实验十 X染色质标本的制作和观察
山东大学遗传试验报告,人类X染色质的制备和观察
山东大学遗传试验报告，人类X染色质的制备和观察X染色质（又称巴氏小体，性染色质小体，X小体）是由雌性哺乳动物体细胞中失活的X染色体在间期细胞核中呈异固缩状态（染色质高度螺旋化），形成直径约1μm，贴近于核膜边缘的染色小体。
巴氏小体在显微镜下为一结构致密的浓染小体，一般靠近核膜处，约1-1.5μm大小。
形状多样有卵圆形，三角形，月牙形，线性等。
正常女性口腔粘膜细胞中约30-50%有一个巴氏小体，男性则低于1-2%。
细胞分裂间期X染色体在细胞核中出现异固缩现象：浓缩、染色深、无活性；在细胞分裂期巴氏小体可形成正常的染色体形态；复制时间比有活性的X染色体稍迟一些。
在个体中，X染色质数目等于一个个体的X染色人体数减1。
1949年，加拿大学者Barr在雌性猫的神经元细胞核中发现一种染色很深的小体，而在雄性猫中则极少出现。
Barr 称这种小体为核仁随体，现在我们通常称为巴氏小体。
1961年，Mary Lyon提出了X染色体失活的假说：1.雌性哺乳动物的两条X染色体中，只有一条X染色体有转录活性，另一条X染色体无转录活性，呈固缩状，形成X染色质。
2.失活发生在胚胎发育早期。
3.失活是随机的。
X染色体的随机失活是性别决定机制为XY的动物为平衡两性之间性染色体上的基因剂量而采取的一种特殊的调控方式（因为Y染色体上的基因数量很少，因此雌性个体必须通过减少X染色体上基因剂量的方式使两性个体间基因剂量取得均衡），即所谓的“剂量补偿”，这也是X染色体失活的意义所在。
人们对X染色体失活的机制、不同物种的剂量补偿方式及机制等问题进行了广泛、深入的讨论。
据研究，X染色体的失活发生胚胎发育早期，在X染色体长臂靠近着丝点的一段序列控制X染色体的失活，称为X染色体失活中心（XIC），将这段序列通过易位方式转移到常染色体，也能引起常染色体的失活。
XIC 中含有一个转录后不翻译的RNA基因：Xist基因(X - inactive - specifictranscript)，它的表达量与X染色体的失活有关。
题目 X染色质小体标本制备与观察
题目 X染色质小体标本制备与观察【实验目的】1．了解X染色质的形成原理及X染色质的检查意义。
2．掌握X染色质标本的制备方法3．能正确鉴别X染色质【实验原理】①正常女性核型为46，XX。
在间期细胞核中紧贴核膜内缘有一个染色较深的椭圆形小体，即X染色质小体，是不具有转录活性并呈异固缩状态的X染色质这是女性细胞中一条X染色体随机Lyon化失活形成的。
这种失活保证了雌雄两性细胞中都只有一条有活性的染色体，使两性X连锁基因产物的量保持在相同水平上。
②失活的X染色质小体一般位于细胞核内边缘，直径一微米左右，形状多样，有微凸形、三角形、圆形、短棒形等③X染色质小体数=X染色体数-1，正常女性1个，细胞检出率>40%，男性<2%④人的性别是由X和Y染色体决定的。
需要对人的性别进行鉴定时，除进行染色体核型分析和临床生殖器官的检查外，还可以通过细胞学方法，如检查期间体细胞（口腔上皮，皮肤，羊水和血细胞等）的核内X染色质。
⑤正常女性间期细胞中，X染色质阳性检出率为20％～70％，大多为30％～50％，高时可达70％以上，男性细胞中则平均低于1％。
可采取口腔粘膜细胞，绒毛细胞，羊水细胞等进行检查【实验主要仪器试剂】1．试剂：45％乙酸，卡宝品红2．器材：显微镜，小吸管，载玻片，盖玻片，解剖针，擦拭纸【实验材料】人体头发毛囊【实验方法步骤】1、快速拔取头发2、2、将含有毛囊的头发置于载玻片上（4或10倍镜检观察）3、3、滴上一滴45%乙酸水解至毛囊极易剥离（用解剖针轻刮即脱落为宜）4、分离毛囊，去除毛干和胶质，滴上一滴卡宝品红（刮毛囊前先将大部分乙酸去除后再轻刮下毛囊）5、染色10分钟后拇指压片法轻压或不压6、镜检（10倍镜找目标，40倍镜观察并拍照），计数7 、镜检l00个细胞，统计含有X染色质细胞所占的百分率。
正常值：男性： 2％以下或没有，女性：40％以上。
【实验结果及讨论】1：拔取头发时，要连根部拔起，小心放至载玻片上，以求拔下的头发含有毛囊且不易破坏可以观察。
染色体标本的制备及组型观察 实验报告
细胞生物学实验报告染色体标本的制备及组型观察1.实验目的：掌握染色体标本制作的基本方法；认识不同生物的染色体的状态，学会做染色体组型图。
2.实验用品：（1）仪器及器材：显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、手术剪、解剖盘、胶头滴管、离心管、离心机、小烧杯、冰箱、酒精灯、小烧杯（1）实验药品：蒸馏水、0.9% NaCl溶液、0.3% KCl溶液，固定液（甲醇：冰醋酸=3:1）、秋水仙素（2）实验材料：小鼠3.实验原理：（1）制作染色体标本的意义：了解染色体的特征（形态、大小、数目）——绘制染色体组型图染色体组型：把真核动物一个体细胞各染色体按长度、形状、着丝粒位置排列成一定顺序。
染色体核型：某一物种特有的一组或一套染色体的形态特征。
（2）染色体组型图的应用①鉴别生物种类：兔44条；小鼠40条；大鼠42条；鸡78条；猫38条；狗78条；马64条②遗传病的诊断和研究：三体综合征（含三条21号染色体）、卵巢退化症（含45条染色体，比正常人缺少一条性染色体）、睾丸退化症（含47条染色体，比正常人多一条X或Y染色体）等因此，我们可以给孕妇抽取羊水检查器胎儿的染色体，做遗传病早期诊断。
（3）染色体标本的制作①观察：由于分裂期中期的染色体染色体凝集程度最高，因而我们应尽量使细胞停留在分裂期中期以便观察。
②细胞：为尽量看到多的染色体，我们应当选取具有旺盛分裂能力的细胞，这样的细胞可以来自:胸腺、骨髓、睾丸、小肠等。
我们在此实验中使用的是小鼠的精巢细胞。
在做人的染色体标本时，我们使用的是血液里的淋巴细胞。
③药物：PHA（植物细胞凝集素）：PHA具有促进细胞凝集和分裂的作用。
PHA可以使血液中的淋巴细胞还原至淋巴母细胞（只存在于骨髓中）秋水仙素：秋水仙素可以破坏微管的组装，纺锤体不能形成，细胞分裂停在中期。
与秋水仙素作用相同的药物还有长春花碱、鬼臼素、苯环己烯等。
可以促进胃管组装的药物有紫杉酚、重水等。
④空气干燥：使细胞与染色体易于分离⑤低渗作用：水进入细胞内，细胞内容空间变大，染色体距离变大，易于分离、展平。
X染色质标本的制备与观察内容步骤西南医科大学
医学细胞生物学与医学遗传学教研室 四川医科大学
实验一
目的与要求
1. 掌握：人类间期细胞核中性染色质的形成 机制。（重点，难点） 2.熟悉：X染色质标本的制作方法；熟悉人类 间期细胞核中性染色质的形态特征和分布。
3.了解： PTC尝味实验方法及这种单基因遗
实验一
表：13种浓度的PTC溶液的配制方法
溶液号 稀释方法 稀释倍数 约含P· T· C· 的浓度 基因
1
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
原液
原液100ml+水100ml 2号液100ml+水100ml 3号液100ml+水100ml 4号液100ml+水100ml 5号液100ml+水100ml 6号液100ml+水100ml 7号液100ml+水100ml 8号液100ml+水100ml 9号液100+ml水100ml 10号液100ml+水100ml 11号液100nl+水100ml 12号液100ml+水100ml 13号液100ml+水100ml
实质：Y染色体长臂远端的异染色质 Y染色质的数目=Y染色体数
实验一
内容步骤
（二）X染色质标本的制备与观察
1、制作过程：
取材（漱口后用牙签刮取口腔黏膜上皮细胞标 本） → 涂片 → 染色（滴1～2滴染液） → 盖片（染色5-8min） → 压片（吸去多余染液） → 镜下观察 2、观察（高倍镜）
实验一
（2）识别X染色质的标准：（高倍镜下） 位置：紧贴核膜内侧缘，轮廓清楚，唯一深染的小体 大小：直径为1-1.5um，即小于核直径的1/10 形态：一般为平凸形，三角形或为卵圆形
X染色质标本-细胞骨架成分-细胞计数
（三）染色
Klinger硫堇染色法 1. 将玻片标本置入1mol/L HCl中， 37℃条件下水解20分钟。 2. 用蒸馏水充分冲洗、晾干。 3. 硫堇染液中染色约15分钟。 4. 蒸馏水冲洗、晾干。
（四）观察 1.先在低倍镜(10倍镜)下观察，可见视 野中有许多单个或成堆的口腔上皮细胞。 选择清楚而分散的细胞，移至视野中央， 再换高倍镜仔细观察。口腔上皮细胞为 多边形的扁平状，细胞中央有一被染成 深兰色的圆形或椭圆形的细胞核。核周 围均质部分为细胞质。细胞的外表为一 很难与细胞质相区别的薄膜即细胞膜。 2. 40倍或油镜下检查100个“可计数细 胞”，并计数具有X染色质的细胞数。
2. 用吸管吸去PBS，用 1% Triton X-100 抽提处理细胞 25分 钟。
3. 用吸管吸去Triton X-100 溶液，用 M 缓冲液轻轻漂洗细胞 3 次，（M 缓冲液有稳定细胞骨架的作用）。
4. 略微晾干后，用 3%戊二醛固定细胞 10 分钟。 5. 用PBS（pH7.2）轻轻漂洗细胞 3 次，吸干。 6. 0.2％考马斯亮蓝 R250 染色 5 分钟。 7. 蒸馏水漂洗细胞数次，去除染液，滤纸吸干标本边缘水分，
三、实验用品
（一）材料 显微镜、乙醇(无水乙醇,95％,70％、50 ％)，甲醇，冰醋酸，硫堇，1mol/L HCl。二甲苯、香柏油、擦镜纸、盖玻 片、载片、15ml刻度离心管、牙签、吸 水纸、小镊子、碘酒、酒精棉球、3％ 醋酸溶液、pH6～6.5缓冲液。
（二）试剂
硫堇染液(工作液)， ①干液(硫堇)：硫堇1g或2g溶于100mL 50%乙醇中，溶解后过滤备用； ②醋酸钠缓冲液：醋酸钠·3H2O 9.7g， 巴比妥钠14.7g，溶于500mL蒸馏水中； ③0.1 mol／L盐酸； 按①：②：③=40：28：32比例配成混 合液，调pH5.7±0.2，即得硫堇工作液。
人类性染色质标本的制备和观察
内容步骤
实验一
（二）X染色质标本的制备与观察
1、制作过程： 取材（漱口后用牙签刮取口腔黏膜上皮细胞标
本） → 涂片 → 染色（滴1～2滴染液） → 盖片（染色5-8min） → 压片（吸去多余染液） → 镜下观察
2、观察（高倍镜）
实验一
1、几对基本概念 2、X染色质形成机制——Lyon假说
实验一
X染色质
实验一
Lyon假说:
（1）正常女性体细胞内仅有1条X染色体有活性，另 一条X染色体在遗传上是失活的，在间期细胞 核中高度螺旋化而呈异固缩的X染色质。
（2）X染色体失活发生在胚胎早期。 （3）X染色体失活的随机性和恒定性。
实质：失活的X染色体 意义：X染色体的剂量补偿 X染色质的数目=X染色体数-1
（2）识别X染色质的标准：（高倍镜下） 位置：紧贴核膜内侧缘，轮廓清楚，唯一深染的小体 大小：直径为1-1.5um，即小于核直径的1/10 形态：一般为平凸形，三角形或为卵圆形
实验一
内容步骤
实验一
（二）X染色质标本的制备与观察
1、制作过程： 取材（漱口后用牙签刮取口腔黏膜上皮细胞标
本） → 涂片 → 染色（滴1～2滴染液） → 盖片（染色5-8min） → 压片（吸去多余染液） → 镜下观察
人类性染色质标本的制备、 分析和PTC尝味实验
实验一
目的与要求
1. 掌握：人类间期细胞核中性染色质的形成 机制。（重点，难点）
2.熟悉：X染色质标本的制作方法；熟悉人类 间期细胞核中性染色质的形态特征和分布。
3.了解： PTC尝味实验方法及这种单基因遗传 性状的遗传规律。
内容步骤
人类X染色质的制备与观察
人类X染色质的制备与观察摘要：人类X染色质（巴氏小体）是由雌性哺乳动物体细胞中失活的X染色体在间期细胞核中呈异固缩状态（染色质高度螺旋化），形成直径约1μm，贴近于核膜边缘的染色小体。
根据X染色体失活与Lyon假说，雌性哺乳动物的两条X染色体中，只有一条X染色体有转录活性，另一条X染色体无转录活性，呈固缩状，形成X染色质。
失活发生在胚胎发育早期，且失活是随机的。
本实验以人口腔颊部粘膜细胞、发根毛囊细胞为材料制备X染色质标本，通过硫瑾染色、压片等方法观察巴氏小体。
本次试验的目的是掌握鉴定人类X染色质的方法，在显微镜下正确识别X染色质，即Barr小体的形态特征及所在部位，了解X染色体失活的有关假说以及为失活X染色体上的基因所控制的遗传性状地特点。
1.引言1.1巴氏小体人类有23对染色体，其中22对为常染色体，另一对为性染色体。
女性为XX，男性为XY。
X与Y染色体有一部分是同源的，在减数分裂时可以相互配对，其余部分则不同源。
Y 染色体含有很少的基因，而X染色体则含有大量的基因。
男性与女性的常染色体数目是一样的，所含有的基因数目也相等；但是女性含有两条X染色体，而男性一条X一条Y，因此女性性染色体所携带的基因剂量远高于男性，然而研究发现女性伴性遗传基因的表达剂量与男性是大体相同的，其原因可以用剂量补偿效应解释。
剂量补偿效应(dosage compensation effect)的定义: 在XY性别决定机制的生物中，使性连锁基因在雌、雄性别中有相等或近乎相等的有效剂量的遗传效应。
也就是说，在雌性和雄性细胞里，由X染色体基因编码产生的酶或其它蛋白质产物在数量上相等或近乎相等。
剂量补偿存在两种情况，雌性哺乳动物一条X染色体异染色质化(失活)，只有一条X 染色体具有活性，使雌雄动物虽然X染色体数目不同但基因产物的剂量是平衡的；另一种是X染色质的转录速率不同，如果蝇雌性细胞中两条X染色体都有活性，但它们的转录速率低于雄性细胞X染色体的转录速率。
X染色质的制作
失活的X染色体在间期细 胞中的表现形式
X染色质检查的临床应用
正常女性间期细胞核 中X染色质阳性率为 10％－30％，而男性 则低于1％。
胎儿早期性别鉴定
性别的快速鉴定
一．实验目的
掌握X染色质标本制作方法。 掌握X染色质的形态、数量、分布特点。 认识X染色质与X染色体之间的数量关系，学 会核性别的判断方法。
人口腔粘膜上皮细胞 X染色质标本观察
油镜观察50个可计数细胞X染色质出现率 正常值：男性，低于1%；女性，高于10%
人口腔粘膜上皮细胞（示X染色质）
X染色质的识别方法
1. 可计数细胞的标准：a:核 较大，轮廓清楚完整，无缺损和 皱褶。b:核质染色清晰,呈细网 状或均匀的细颗粒状，无深染大 颗粒及细菌污染
二．实验用玻片；消毒牙 签；小滴瓶、滴管；天平和量筒；试剂瓶 和擦镜纸 试剂：甲醇、冰醋酸、0.2%甲苯胺蓝染色 液、盐酸、蒸馏水、香柏油、二甲苯 材料:人口腔上皮细胞
三．方法和步骤
人口腔粘膜上皮细胞X染色质标本制备 人口腔粘膜上皮细胞X染色质标本观察
X染色质的形成机制 (Lyon假说-X染色体的剂量补偿效应)
女性：XX 男性：XY
女性细胞内X染色体上基 因表达的产物的量是男性 的两倍吗？
NO
不论细胞内有几条X染色体，只有一条 是具有转录活性的，其余的形成异固缩 的X染色质。X染色质数 = X染色体数－1
X染色质的本质
胚胎发育第16-18天，出现X染色体的失活； 但卵子与精子结合后，其中失活的X染色质 变为常染色质而恢复活性。
人口腔粘膜上皮细胞 X染色质标本制备
涂片：漱口后用牙签从颊部内侧刮取口腔粘膜上皮细胞， 均匀涂在洁净的载玻片上自然晾干 固定：在涂片干燥时用固定液固定10分钟电吹风吹干。 固定液按 甲醇：冰醋酸 = 3:1 的比例配制,现配现用。 分化: 1mol/l盐酸中分化10分钟流水冲洗电吹风吹干 染色： 甲苯胺蓝染液：染色5分钟流水冲洗电吹风吹干 观察:先在低倍镜下找到标本，然后油镜观察。
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实验十X染色质标本的制作和观察
一、实验目的
掌握X染色质标本的制备过程及识别方法。
二、实验用品
器材：显微镜，牙签，载玻片，盖玻片，滴管，吹风机，染色缸
试剂：硫堇，甲醇，冰醋酸，蒸馏水，1N的HCL，香柏油，二甲苯
材料：人口腔粘膜上皮细胞
三、实验原理
1．X染色质是X染色体由常染色质变为异染色质后失活而成。
典型的X染色质位于核膜内侧缘，大小为1~1.5um，形状多为半圆形、三角形、不规则形。
正常女性间期细胞中X染色质的阳性率为10~30%，在男性间期细胞则平均低于1%。
从理论上讲，正常女性的间期细胞中都应该有一个X染色质，但事实上由于染色方法、染色技术以及X染色质在细胞核中的位置不同，实际检查中不可能在每个细胞中都看到。
2．X染色质的本质是兼性异染色质。
在胚胎发育的3~4周，女性胚胎中两条X染色体中的一条随机发生失活变为X染色质；而存在于女性卵子中的X
X染色质示意图X染色质光镜图
四、实验内容与方法
硫堇（thionine）染色法：
1．取材：取口腔粘膜细胞。
漱口3~4次后，用牙签从面颊部内侧粘膜刮取口腔粘膜细胞，将细胞涂于干净载玻片上，用签字笔写下学号，置于空气中自然干燥。
2．固定：
配固定液：按照甲醇：冰醋酸=3：1的比例配制固定液，置于染色缸中。
固定：将载玻片放入固定液中固定，10分钟后取出，用吹风机吹干。
3．分化：干燥后将载玻片放入盛有1NHCL的染色缸中分化10分钟。
4．冲洗：用自来水冲洗玻片，再用蒸馏水冲洗一次。
5．染色：将载玻片放入盛有硫堇的染色缸中静置30分钟。
6．冲洗：自来水冲洗载玻片，冲去多于的染液，用吹风机吹干。
X染色质
核膜
7．镜检：用油镜观察X染色质的形态，并检查50个“可计数细胞”，计数其中具有X 染色质的细胞数。
可计数细胞的标准：a：核较大，轮廓清楚完整，无缺损、皱褶，染色清晰
b：核质染色均匀，呈细网状或均匀颗粒状，无退变的深染大颗粒及细菌污染。
五、实验报告
记录实验步骤，绘图表示实验结果并计数50个可计数细胞，计算X染色质的阳性率。
附：硫堇染液的配制方法
1．饱和硫堇液：硫堇：4克
50%酒精100ml
配成100ml硫堇液，与缓冲液混合前过滤。
2．缓冲液：
醋酸钠 1.94克
巴比妥钠 2.94克
加蒸馏水至100ml（冰箱保存可用数日）
3．硫堇工作液：按下述次序逐一混合
a：饱和硫堇液100ml
b：1/10NHCl 70ml
c：缓冲液60ml
调PH至5.7（此液冰箱保存可用数日）。