棉花转基因技术研究

收稿日期:2008201215基金项目:国家“863”计划现代农业技术领域重大项目资助(编号2006AA10A211)。

作者简介:魏艳丽,(1978-)女,助理研究员,从事农业微生物研究。

3为通讯作者,E 2mail :yanght @文章编号:100224026(2008)0320038204棉花转基因技术研究魏艳丽1,黄玉杰1,李红梅1,孙红星1,2,杨合同1,23(1.山东省科学院中日友好生物技术研究中心,山东省应用微生物重点实验室,山东济南250014;2.山东理工大学,山东淄博255049)摘要:棉花是一种重要的经济作物,在我国广泛种植。

培育转基因棉花被看作是解决产量和生态环境问题最根本和最有效的方式。

本文介绍了转基因棉花主要的研究方法,包括转化方法以及转入的基因等,并对转基因棉花的发展趋势作了相关探索。

关键词:转基因;棉花;遗传转化;Bt中图分类号:S562.032 文献标识码:AA Survey of Cotton Transgene TechnologyWEI Y an 2li 1,H UANG Y u 2jie 1,LI H ong 2mei 1,S UN H ong 2xing 1,2,Y ANG He 2tong 1,23(1.Biotechnology Research Center ,Shandong Academy o f Sciences ;K ey Laboratory o fApplied Microbiology o f Shandong Province ,Jinan 250014,China ;2.School o f Life Sciences ,Shandong Univer sity o f Technology ,Zibo 255049,China )Abstract :C otton is one of im portant industrial crops ,and is widely planted in China.The cultivation oftransgenic cotton is considered the m ost efficient way of increasing yield and res olving environmentalproblems.We introduced three dominant approaches in the development of genetic cotton and s ome usefultarget genes ,and forecast its probable future w ork.K ey w ords :transgene ;cotton ;genetic trans formation ;Bt1　引言棉花是一种以利用纤维为主的农作物。

据估计,棉花每年创造的产值有1800～2000亿美元,全世界有18亿人口以种植棉花为生[1]。

棉花同时又是一种非常容易感染病虫害的农作物,我国棉花每年因虫害造成的产量损失约为10%～15%,而每年用于棉花防治的杀虫剂的剂量约占杀虫剂使用总量的2Π3[2]。

随着生物技术特别是基因工程技术的成熟,人们认识到利用转基因技术改造棉花,是提高棉花产量以及解决环境问题的根本途径。

1979年Price 和Smith 报道通过克劳茨基棉细胞悬浮培养得到胚状体[3],1986年,美国Agracetus 公司的第21卷　第3期2008年6月山东科学SH ANDONG SCIE NCE V ol.21　N o.3Jun.2008Umbeck 通过农杆菌介导法,在世界上首次成功的将Bt 基因导入了棉花,通过检测证明,该转基因棉花能抗鳞翅目幼虫,并能通过种子遗传[4]。

我国早在1991年就已有将外源Bt 基因导入棉株中的报道。

1992年我国首次人工合成了拥有自己知识产权的Cry I A 杀虫基因,并于1993年采用农杆菌介导法和外源基因胚珠直接注射法成功导入中棉所12、泗棉3号等主栽品种中,获得了高抗棉铃虫的转基因棉花株系[2]。

我国是目前世界上继美国之后拥有自主知识产权并研制成功转基因抗虫棉的第二个国家。

到2005年我国已有26个转基因抗虫棉品种通过国家审定,转基因抗虫棉种植面积超过我国棉花种植总面积的2Π3[5]。

2　转基因棉花技术目前,获得转基因棉花的方法主要有农杆菌介导法、基因枪法、花粉管导入法等。

2.1　农杆菌介导法1974年,Z aenen 等[6]从农杆菌中分离到T i 质粒(tum or inducing plasmid ),证明该质粒是农杆菌的肿瘤诱导因子。

农杆菌在侵染植物后,本身并不进入植物,而是将T i 质粒中的一段序列(T 2DNA )通过植物伤口注入到植物细胞中,进而随机整合到基因组中表达并随植物基因一起遗传。

农杆菌介导的植物转化系统是一种高效的外源蛋白转化系统,利用其能有效将长达150kb 的目的DNA 完整地导入植物中,具有转化率高,遗传稳定的优点,因此为大多数实验室所采用。

农杆菌转化的受体主要有愈伤组织、悬浮培养细胞、茎尖分生组织等。

由于棉花的组织培养再生率比较低,目前用于农杆菌侵染受体主要是棉花幼苗的下胚轴。

2004年,S.Leelavathi 等[7]在受到了转基因水稻方法发展的启发后,对农杆菌转化系统进行了改良。

传统的转化方式大都是用农杆菌转化棉花的一小段下胚轴或子叶,然后诱导愈伤组织;而他们则先诱导了愈伤组织,然后用农杆菌直接转化愈伤组织,获得了很好的效果,这种方法比传统方法更可靠、简便,试验周期更短,而且该方法也适用于多元转化。

我国对转基因棉花的研究开始于20世纪80年代。

吴霞等[8]对利用农杆菌介导转化中影响转基因棉花愈伤组织的诸多因素进行了研究,认为棉花的基因型与转化率有重要关系,提出了外植体的切割位置、受体与供体培养时间、菌液浓度等的最佳方案。

李燕娥等[9]对农杆菌介导法作了进一步探讨,建立了一套高效转化体系,使农杆菌介导法更简单化、具体化。

其改进的关键点主要在培养基配方和转基因再生株定植及转基因再生株检测等。

吕素莲等[6]以棉花种子无菌苗裸露的茎尖分生组织为受体,采用农杆菌介导法进行转化,获得了转基因棉花。

这种方法避开了植物组织或细胞培养,缩短了实验周期,但缺点也很明显,转化效率偏低,转化细胞直接分化成植株比较难。

2.2　基因枪法基因枪原理是使DNA 沉淀在微弹(钨粉、金粉)表面,利用火药爆炸、高压放电、或高压气体加速微弹,使其穿透植物细胞壁进入靶细胞,随后释放DNA 分子并随机整合到寄主的基因组内[10]。

郭余龙等[11]以川棉(Gossypium hir sutum )239胚性愈伤组织为受体,用基因枪轰击法导入外源基因,获得了经G US 组织染色和PCR 扩增鉴定的转基因植株。

基因枪法最大的特点就是不受受体基因型影响,但是容易形成多拷贝造成基因沉默或者容易形成嵌合体,且在棉花中的转化率仅为1%左右。

因此,此项技术应用的并不广泛,如何提高转化率是急需解决的问题之一。

2.3　花粉管导入法花粉管通道转基因技术最先是由我国科学家提出的。

由于棉花花器官的特殊构造和农杆菌转化受基因型的限制,国内有些研究机构采用花粉管通道技术培育转基因棉花。

一般利用微注射法、柱头滴加法、花粉匀浆法等导入外源基因。

选用成铃率高部位花,开花前1d 扎线,严格自交,开花后20～48h 对幼铃的子房注射外源DNA 。

注射前,摘去花瓣,抹平花柱,而后用微量加样器沿子房的纵轴方向垂直进针,DNA 用量和浓度因总DNA 或质粒DNA 而不同,总DNA 用量较多,每次注射1～20μL ,质粒DNA 用量较少,每次注射0.1～10μL 。

幼铃采用保铃剂(如NAA 、G A 等)进行保铃,提高转化效率还应考虑温度、湿度、阳光等环境条件93第2期魏艳丽,等:棉花转基因技术研究04山　东　科　学 2008年及操作技巧[12～14]李静等[15]通过对花粉管通道技术进行改进,将含有IPT基因的双元表达载体质粒pBG121导入了不同的陆地棉品种,获得了转基因植物,并且将转化率提高到了传统方法的两倍。

马盾等[16]总结出一套适合于新疆的实用操作方法。

使外源DNA通过花粉管通道导入技术得到了不断提高,据称,注射棉铃未落铃率平均达到25%以上,最高达到56%。

2.4　其他方法获得转基因棉花的方法还有很多,例如PEG介导法、脂质体介导法、超声波介导法、电激法、注射法、浸泡法等。

3　导入的外源基因随着基因工程技术的日趋成熟,已经获得了大量的具有抗虫害作用的转基因棉花。

目前针对棉花的转基因技术主要集中在抗虫、抗病、抗除草剂等有关基因的克隆与转化。

3.1　抗虫基因导致棉花减产的很大原因是由于虫害,目前导入棉花的抗虫基因主要有苏云金芽孢杆菌毒素蛋白基因(Bt)、蛋白酶抑制剂基因、外源凝集素基因等[2]。

转基因抗虫棉起步较早,技术也比较成熟,已经取得了很大的成功。

在我国,转基因抗虫棉的抗虫效果良好,推广面积正在逐年增大。

但是,在转基因抗虫棉被广泛种植的同时,由于选择压力,会使害虫对抗虫毒素产生耐受性,郭三堆[17]提出将不同杀虫机理的蛋白质导入同一受体,被认为能有效解决这一潜在的问题。

3.2　抗病基因棉花黄萎病是由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae K leb)引发的一种病害,严重影响了棉花的产量,在我国其危害日趋严重。

针对这种病害,人们已经分离纯化了几种生防菌进行防治。

李社增等[18]通过田间试验发现以枯草芽孢杆菌作为生防菌能有效的防治棉花黄萎病。

但是目前在防治棉花病害方面研究更多的还是利用转基因的方法,将一些抗病基因导入棉花,培育抗病植株。

几丁质酶和葡聚糖酶能降解病原菌细胞壁的主要成分———几丁质和葡聚糖,导致病原菌细胞破裂,生长受阻,不能继续侵染和为害农作物[19],特别是从生防菌木霉中分离出的几丁质酶CHIT42,被认为是较理想的抗病基因。

1998年,Matteo Lorito[20]将T. har zianum中编码42K D几丁质酶的基因,置于CaMV35S(花椰菜花椰病毒)启动子控制下,在烟草和马铃薯中表达,经检测在植物的叶部、颈部、根部和花部均发现了转基因蛋白,酶活检测表明,几丁质酶基因在转基因烟草和马铃薯中可以活跃表达,而且转基因酶的酶活性、pH值、温度及稳定性同纯化的Trichoderma内切几丁质酶相比,基本一致;对叶部病原菌抗性检测,5%～10%转基因烟草和马铃薯完全抑制Alternaria alternata,转基因烟草对Botrytis cinerea具有耐性,几乎对此病原菌免疫,1Π3马铃薯高抗Alternaria solani(病害减轻达85%),对土传病原菌抗性反应发现,水溶液中烟草幼苗和Rh izoctonia solani混合在一起,存活率达65%～80%。