c e a n ds pr e a do f a r e c o m b i Ｇn a n t g e n o g r o u p [J ]．JV i r o l ,２０１７,９１(１８):e ００６３０Ｇ１７．[６]WA N GJ ,T E N G Z ,C HU W ,e ta l ．T h ee m e r ge n c ea n d s p r e a dof o n eC o x s a c k i e v i r u sA １６G e n og r o u p Dn o v e l r e Ｇc o m b i n a n ts t r a i nth a tc a u s e dac l u s t e ri n g H F M D o u t Ｇb r e a k i nS h a n g h a i ,C h i n a ,２０１６[J ]．E m e r g Mi c r o b e sI n Ｇf e c t ,２０１８,７(１):１３１．９７２１ 国际检验医学杂志２０２１年５月第４２卷第１０期㊀I n t J L a bM e d ,M a y ２０２１,V o l ．４２,N o ．１０[７]Z HA N G Y,WA N G D,Y A N D,e t a l．M o l e c u l a r e v i d e n c e o f p e r s i s t e n te p i d e m i ca n de v o l u t i o no fs u b g e n o t y p eB１c o x s a c k i e v i r u sA１６Ｇa s s o c i a t e dh a n d,f o o t,a n d m o u t hd i sＧe a s e i nC h i n a[J]．JC l i n M i c r o b i o l,２０１０,４８(２):６１９Ｇ６２２．[８]WA N G X,S H E N C,C H E N T,e t a l．I m p r o v e d p l a s m i dＧb a s e d r e c o v e r y o fc o x s a c k i e v i r u s A１６i n f e c t i o u s c l o n e d r i v e nb y h u m a nR N A p o l y m e r a s eI p r o m o t e r[J]．V i r o lS i n,２０１６,３１(４):３３９Ｇ３４１．[９]A S WA T H Y R A JS,A R U N K UMA R G,A L I D J I N O U E K,e t a l．H a n d,f o o ta n d m o u t hd i s e a s e(H F M D):e m e rＧg i n g e p i d e m i o l o g y a n d t h e n e e d f o r a v a c c i n e s t r a t e g y[J]．M e d M i c r o b i o l I mm u n o l,２０１６,２０５(５):３９７Ｇ４０７．[１０]X I EJ,Y A N G X H,HUSQ,e t a l．C oＧc i r c u l a t i o no f c o xＧs a c k i e v i r u s e sAＧ６,AＧ１０,a n d AＧ１６c a u s e sh a n d,f o o t,a n d m o u t hd i s e a s e i n G u a n g z h o uc i t y,C h i n a[J]．B M CI n f e c tD i s,２０２０,２０(１):２７１．[１１]魏雷雷,王岙,吴东林,等．２０１５ 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b o d i e s i nv a c c i n a t e d m i c [J]．F r o n t I m m u n o l,２０１９,１０:１１４５．[２０]魏国超,田文洪,王刚,等．C MV与T７启动子对仙台病毒微小基因组拯救效率的比较[J]．病毒学报,２０１２,２８(３):２３７Ｇ２４５．(收稿日期:２０２０Ｇ０８Ｇ２６㊀修回日期:２０２１Ｇ０１Ｇ０３)(上接第１２７３页)种有效工具,通过长期的横向和纵向比较,可帮助实验室监测质量水平.L I S系统使得实验室收集数据统计质量指标变得简单易行,为实验室质量改进提供了依据和可能,能够客观分析实验室质量风险来源,促进实验室信息化建设持续加强[８].通过对检验报告不正确率的监控可及时发现检验质量的偏离,确保检测工作的质量,尽量在实验室分析前或在检验结果审核中识别出标本错误,结合既往结果及时与临床沟通,避免存在干扰因素.如果在临床反馈结果不符时调查分析出的标本错误,应及时汇总,必要时保存相关临床联系/咨询/投诉三联表或不良事件/不合格工作二联表,请医务处和护理部等部门协助解决,在工作实践中不断探索,寻找有效的持续改进方法,提高质量.参考文献[１]中国合格评定国家认可委员会．医学实验室质量和能力认可准则:C N A SＧC L０２[S]．北京:中国合格评定国家认可委员会,２０１２．[２]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会．临床检验专业１５项医疗质量控制指标(２０１５版):国卫办医函[２０１５]２５２号[S]．北京:中国标准出版社,２０１５．[３]I n t e r n a t i o n a lF e d e r a t i o no fC l i n i c a lC h e m i s t r y a n dL a b oＧr a t o r y M e d i c i n e(I F C C)W o r k i n g G r o u p o n L a b o r a t o r y E r r o r s a n dP a t i e n t S a f e t y(WGＧL E P S)．I n t e r n a t i o n a l f e dＧe r a t i o n o f c l i n i c a l c h e m i s t r y a n d l a b o r a t o r y m e d i c i n ew o r k i n gg r o u p＂l a b o r a t o r y e r r o r sa n d p a t i e n tS a f e t y＂．MQ I s u p p o r tＧr e v i s i o n１[E B/O L]．(２０１７Ｇ０１Ｇ０１)[２０２０Ｇ０３Ｇ１６]．h t t p://w w w．i f c cＧm q i．c o m/M q i W e b/r e s o u r c e s/d o c/ Q u a l i t y I n d i c a t o r s_S u p p o r t_P r o c e s s e s．P d f．[４]郭翀,刘子杰,宋贵波,等．对１５项临床检验专业质控指标５年统计与分析[J]．中华检验医学杂志,２０１６,３９(１):２９Ｇ３３．[５]黄钰竹,王薇,赵海建,等．临床检验结果解释性注释的研究进展[J]．临床检验杂志,２０１８,３６(１２):９２０Ｇ９２２．[６]张鸿伟,李芜婷,吴菊芬,等．急诊检验不正确报告管理措施的探索[J]．实验与检验医学,２０１９,３７(４):６４９Ｇ６５１．[７]王治国,费阳,王薇,等．理解临床检验质量指标,抓质量从实验室内部做起[J]．中华检验医学杂志,２０１６,３９(１):４Ｇ６．[８]郭野,陈倩,吴卫,等．实验室信息管理系统在检验质量关键指标管理中的应用[J]．中华医学杂志,２０１５,９５(１２):８９８Ｇ９０２．(收稿日期:２０２０Ｇ０９Ｇ１６㊀修回日期:２０２０Ｇ１２Ｇ２９)０８２１ 国际检验医学杂志２０２１年５月第４２卷第１０期㊀I n t J L a bM e d,M a y２０２１,V o l．４２,N o．１０。
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收稿日期：2012-02-14；修回日期：2012-02-28作者简介：王一平（1984－），女，硕士研究生，主要从事疫苗质控和研究评价工作。
通信作者：梁争论，博士，研究员，主要从事肝炎病毒、肠道病毒方面的研究工作。
E-mail：lzlun good·163．com ·综述·柯萨奇病毒A组16型研究进展王一平综述；毛群颖，梁争论审校（卫生部生物技术质量控制重点实验室，中国食品药品检定研究院，北京100050）摘要：柯萨奇病毒A组16型（CA16）是引起手足口病（HFMD）的主要病原体，与肠道病毒71型（EV71）交替或共同流行；特别是近年在西太平洋地区呈现流行强度高、重症和死亡人数多的特点，已成为该地区的重大公共卫生问题。
研发安全有效的疫苗是控制HFMD流行的有效手段。
由于EV71所致疾病在重症和死亡病例中所占比例高，对其疫苗研发得到了广泛关注，全病毒灭活疫苗已进入III期临床，有望即将应用于婴幼儿HFMD的防控。
EV71疫苗的顺利研发随之也增加了对CA16疫苗研发的迫切性。
近年来日本、新加坡以及中国台湾地区逐渐开始关注CA16相关的研究，我国也有多家企业开展CA16疫苗的研发。
本文就CA16的病原学，流行病学，实验室诊断，治疗和预防等方面进行了综述。
关键词：柯萨奇病毒A组16型（CA16）；疫苗中图分类号：R373．2+3文献标志码：A文章编号：1005-5673（2012）03-0062-05Progress in research on Coxsackievirus A16WANG Yi-ping，MAO Qun-ying，LIANG Zheng-lun（Key Laboratory of the Ministry of Health for Research on Quality and Standardization of Biotech Products，National Institute for Food and Drug Control，Beijing，100050，China）Abstract：Coxsackievirus A16（CA16）is one of major pathogens associated with human hand，foot，and mouth diseases （HFMD）．It always circulates alternatively or combanatively with Enterovirus71（EV71）on a global scale and caused many HFMD outbreaks．In particular，in recent years the epidemics of HFMD have appeared high strength，more severe cases and deaths in the Western Pacific region，the diseases have become a major public health problem in this region．The effective way to control the HFMD epidemic is to generate a safe and effective vaccine．Due to high proportion of severe ca-ses and deaths，the development of EV71vaccines have obtained a widespread concern and its inactivated whole-virus vac-cines have entered Phase III clinical trials，which are expected to be used in the prevention and control of HFMD in infants and young children in the near future．The smooth development of the EV71vaccine brings about the urgency of the re-search and development of CA16vaccine．Recently，more and more attention has been paid to CA16-related research in Ja-pan，Singapore and Taiwan area，China，and several Chinese enterprises have carried out the development of CA16vac-cine．In this paper，etiology，epidemiology，laboratory diagnosis，treatment and prevention of CA16are reviewed．Key words：Coxsackievirus A16（CA16）；Vaccine1CA16病原学柯萨奇病毒（Coxsackievirus，CV）属于小RNA 病毒科肠道病毒属，可引起心肌炎、脑炎、肾炎、结膜炎等多种疾病。
1948年，Dolldorf和Sickles在纽约市柯萨奇镇的一次脊髓灰质炎病毒（Poliovirus，PV）流行中，通过乳鼠分离的方法首次成功分离出具有不同血清型的多种柯萨奇病毒，并依据病毒对乳鼠的致病性将它们分为A、B两组。
迄今为止，已有30个血清型（A1-24，B1-6）。
柯萨奇病毒A组16型（Coxsackievirus A16，CA16）是CV的主要成员之一，1951年首次在南非被成功分离［1］。
CA16为20面立体对称球形颗粒，直径为23 30nm，无包膜和突起，由核酸和蛋白质组成。
其核酸是单股正链RNA，全长约为7410个核苷酸，基因组含一个开放读码框架（ORF），编码一个多聚前体蛋白，经蛋白酶切水解为P1、P2和P3三个前体蛋白，P1编码病毒的结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4，组成病毒衣壳，VP1区长891bp，编码297个氨基酸残基，是病毒主要的中和抗原决定簇所在的部位；P2、P3区编码非结构蛋白。
RNA两侧为5'-和3'-非编码区（UTRs），分别含有多肽翻译和RNA合成的起始信号，在3'-非编码区的末端带有一个长度可变的多聚腺苷酸尾巴（poly-A）。
5'-非编码区结构保守，所以常被用作设计PCR引物的区域［2］。
2CA16的致病性CA16是引起手足口病的主要病原体，主要引起5岁以下婴幼儿出现手、足、口部疱疹、咽峡炎等症状，少数患者可出现心肌炎、无菌性脑膜炎等多种并发症。
轻症患者临床症状与EV71引起的HFMD难以区别，需借助实验室诊断方可明确病原体。
急性咽峡炎是CA16的另外一个主要临床症状，在中国香港地区、日本和中国台湾地区的EV71流行中都曾有报道。
其中1998年中国台湾EV71和CA16流行期间急性咽峡炎患者比例较大约10%（6/ 64）［3］。
以往研究多认为CA16只引起轻症患者，但近年来，越来越多报道显示除引起轻症外，CA16感染亦可导致心肌、心包、脑部和肺部等疾病，甚至引发致死性心肌炎、脑干脑炎和肺炎等致死性症状。
重症及死亡病例在美国［4］、日本［5］、中国台湾［6］、中国大陆［7］及法国［8］均有报道。
文献［9－10］报道CA16感染还与多起自发性流产相关。
3CA16的流行病学特征CA16可通过粪-口途径以及密切接触方式迅速传播，易在学龄前儿童中引起暴发和流行。
自1957年首例HFMD在多伦多报道以来［11］，常与EV71交替或共同流行，已造成全球范围内多次大流行［12-16］。
目前研究显示，包括柯萨奇A、柯萨奇B 和埃可病毒等20多种肠道病毒均可引起HFMD，但其中CA16和EV71是导致HFMD的主要病原体。
EV71多与重症患者相关而受到关注。
但CA16分布范围广，发病人数多，常常占HFMD发病的60%以上。
1994年英国最大一次HFMD流行是由CA16引起的，感染人群主要为1 4岁的婴幼儿［17］。
1999－2006年中国台湾地区的HFMD中CA16引起的病例数占首位（2579例），其次为EV71（1760例）［18］。
在新加坡2001－2007年间发生的HFMD 中，有3年（2002，2005和2007年）主要流行株为CA16，1年（2006年）为EV71［19］。
香港2001－2009年的HFMD中，以CA16为主的CA流行约占HFMD 流行总量的80%，是引发HFMD的主要病原体，EV71是引起HFMD流行的第二位病原体［20］。
在中国深圳1999－2004年间HFMD流行中，147个样本中CA16阳性样本数为41例，EV71阳性样本数19例［21］。
由于CA16多以轻症患者为主，往往不需特殊医疗干预就可自行痊愈，因此实际流行数字应较以上调查结果更高。
3．1CA16分子流行病学目前尚无公认的CA16基因分型依据，Li等［21］利用CA16的VP4核苷酸序列差异将CA16分为A、B、C3个分支，并认为亚洲在20世纪90年代前以A 和B2个分支的流行为主，其中B分支为主要流行株；90年代后CA16的基因发生了变化，形成了C 分支，并逐步取代了B分支而成为主要流行株。
有学者利用VP1的基因全序列将CA16分为A、B、C3个基因型，其中又将C基因型分为C1、C2、C33个亚型，并认为在1995－1998年间，CA16由B型向C 型转变，在2002年左右，从C1亚型向C2亚型转变，并在2005－2007年转变为C3亚型［13］。
还有学者使用VP1和VP4对CA16进行了基因的进化分析，发现VP1和VP4的分型结果基本相同，均可将病毒分为A型和B型，其中B型又分为2个分支。
并认为CA16的流行型别与流行时间的关系更为密切，与流行区域关系不大［22］。
由于低保真复制和频繁的重组，CA16具有高突变率的特点［23］。
有研究提出近来在中国流行的CA16病毒为复合的重组病毒，包含多种A型肠道病毒，如CA4，CA16和EV71［24］。
加强CA16病毒全基因组的研究，对其流行病学研究具有重要意义。
3．2CA16血清流行病学CA16虽有多个基因型，但仅有一个血清型。
在2008年以前CA16的血清流行病学几乎属于空白阶段。
近两年，随着对CA16研究的逐渐重视，中国［25-26］、德国［27］等国家逐渐开展了相关研究。