凝胶电泳操作步骤
聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤
聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤
聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE）是一种常用的分离和分析蛋白质的方法。
以下是一般
的聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤：
1. 制备凝胶：将聚丙烯酰胺和交联剂（通常是二甲基亚砜）在缓冲液中混合，加热溶解，然后迅速倒入电泳槽或制备模具中，留下一端可以装入电极。
2. 固化凝胶：将凝胶慢慢冷却至室温，使其固化。
这通常需要约30分钟至1小时。
3. 准备样品：将待测样品与一定体积的加载缓冲液混合均匀（可以包含甲基绿或其他荧光染料），并加热处理。
这样做是为了使样品蛋白质裂解、去除二硫键、破坏二级和三级结构，以使所有蛋白质都呈线性链状。
4. 加载样品：用微量移液器向凝胶中的小孔加入已经处理好的样品。
5. 进行电泳：将电泳槽连接至电源并设定合适的电压和电流。
根据待测蛋白质的大小和分子量，可以选择不同的电泳条件（如电压、电流和时间）。
6. 着色和显影：电泳结束后，用染料染色或其他方法可视化蛋白质。
通常使用染料如明胶蓝或银染法来增强蛋白质的显色。
7. 分析和解读：根据电泳图像，分析和解读样品中的蛋白质分离情况，如判断蛋白质的相对分子量、纯度等。
请注意，以上步骤仅为一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤，具体操作可能会根据实验目的和需求有所变化。
同时，操作和设备使用时应遵守实验室安全规定。
pcr产物鉴定方法
PCR产物鉴定方法一、引言PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，可以在体外扩增特定DNA 片段。
在PCR反应结束后，需要对PCR产物进行鉴定，以确认扩增效果和确保实验结果的可靠性。
本文将介绍PCR产物鉴定的方法及其原理。
二、PCR产物鉴定方法PCR产物鉴定主要包括凝胶电泳、测序、实时荧光定量PCR等方法。
下面将详细介绍这些方法的原理和操作步骤。
2.1 凝胶电泳凝胶电泳是一种常用的PCR产物鉴定方法，可以根据DNA片段的大小和电荷差异进行分离和检测。
其操作步骤如下：1.准备凝胶：根据需要检测的DNA片段大小选择合适的琼脂糖凝胶，配制凝胶缓冲液，并加入DNA染料。
2.加载样品：将PCR产物与DNA标记物混合，加入凝胶槽中。
3.进行电泳：连接电源，将凝胶浸入缓冲液中，施加电压进行电泳分离。
4.观察凝胶：使用紫外线照射仪观察凝胶，根据DNA标记物的位置和PCR产物的大小判断扩增效果。
2.2 测序测序是一种直接确定PCR产物序列的方法，可以提供更加详细的信息。
常用的测序方法包括Sanger测序和高通量测序。
以下是Sanger测序的原理和步骤：1.PCR扩增：使用带有引物的DNA模板进行PCR扩增，得到大量目标DNA。
2.准备反应体系：将PCR产物与引物和荧光标记的dNTP混合，加入测序反应体系中。
3.反应进行：使用DNA聚合酶和荧光标记的dNTP进行反应，每个碱基只能加入一次。
4.停止反应：加入终止浓缩缓冲液，停止反应。
5.电泳分离：将反应产物进行电泳分离，根据荧光信号确定序列。
2.3 实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR是一种可以定量检测PCR产物数量的方法。
其原理是通过特定的荧光探针实时监测PCR反应的进程，根据荧光信号的强度来确定PCR产物的数量。
操作步骤如下：1.准备反应体系：将PCR反应所需的引物、荧光探针和模板DNA混合，加入反应管中。
2.进行PCR反应：使用实时荧光PCR仪进行PCR反应，同时监测荧光信号。
凝胶电泳制胶
凝胶电泳制胶凝胶电泳制胶是一种常用的实验方法，用于分离和检测DNA、RNA或蛋白质等生物分子。
本文将介绍凝胶电泳制胶的原理、步骤和应用。
一、原理凝胶电泳制胶主要基于凝胶的特性。
凝胶是一种高分子物质，可以形成三维网络结构，使分子在其内部进行分离。
常用的凝胶材料有聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶和琼脂糖-聚丙烯酰胺复合凝胶等。
在凝胶电泳制胶过程中，首先将凝胶原液均匀地注入制胶模具中，然后在模具两侧固定导电板，使之与电源相连。
接着，待凝胶完全凝固后，取下模具，即得到凝胶板。
二、步骤凝胶电泳制胶的步骤如下：1. 准备制胶模具：选择适当的模具尺寸和形状，常见的有平板模和斜板模。
清洗模具并涂抹硅油，以便取出凝胶。
2. 制备凝胶原液：根据实验需求选择适当的凝胶材料，如聚丙烯酰胺凝胶。
根据所需凝胶浓度，称取凝胶原液和缓冲液，混合均匀。
3. 注入凝胶原液：将凝胶原液缓慢均匀地注入制胶模具中，注意不要产生气泡。
4. 固化凝胶：待凝胶原液完全凝固后，取下制胶模具。
可将凝胶板浸泡在缓冲液中，以去除残留的离子。
5. 凝胶电泳操作：将待测样品加入凝胶槽中的样品孔，接通电源进行电泳。
根据需要选择合适的电压和时间。
6. 凝胶染色和观察：电泳结束后，可以通过染色方法对分离的分子进行染色，如乙溴化乙锭染色。
然后使用透射式或反射式凝胶电泳成像仪观察和记录结果。
三、应用凝胶电泳制胶广泛应用于生物学、分子生物学、遗传学等领域，常见的应用有：1. DNA分离和检测：凝胶电泳制胶可用于分离不同长度的DNA片段，并通过染色或探针杂交等方法检测目标DNA。
2. RNA分析：通过凝胶电泳制胶，可以分离和检测不同长度的RNA 分子，用于研究基因表达和调控等方面。
3. 蛋白质分离和鉴定：凝胶电泳制胶可用于分离和检测不同大小和电荷的蛋白质，常用于蛋白质组学研究和蛋白质鉴定。
4. 分子标记和DNA测序：凝胶电泳制胶可用于分离和检测DNA分子标记，如DNA大小标记和DNA测序。
琼脂糖凝胶电泳步骤
琼脂糖凝胶电泳一、步骤：1、制胶(1%)：将加入30ml 1×TAE缓冲液和0.6g琼脂糖的三角瓶在微波炉加热至沸腾，摇匀至无颗粒。
2、倒胶：先插梳子，再倒胶。
胶冷却至60℃左右(不烫手)加染料后（胶-GelRed:1ml-1ul或30ml胶+3ulGelRed）缓缓倒入电泳槽(先胶布封口，放好梳子)，待胶凝固后取出梳子。
3、加样：1µl RNA + 2µl loading buffer混匀。
（点样孔置负极端即黑对黑，红对红）。
4、电泳：稳压条件下120V电泳，待溴酚蓝移动至接近胶前沿(约1cm)时停止电泳(约25min)。
5、观察结果：紫外分析仪上254nm观察，DNA存在处显亮绿色荧光条带，观察酶切后与未酶切质粒的DNA带位置，拍照。
二、注意事项：1、凝胶制备过程中，溶解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。
倒入板中的凝胶应避免出现气泡，影响电泳结果。
2、巨大的DNA链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。
高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。
3、电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。
4、如果电泳时电压和温度过高，可能导致出现条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。
特别是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象。
5、变性的DNA样品可能导致条带模糊和缺失，也可能出现不规则的DNA条带迁移。
在上样前不要对DNA样品加热，用20mM NaCl缓冲液稀释可以防止DNA变性。
6、太多的DNA上样量可能导致DNA带型模糊，而太小的DNA上样量则导致带信号弱甚至缺失。
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤
下面是sds聚丙烯酰胺凝胶电泳的步骤：
1.准备凝胶溶液：将丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺混合，加入去离
子水并搅拌直至溶解。
加入TEMED（四甲基乙二胺）和过硫酸铵，混合均匀。
2.制作玻璃板：清洗两个玻璃板，加入适量凝胶溶液，用玻璃板
夹夹住，形成模具。
等待凝胶聚合。
3.准备电泳缓冲液：混合Tris 和甘氨酸，调整pH值。
4.准备样品：将蛋白质样品与loading buffer混合，煮沸3-5
分钟。
5.上样：将样品加入凝胶顶部，用移液枪或者吸管将样品加入凝
胶的梳子底部。
6.电泳：接通电源，调节电压和电流，进行电泳。
7.转膜：将凝胶和膜一起放入电转仪中，加入Tris甘氨酸电泳
缓冲液，接通电源，进行转膜。
8.染色：将膜放入染色液中染色，用保鲜膜将染色液表面覆盖，
轻轻摇动，直至膜完全染色。
9.洗脱：将膜从染色液中取出，用去离子水洗脱。
10.分析结果：观察膜的条带，进行数据分析。
以上是基本的聚丙烯酰胺凝胶电泳的步骤。
需要注意的是，实验操作中需要注意安全，避免对身体有害的试剂。
聚丙烯酰胺凝胶电泳操作步骤
聚丙烯酰胺凝胶电泳操作步骤聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离和分析方法。
以下是其操作步骤：1. 准备试剂聚丙烯酰胺凝胶电泳所需试剂包括：丙烯酰胺、N，N'-甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、TEMED、甘氨酸、尿素、溴酚蓝等。
其中，丙烯酰胺和N，N'-甲叉双丙烯酰胺是聚合反应的主要原料，过硫酸铵和TEMED是聚合反应的催化剂和加速剂，甘氨酸和尿素可以增加凝胶的强度和稳定性，溴酚蓝则可以作为指示剂。
2. 制备凝胶首先将丙烯酰胺和N，N'-甲叉双丙烯酰胺按照一定比例混合，加入适量的去离子水溶解，然后加入过硫酸铵和TEMED，混合均匀后倒入聚四氟乙烯模具中。
接着将模具放入电泳槽中，加入电极缓冲液，连接电源开始电泳。
3. 加样在电泳过程中，当凝胶完全聚合后，将电极缓冲液排出，取下凝胶。
用刀片将凝胶切割成所需大小的小块，放入电泳槽中。
然后加入适量的样品溶液，用微量进样器将样品加入到凝胶孔中。
4. 开始电泳加完样后，重新连接电源，设置电泳参数（如电压、电流和时间等），开始电泳。
在电泳过程中要随时注意电泳进度，观察是否有异常情况发生（如条带跑偏、条带模糊等）。
5. 终止电泳当电泳完成后，断开电源，将凝胶取出。
用刀片将凝胶切割成所需大小的小块，放入缓冲液中浸泡一段时间，以终止电泳反应。
6. 染色将终止电泳后的凝胶进行染色。
常用的染色方法有银染法和考马斯亮蓝染色法等。
银染法是用硝酸银溶液将蛋白质固定在凝胶上，然后进行显色；考马斯亮蓝染色法是用考马斯亮蓝染料将蛋白质染色后用乙醇进行脱色。
7. 脱色经过染色后的凝胶可以进行脱色处理。
常用的脱色方法有乙醇脱色法和醋酸铵脱色法等。
乙醇脱色法是用无水乙醇多次冲洗凝胶以去除未结合的染料；醋酸铵脱色法是用醋酸铵溶液浸泡凝胶以去除未结合的染料。
8. 观察和拍照最后观察并拍照记录电泳结果。
银染法可以通过观察颜色深浅判断蛋白质分子量大小；考马斯亮蓝染色法则可以通过观察条带的亮度判断蛋白质含量高低。
琼脂糖凝胶电泳的关键操作
琼脂糖凝胶电泳的关键操作
琼脂糖凝胶电泳是一种常用的生物分子分离和分析方法，其关键操作包括以下几个步骤：
1. 制备琼脂糖凝胶：将适量的琼脂糖粉末加入缓冲溶液中，充分溶解后通过加热使其完全溶解，然后倒入凝胶模具中，等待凝胶固化。
2. 样品准备与加载：将待测样品与一定量的负载缓冲溶液混合均匀，然后用微量移液管将混合液滴加到已经形成的琼脂糖凝胶槽中，确保不产生气泡。
3. 进行电泳：将琼脂糖凝胶槽放入电泳槽中，加入适量的电泳缓冲液，确保液位高过琼脂糖凝胶，然后连接电源，设定适当的电场强度和时间，进行电泳。
4. 染色与可视化：电泳结束后，将琼脂糖凝胶取出，用染色剂进行染色，例如利用乙溴蓝染色DNA，然后用透明胶纸或透明薄膜包裹琼脂糖凝胶，用紫外光透射或背光观察结果。
5. 结果分析：根据琼脂糖凝胶电泳结果，通过与已知标准品比较或使用图像分析软件，对待测样品中的生物分子进行定性和定量分析。
DNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和操作步骤
一、实验目的琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法，学习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术，掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法.二、实验原理琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法,这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。
DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。
在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。
DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。
不同构型的DNA分子的迁移速度不同。
如环形DNA分子样品，其中有三种构型的分子：共价闭合环状的超螺旋分子（cccDNA）、开环分子（ocDNA)、和线形DNA分子（IDNA）.这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为：cccDNA＞IDNA＞ocDNA核酸分子是两性解离分子，pH3。
5是碱基上的氨基解离，而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离，所以分子带正电，在电场中向负极泳动；而pH8。
0-8。
3时，碱基几乎不解离,而磷酸基团解离，所以核酸分子带负电，在电场中向正极泳动.不同的核酸分子的电荷密度大致相同,因此对泳动速度影响不大.在中性或碱性时，单链DNA与等长的双链DNA的泳动率大致相同。
影响核酸分子泳动率的因素主要是：1、样品的物理性状即分子的大小、电荷数、颗粒形状和空间构型。
一般而言，电荷密度愈大，泳动率越大。
但是不同核酸分子的电荷密度大致相同，所以对泳动率的影响不明显。
对线形分子来说，分子量的常用对数与泳动率成反比,用此标准样品电泳并测定其泳动率,然后进行DNA分子长度（bp）的负对数——泳动距离作标准曲线图,可以用于测定未知分子的长度大小。
DNA分子的空间构型对泳动率的影响很大，比如质粒分子,泳动率的大小顺序为：cDNA＞I DNA＞ocDNA但是由于琼脂糖浓度、电场强度、离子强度和溴化乙锭等的影响,会出现相反的情况.2、支持物介质核酸电泳通常使用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两种介质,琼脂糖是一种聚合链线性分子.含有不同浓度的琼脂糖的凝胶构成的分子筛的网孔大小不同，是于分离不同浓度范围的核酸分子。
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琼脂糖凝胶电泳
（一）材料
（二）试剂
1、1*TAE
2、EB溶液：100mL水中加入1g溴化乙啶，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，分装，室温避光保存。
3、DNA加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，50%甘油（w/v）。
4、RNA甲醛变性胶上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，1mM EDTA(PH8.0)，50%甘油（w/v），用DEPC水配制，高压灭菌备用。
常使用，深黄色应弃用。
波炉中将琼脂糖融化均匀。
在加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液；加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。
胶槽底面保持1mm左右的间隙，待胶溶液冷却至50℃左右时，加入最终浓度
溶液浸泡染色15分钟)，摇匀，轻轻倒入电泳制胶板上，除掉气泡；待凝胶冷
缓冲液液面刚高出琼脂糖凝胶面；
3．加样：点样板或薄膜上混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X。
用10 μL微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。
（注意：加样前要先记下加样的顺序和点样量）。
4．电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm。
当琼脂糖浓度低于0.5%，电泳温度不能太高。
样品由
围降低。
当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳。
5．观察和拍照：电泳完毕，取出凝胶。
在波长为254nm的紫外灯下观察染色
条带。
于凝胶成像系统中拍照并保存之。
（二）在含有甲醛的凝胶上进行的RNA电泳（选做）
配制23 mL甲醛电泳胶：0.336g琼脂糖溶于20mL DEPC水中，冷却至60?C，加入5mL的5x甲醛变性胶电泳缓冲液和5.5mL的甲醛，在通风橱内倒胶，冷
却30分钟后使用。
甲醛变性胶RNA样品的制备：1μL RNA，5?甲醛变性胶电泳缓冲液0.5μL，甲
的EB。
步骤：
4．小心地进行点样，记录样品次序与点样量；然后开始电泳，电压为3-4V/cm。
步骤
1.称量琼脂糖，转入耐热广口瓶内，加TAE用微波炉熔化。
2.用胶布封住电泳槽两端，插入梳子，平放于水平台上。
3.凝胶冷却到50°C-60°C（手能触摸的温度）后倒入电泳槽。
4.凝胶凝固后撕下胶布，直接（带上梳子）转移到电泳槽中。
5.加电泳缓冲液至充分没过凝胶。
拔梳子时应谨慎。
6.阴极（黑色）一般位于右侧，阳极（红色）一般位于左侧。
7.DNA样品中加入点样缓冲液，混合均匀。
然后小心加入到凝胶孔中。
DNA
样品；6*点样缓冲液=5:1
8.恒压电泳（6cm*9cm、0.7%凝胶用80-100V电泳1h。
溴酚蓝迁移到33%-66%
时停止电泳）。
9.浸泡于溴化乙锭溶液中。
10.电泳完毕后，将胶浸入到EB溶液中10-30min。
11.在紫外发光仪上铺上保鲜膜，放入凝胶，打开紫外灯开关，观察。
12.拍照。
【注意事项与提示】
（1）EB是强诱变剂并有中等毒性，易挥发，配制和使用时都应戴手套，并且
不要把EB洒到桌面或地面上。
凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。
简单处理方法为：加入大量的水进行稀释（达到0.5mg/mL
以下），然后加入0.2倍体积新鲜配制的5%次磷酸（由50%次磷酸配制而成）和0.12倍体积新鲜配制的0.5mol/L 的亚硝酸钠，混匀，放置1天后，加入过
量的1mol/L碳酸氢钠。
如此处理后的EB的诱变活性可降至原来的1/200左右。
（2）由于EB会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使DNA迁移率降低。
因此，如果要准确地测定DNA的分子量，应该采用跑完电泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色的方法。
（3）总RNA的分析：哺乳动物的RNA由28S rRNA、18S rRNA和mRNA以及其它小分子RNA组成，28S和18S rRNA处为明显的亮带（相当于4.5kb和1.9kb），28S/18S应为1.5-2.5/1；植物、昆虫、酵母和两栖动物的RNA带分布较小，约为0.5-3.0kb左右；假如28S/18S小于1/1，或者出现拖带，说明RNA已经有。