凝胶电泳操作步骤

琼脂糖凝胶电泳

（一）材料

（二）试剂

1、1*TAE

2、EB溶液：100mL水中加入1g溴化乙啶，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，分装，室温避光保存。

3、DNA加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，50%甘油（w/v）。

4、RNA甲醛变性胶上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，1mM EDTA(PH8.0)，50%甘油（w/v），用DEPC水配制，高压灭菌备用。

常使用，深黄色应弃用。

波炉中将琼脂糖融化均匀。在加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液；加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。

胶槽底面保持1mm左右的间隙，待胶溶液冷却至50℃左右时，加入最终浓度

溶液浸泡染色15分钟)，摇匀，轻轻倒入电泳制胶板上，除掉气泡；待凝胶冷

缓冲液液面刚高出琼脂糖凝胶面；

3．加样：点样板或薄膜上混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X。用10 μL微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。（注意：加样前要先记下加样的顺序和点样量）。

4．电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm。当琼脂糖浓度低于0.5%，电泳温度不能太高。样品由

围降低。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳。

5．观察和拍照：电泳完毕，取出凝胶。在波长为254nm的紫外灯下观察染色

条带。于凝胶成像系统中拍照并保存之。

（二）在含有甲醛的凝胶上进行的RNA电泳（选做）

配制23 mL甲醛电泳胶：0.336g琼脂糖溶于20mL DEPC水中，冷却至60?C，加入5mL的5x甲醛变性胶电泳缓冲液和5.5mL的甲醛，在通风橱内倒胶，冷

却30分钟后使用。

甲醛变性胶RNA样品的制备：1μL RNA，5?甲醛变性胶电泳缓冲液0.5μL，甲

的EB。

步骤：

4．小心地进行点样，记录样品次序与点样量；然后开始电泳，电压为3-4V/cm。

步骤

1.称量琼脂糖，转入耐热广口瓶内，加TAE用微波炉熔化。

2.用胶布封住电泳槽两端，插入梳子，平放于水平台上。

3.凝胶冷却到50°C-60°C（手能触摸的温度）后倒入电泳槽。

4.凝胶凝固后撕下胶布，直接（带上梳子）转移到电泳槽中。

5.加电泳缓冲液至充分没过凝胶。拔梳子时应谨慎。

6.阴极（黑色）一般位于右侧，阳极（红色）一般位于左侧。

7.DNA样品中加入点样缓冲液，混合均匀。然后小心加入到凝胶孔中。DNA

样品；6*点样缓冲液=5:1

8.恒压电泳（6cm*9cm、0.7%凝胶用80-100V电泳1h。溴酚蓝迁移到33%-66%

时停止电泳）。

9.浸泡于溴化乙锭溶液中。

10.电泳完毕后，将胶浸入到EB溶液中10-30min。

11.在紫外发光仪上铺上保鲜膜，放入凝胶，打开紫外灯开关，观察。

12.拍照。

【注意事项与提示】

（1）EB是强诱变剂并有中等毒性，易挥发，配制和使用时都应戴手套，并且

不要把EB洒到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。简单处理方法为：加入大量的水进行稀释（达到0.5mg/mL

以下），然后加入0.2倍体积新鲜配制的5%次磷酸（由50%次磷酸配制而成）和0.12倍体积新鲜配制的0.5mol/L 的亚硝酸钠，混匀，放置1天后，加入过

量的1mol/L碳酸氢钠。如此处理后的EB的诱变活性可降至原来的1/200左右。（2）由于EB会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使DNA迁移率降低。因此，如果要准确地测定DNA的分子量，应该采用跑完电泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色的方法。

（3）总RNA的分析：哺乳动物的RNA由28S rRNA、18S rRNA和mRNA以及其它小分子RNA组成，28S和18S rRNA处为明显的亮带（相当于4.5kb和1.9kb），28S/18S应为1.5-2.5/1；植物、昆虫、酵母和两栖动物的RNA带分布较小，约为0.5-3.0kb左右；假如28S/18S小于1/1，或者出现拖带，说明RNA已经有