高中生物第4章现代生物技术第14课时蛋白质的提取和分离同步备课教学案北师大版选修

第14课时蛋白质的提取和分离

[学习导航] 1.阅读教材P74～75内容，理解电泳、同工酶和蛋白质组学。2.结合教材P73～75内容，进行乳酸脱氢酶同工酶的提取和电泳分离。3.结合教材P73～75内容，总结在琼脂糖凝胶电泳中影响蛋白质迁移率的因素。

[重难点击] 1.进行乳酸脱氢酶同工酶的提取和电泳分离。2.总结在琼脂糖凝胶电泳中影响蛋白质迁移率的因素。

一、电泳、同工酶和蛋白质组学

带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多，应用非常广泛，它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。

1.电泳

(1)概念：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。

(2)原理

①带电粒子：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH 下，这些基团会带上正电或负电。

②迁移动力与方向：在电场的作用下，带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。

③分离依据：电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。

(3)常用的电泳方法

①琼脂糖凝胶电泳：在电泳缓冲液和凝胶中加入琼脂糖，蛋白质分子的迁移速率主要取决于其所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。

②变性胶电泳：在电泳缓冲液和凝胶中加入十二烷基硫酸钠(SDS)变性剂，蛋白质都变为椭圆

形，SDS带有大量的负电荷，掩盖了不同蛋白质的电荷差异，因此变性胶电泳中影响蛋白质的迁移速率的主要因素是蛋白质分子的大小。

2.同工酶

同工酶是指催化相同的化学反应而酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。乳酸脱氢酶一般含有5种同工酶，其相对分子质量相同，但所带电荷不同。

3.蛋白质组学

蛋白质组学指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的氨基酸组成分析、立体结构研究和蛋白质的人工合成等。由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生、细胞代谢等过程的整体而全面的认识。蛋白质组学的研究不仅能分析生物体内蛋白质的组成，还可以揭示各种蛋白质在生物体内的相互作用与联系。

1.从电荷方面思考，适合电泳法分离的各种分子需具备什么条件？

答案各种分子应带有不同种类和不同量的电荷。

2.变性胶电泳分离蛋白质是否依据蛋白质所带电荷的差异？为什么？

答案否。因为SDS能与蛋白质结合，形成蛋白质－SDS复合物，SDS所带负电荷的量远大于蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质间的电荷差异，使电泳迁移率完全由蛋白质分子的大小决定。

归纳总结琼脂糖凝胶电泳和变性胶电泳的两点区别

(1)分离原理不同

①琼脂糖凝胶电泳依据分子所带电荷的差异和分子大小、形状等。

②变性胶电泳则完全取决于分子大小，而非电荷性质和分子形状。

(2)用途不同

①琼脂糖凝胶电泳广泛应用于核酸的研究中，用于分离大分子核酸。

②变性胶电泳则广泛应用于分离蛋白质和相对分子质量较小的核酸。

1.带电荷的蛋白质在电场中移动的速度主要取决于( )

A.所带的电荷多少

B.蛋白质的分子大小

C.蛋白质的相对分子质量

D.蛋白质的分子大小和所带的电荷多少

答案 D

2.下列说法中，不正确的是( )

A.同工酶催化的化学反应相同，但结构不完全相同

B.同工酶的相对分子质量一定不同

C.蛋白质的多样性决定了其功能的多样性

D.蛋白质组学是21世纪生命科学研究领域新的前沿

答案 B

解析同工酶催化的化学反应相同，但结构不完全相同，乳酸脱氢酶的5种同工酶的相对分子质量是相同的。

特别提醒同工酶存在于生物的同一种属或同一个体的不同组织、甚至同一组织或细胞中。产生同工酶的主要原因是在进化过程中基因发生变异，而其变异程度尚不足以成为一个新酶。

二、乳酸脱氢酶同工酶的提取和分离

下面我们以乳酸脱氢酶同工酶的提取和分离为例，体验蛋白质的提取和分离技术。

1.乳酸脱氢酶同工酶的提取

(1)取5 g新鲜的动物心脏，漂洗干净后剪碎到预冷的玻璃匀浆器中，加入25 mL磷酸提取缓冲液，然后冰浴研磨成匀浆(如图1)。

(2)将匀浆收集到冰浴的离心管中，在4 ℃条件下12 000 rpm离心10 min。吸取上清液，然后在4 ℃条件下保存备用(如图2)。

2.琼脂糖凝胶电泳分离

(1)制备琼脂糖凝胶：用TBE电泳缓冲液配制质量分数为1%的琼脂糖凝胶，加热溶解后混匀，缓慢倒入胶床中，插入适当的梳子，室温冷却至凝胶凝固。拔出梳子，将凝胶放入电泳槽中，然后向电泳槽中加入适量TBE电泳缓冲液(如图3)。

(2)加样：取适量同工酶提取液与等量载样缓冲液(质量分数40%的蔗糖溶液、0.25%溴酚蓝)混匀，然后取20 μL加入样品孔内。

(3)电泳：100 V条件下进行电泳约30 min。

(4)染色：当溴酚蓝指示剂电泳到凝胶底部时切断电源，取出胶板浸入染色液中，37 ℃染色15～30 min，水洗后观察电泳结果。

3.结果分析

由图中电泳结果可以看出：

(1)每个器官形成了5个条带说明乳酸脱氢酶有5种同工酶。

(2)LDH2在心脏中含量最高，在骨骼肌中含量最低，说明不同的器官同一种同工酶的含量不同。

(3)骨骼肌中含量最高的是LDH5，含量最低的是LDH1，说明同一器官不同的同工酶含量不同。

1.提取和分离乳酸脱氢酶同工酶过程中为什么要保持酶的活性？

答案酶作为一类特殊的蛋白质(具有生物催化活性)，在其提取和分离过程中必须保持其生物活性，这样分离出的酶才有可能用来研究其生化性质及相关功能。

2.制备乳酸脱氢酶同工酶提取液的过程中，哪些是为了保持酶活性而采取的措施？

答案①提供必要的缓冲系统，以维持pH的相对稳定，防止破坏其活性；②保持低温环境，如将玻璃匀浆器和离心管预冷，低温离心；③避免引入其他杂质或变性剂，导致酶变性，如对材料进行漂洗。

3.溴酚蓝为什么能作为乳酸脱氢酶同工酶的指示剂？

答案溴酚蓝能和乳酸脱氢酶同工酶发生特定的反应，形成特殊的蓝紫色产物。

归纳总结(1)实验步骤概括：取材→剪碎→漂洗→匀浆→离心→制凝胶→加样→电泳→染色→冲洗→观察。

(2)实验操作要点

①所有提取乳酸脱氢酶同工酶用到的器具最好都提前在冰箱中预冷处理，这样能更好地保持酶的活性。

②蛋白质样品在上样之前，要与等量载体缓冲液混匀。载样缓冲液中的蔗糖可增加蛋白质样品的比重，防止加样时发生“漂样”现象；溴酚蓝作为一种电泳前沿指示剂，判断电泳的进行程度。

③将蛋白质样品加在电泳槽的负极段的加样孔，因为在碱性缓冲液中带负电荷的蛋白质在外

加电场作用下会向正极移动。

3.在乳酸脱氢酶同工酶分离过程中，使用缓冲液的作用是( )

A.维持溶液浓度不变

B.维持溶液酸碱度不变

C.催化蛋白质分离过程顺利完成

D.无实际意义

答案 B

解析分离蛋白质时加入缓冲液，其原因是缓冲液在一定范围内能抵制外界酸和碱对反应溶液pH的影响，保持pH基本不变。

4.下列说法不正确的是( )

A.在酶的提取和分离过程中必须保持其生物活性

B.将心脏研磨成匀浆时要在冰浴下进行，是为了保证酶的活性

C.载样缓冲液中的溴酚蓝是一种酸碱缓冲物质，维持pH稳定

D.电泳结果出现了5个条带，说明乳酸脱氢酶有5种同工酶

答案 C

解析酶提取之后要进行一系列活性条件下的研究，因此在酶的提取和分离过程中必须保持其生物活性，将心脏研磨成匀浆时要在冰浴下进行，就是为了保证酶的活性。载样缓冲液中的溴酚蓝是一种指示剂，指示酶的迁移位置；电泳结果出现了5个条带说明乳酸脱氢酶有5种同工酶。

特别提醒琼脂糖凝胶电泳的优点

(1)琼脂糖含液体量大，近似自由电泳。

(2)琼脂糖作为支持体有均匀、区带整齐、分辨率高、重复性好等优点。

(3)电泳速度快。

(4)区带易染色，样品易回收，有利于制备。

(5)操作简单、快速、灵敏。

1.下列有关同工酶的概念，描述正确的是( )

A.催化相同的化学反应，酶蛋白的分子结构、理化性质不同，电泳行为不同

B.催化不同的化学反应

C.催化不同的化学反应，酶蛋白的分子结构、理化性质相同，电泳行为相同

D.催化相似的化学反应

答案 A

解析同工酶是指催化相同的化学反应而酶蛋白的分子结构、理化性质以及免疫学性质不同的一组酶。

2.乳酸脱氢酶有几种同工酶( )

A.2

B.3

C.4

D.5

答案 D

解析乳酸脱氢酶的同工酶共有5种。

3.下列各项中，除哪项外均为电泳使样品中各分子分离的原因( )

A.分子带电性质的差异

B.分子的大小

C.分子的形状

D.分子的变性温度

答案 D

解析电泳是指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。样品分子的带电性质不同、分子的大小和形状不同都会影响带电粒子在电场中的迁移速度，与分子的变性温度无关，故选D项。

4.科学家发现蝇体内存在一种抗菌活性蛋白。这种蛋白质具有极强的抗菌能力，受到研究者的重视。分离该抗菌蛋白可用电泳法，其原理是根据蛋白质分子的__________、大小及形状不同，在电场中的__________不同而实现的分离。

答案电荷(带电情况) 迁移速度

解析电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。

课时作业

[基础过关]

1.电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷__________的电极移动( )

A.相同

B.相反

C.相对

D.相向

答案 B

解析在一定的pH下，生物大分子中有某些可解离的基团，这些基团会带上正电荷或负电荷，在电场作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。

2.电泳实现样品中各种分子的分离是利用了( )

A.各种分子带电性质的差异

B.分子本身的大小不同

C.分子形状的不同

D.以上都正确

答案 D

解析电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小和形状差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。

3.下列关于同工酶的叙述正确的是( )

A.同工酶是由多个亚基以共价键结合形成的复合物

B.同工酶对同一种底物有不同的专一性

C.同工酶是催化同一种反应，但结构不完全相同的同一种酶的多种形式

D.各种同工酶在电场电泳时，迁移速率相同

答案 C

解析同工酶是指催化相同的化学反应而酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。

4.在进行琼脂糖凝胶电泳前，用什么溶液溶解琼脂糖( )

A.蒸馏水

B.自来水

C.缓冲液

D.蔗糖溶液

答案 C

解析用电泳缓冲液溶解琼脂糖，如TBE，这样就能保证凝胶中的离子浓度与电泳液中的离子浓度相同，在电场中活动一致。

5.各种动物血清内乳酸脱氢酶同工酶的组成是不同的。可以通过比较各种动物乳酸脱氢酶同

工酶差异的大小来判断动物之间亲缘关系的远近。下列各种实验方法中，不能采用的是( )

A.测乳酸脱氢酶同工酶的氨基酸序列

B.测控制乳酸脱氢酶同工酶合成的基因碱基序列

C.用电泳法比较各种动物乳酸脱氢酶同工酶的电泳带

D.检测不同动物的乳酸脱氢酶同工酶的pH

答案 D

解析生物是由共同的原始祖先进化而来的，各种生物之间具有或近或远的亲缘关系，亲缘关系越近，则其对应基因的碱基序列的相似程度就越高，而基因控制蛋白质的合成，故其对应的蛋白质的氨基酸序列相似程度也就越高。因此，可以采用测定基因或蛋白质序列的方法进行判断。若蛋白质的相似程度高，则进行电泳时，电泳带的相似程度也就越高。不同动物的乳酸脱氢酶同工酶组成虽然不相同，但不能说明其pH就一定不相同。

6.下图表示对某蛋白质溶液进行变性胶电泳的结果(类似于纸层析法分离色素)，下列相关叙述不正确的是( )

A.蛋白质上某些基团解离后可使蛋白质带电，电场中带电的蛋白质分子(或多肽)会向着与其所带电荷相反的电极移动

B.蛋白质在变性胶中的迁移速率完全取决于其所带净电荷多少

C.蛋白质在变性胶中的迁移速率基本取决于其相对分子质量大小

D.电泳结果表明溶液中蛋白质可能有两种，但也可能只有一种

答案 B

解析蛋白质的氨基与羧基可发生解离，使其带正电或负电，在电场中发生迁移。变性胶电泳所加的SDS可完全掩盖蛋白质本身所带电荷，故其迁移速率与本身所带电荷无关，而由其分子大小决定。变性胶电泳会使蛋白质水解成肽链，故结果所示可能只有一种蛋白质(有两种肽链)，也可能是两种蛋白质。

7.下图是心脏、骨骼肌和脑中的乳酸脱氢酶同工酶的电泳图谱，据图分析下列说法中不正确的是( )

A.3种器官中都含有5种乳酸脱氢酶同工酶

B.LDH2在心脏中含量最高，在骨骼肌中含量最低

C.骨骼肌中含量最高的是LDH5，含量最低的LDH1

D.不同的器官同一种同工酶的含量不同，同一器官不同的同工酶含量差别不大

答案 D

解析电泳图谱中每个器官形成了5个条带，说明乳酸脱氢酶有5种同工酶。根据条带的宽度可以判断，LDH2在心脏中含量最高，在骨骼肌中含量最低，说明不同的器官同一种同工酶的含量不同。骨骼肌中含量最高的是LDH5，含量最低的是LDH1，说明同一器官不同的同工酶含量不同。

[能力提升]

8.下列说法不正确的是( )

A.在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变

B.缓冲溶液通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成

C.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程

D.透析袋能使大分子自由进出，而将小分子保留在袋内

答案 D

解析透析袋一般是用硝酸纤维素(又叫玻璃纸)制成的。透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。透析可以除去样品中分子量较小的杂质，或用于更换样品的缓冲液。

9.蛋白质的分离与纯化是蛋白质研究的重要技术。下列有关叙述中，不正确的是( )

A.根据蛋白质分子不能透过半透膜的特性，可将样品中各种不同的蛋白质分离

B.根据蛋白质分子所带电荷性质的差异及分子大小等，可利用电泳法分离蛋白质

C.根据蛋白质相对分子质量的大小，可通过凝胶色谱法分离蛋白质

D.根据蛋白质的分子大小、密度不同，可通过离心沉降法分离蛋白质

答案 A

解析蛋白质分子是生物大分子，都不能通过半透膜，因此不能利用半透膜分离蛋白质；蛋白质分子所带电荷性质的差异及分子大小，可以使蛋白质分子在电场中获得不同的迁移速度，因此可以利用电泳法分离蛋白质；蛋白质相对分子质量的大小不同，通过凝胶柱的时间不同，可通过凝胶色谱法分离蛋白质；蛋白质的分子大小、密度不同，具有不同的离心力，可通过离心沉降法分离蛋白质。

10.蛋白质各种特性的差异，可以用来分离不同种类的蛋白质。下列正确的是( )

A.分子的形状、大小和溶解度

B.所带电荷的性质和多少

C.对其他分子的亲和力

D.以上三项都是

答案 D

解析根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质及对其他分子的亲和力等，都可以用来分离不同蛋白质。

11.下列关于电泳的说法，不正确的是( )

A.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程

B.带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动

C.蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少

D.用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的电泳迁移率完全取决于分子的大小

答案 C

解析蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素，SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差异，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。

12.电泳技术是在外电场作用下，利用分子携带的净电荷不同，把待测分子的混合物放在一定的介质(如琼脂糖凝胶)中进行分离和分析的实验技术。利用电泳技术可以分离氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等物质和做亲子鉴定。下列图甲～丁是电泳装置及相应电泳结果。请问答：

(1)利用琼脂糖凝胶电泳分离乳酸脱氢酶同工酶时，需将提取的蛋白质样品加在图甲中的________(填“正极”或“负极”)，理由是________________________________________。电泳过程中分子的迁移率除与本身所带净电荷的多少有关外，你认为还受什么因素的影响？(列出2种)_________________________________ ______________________________。(2)进行乳酸脱氢酶同工酶琼酯糖凝胶电泳时，当图乙中出现__________________________的现象，即可停止电泳。

(3)图丙是把含有21个氨基酸的多肽进行水解，得到的氨基酸混合物进行电泳的结果。故可推知该多肽由______________种氨基酸组成。

(4)图丁是通过提取某小孩和其母亲以及待测定4位男性的DNA，分别由酶处理并扩增后，生成含有若干DNA片段的混合物，然后进行电泳所得到的一组DNA指纹图谱，该小孩真正生物学上的父亲是______________，理由是

________________________________________________________________________。

答案(1)负极在碱性缓冲液中带负电荷的蛋白质在外加电场作用下会向正极移动电泳的电压、被测分子的大小、被测分子的形状、凝胶的种类密度等(2)溴酚蓝指示剂电泳到凝胶底部(3)6 (4)F2C和F2两者的DNA指纹图谱完全相同

解析(1)将蛋白质样品加在电泳槽的负极段的加样孔，因为在碱性缓冲液中带负电荷的蛋白质在外加电场作用下会向正极移动，电泳过程中分子的迁移率除受自身电荷的性质、电荷多少的影响外，还受电泳的电压、被测分子的大小、被测分子的形状、凝胶的种类密度等因素影响。(2)乳酸脱氢酶同工酶提取液加样前，需与载体缓冲液混合，载体缓冲液中含有溴酚蓝指示剂，作为电泳进行程度的指示剂，当溴酚蓝指示剂电泳到凝胶底部意味着电泳结束。(3)图中电泳结果出现6条带，意味着含有6种氨基酸。(4)分析DNA指纹图谱可知，C和F2两者的DNA指纹图谱完全相同。

13.试回答下列“蛋白质的提取和分离实验”的有关问题：

(1)为了提取和分离血红蛋白，首先对红细胞进行洗涤以去除杂质蛋白，洗涤时应使用生理盐水而不使用蒸馏水的原因是__________________________________。

(2)若要去除血清蛋白中的小分子杂质，采用图1装置。透析液是________________，一段时间后，若向烧杯中加入双缩脲试剂，透析袋内溶液是否出现紫色？并说明判断的依据：________________________________________________________________________。

(3)图2、图3分别表示电泳法分离蛋白质和纸层析法分离叶绿体中色素的结果。不同蛋白质得以分离是因为________________________________________________________________；不同色素得以分离是因为__________________________________。条带c呈__________色。答案(1)防止红细胞吸水涨破(2)(磷酸)缓冲液出现紫色。双缩脲试剂可以透过半透膜，与袋内血红蛋白反应，生成紫色物质(3)不同蛋白质所带电荷性质、分子大小和形状不同，导致电泳时迁移速度不同不同色素在层析液中溶解度不同，导致层析时扩散速度不同黄绿

14.某生物兴趣小组在“蛋白质的提取和分离”实验中，准备从猪的血液中初步提取血红蛋白，设计的“血红蛋白提取、分离流程图”如下：

实验准备(配制缓冲液、血细胞悬液)→样品处理(洗涤、破碎、离心等)→

蛋白质粗分离(透析)→纯化、纯度鉴定(凝胶色谱法、电泳等)

请回答下列有关问题：

(1)样品处理中红细胞的洗涤要用__________________反复冲洗、离心。向红细胞悬液中加入一定量的低浓度pH＝7.0的缓冲液并充分搅拌，可以破碎红细胞，破碎细胞的原理是____________________________________________________________________。

(2)血红蛋白粗分离阶段，透析的目的是____________________，若要尽快达到理想的透析效果，可以____________________________________________________(写出一种方法)。(3)电泳利用了待分离样品中各种分子的__________________________等的差异，而产生不同迁移速度，实现各种分子的分离。

(4)一同学通过血红蛋白醋酸纤维薄膜电泳，观察到正常人和镰刀型细胞贫血症患者的血红蛋白电泳结果如图所示。由图可知携带者有____种血红蛋白，从分子遗传学的角度作出的解释是______________________________________________________________________。

答案(1)生理盐水渗透原理(当外界溶液浓度低于动物细胞内液浓度时，细胞吸水涨破)

(2)除去小分子杂质增加缓冲液的量(或及时更换缓冲液)

(3)带电性质以及分子大小、形状

(4)2 携带者具有(控制血红蛋白的)一对等位基因，可以控制合成两种不同的蛋白质

解析(1)洗涤红细胞所用的溶液是生理盐水，根据渗透作用原理，将红细胞置于低渗溶液中，红细胞会吸水涨破，释放出血红蛋白。(2)血红蛋白粗分离阶段，透析的目的是除去样品中的小分子杂质；可通过增加缓冲液的量或及时更换缓冲液等方法缩短透析时间，能尽快达到理想的透析效果。(3)由于各种分子带电性质以及分子大小、形状等的差异，在电泳过程中产生了不同的迁移速度，实现各种分子的分离。(4)根据图示可知，镰刀型细胞贫血症的携带者含有两种血红蛋白，原因是携带者具有(控制血红蛋白的)一对等位基因，分别控制合成两种不同的蛋白质。