鸡毒支原体的分离与鉴定

株 ； 从 广 东 省 采 集 １０２ 份 样 本 中 分 离 出 ３３ 株 可 疑 菌 杂菌污染少， 分离率较高。
株 ； 从 四 川 省 采 集 ７３ 份 样 本 中 分 离 出 ２５ 株 可 疑 菌
在固体培养基上进行支原体的纯化， 所选用的
株， 共 ７０ 株。
琼脂必须质量好， 纯度高， 否则菌株很难生长。本次
为 ５０％～８０％， 该病已成为严重威胁养禽业的疾病之 布的密封烛缸中， ３７℃培养 ７～１５ 天后， 置于倒置显微
一［１］。
镜低倍镜（ １０×１０） 下 观 察 菌 落 形 态 ， 用 灭 菌 注 射 器 针
为 了 解 鸡 毒 支 原 体 的 感 染 现 状 ， 我 们 于 ２００４～ 头挑取典型单菌落于 ２ｍＬ 液体培养基中， 进行传代
要表现为咳嗽， 流鼻涕， 呼吸困难。鸡群感染该病可 杂菌污染检查， 确定无杂菌生长时， 将变黄的可疑培
导致蛋 鸡 产 蛋 率 下 降 、弱 雏 率 增 加 、肉 鸡 增 重 减 慢 及 养物在相同的 培 养 基 中 连 续 传 代 ３～５ 代 后 ， 取 培 养
胴体降级等。据报道， 在我国鸡毒支原体阳性感染率 物 ０．２ｍＬ 接 种 支 原 体 固 体 培 养 基 中 ， 放 入 铺 有 湿 纱
２００５ 年对广东、四川及北京等地区进行流行病学调 培养和鉴定。
查， 从 疑 似 鸡 毒 支 原 体 感 染 的 养 殖 场 采 集 样 本 ， 进 行 １．４ 鸡毒支原体的鉴定
了鸡毒支原体的分离及鉴定， 现将结果报道如下。 １．４．１ 检验 Ｌ 型 细 菌 ： 将 分 离 纯 化 的 菌 株 ， 接 种 到 不
责任编辑： 翁亚彪
－ ２２ － 养禽与禽病防治 ２００７ 年第 ８ 期
１．４．４．３ ＰＣＲ 反应： 按文献［４］进行。
眼 鼻 分 泌 物 、气 囊 、气 管 及 肺 组 织 中 分 离 ［５，６］。但 据 我 们
１．４．４．４ 测 序 ： 选 取 标 准 菌 株 ＰＧ３１、编 号 为 Ｔｓ３２ 的 的经验， 从 分 泌 物 中 很 难 分 离 鸡 毒 支 原 体 ， 可 能 与 分
小 、无 色 透 明 、圆 润 、边 缘 光 滑 的 菌 落 。 置 于 低 倍 镜 多。本次试验采用 ＰＣＲ 方法扩增鸡毒支原体种特异
（ １０×１０） 下 观 察 ， 可 见 菌 落 为 无 色 透 明 ， 多 数 呈 典 型 性基 因 ＦＭＧ－ ２ 部 分 序 列 ， 鉴 定 出 ６９ 株 阳 性 菌 株 ， 结
式（ 见图 １） 。
参考文献
［１］ 宁宜宝． 动物支原体病预防与控制的研究进展［Ｊ］．
中国兽医杂志，１９９９，３３（１）： ４５～４８
［２］ 毕 丁 仁 ， 王 桂 枝 编 著．动 物 霉 形 体 及 研 究 方 法［Ｍ］．
北京： 中国农业出版社， １９９８： １１８～１７１
［３］ Ｅｌｍｉｒｏ ＲＮ， Ｒｉｃｈａｒｄ Ｙ， Ｋｅｖｉｎ ＲＨ， ｅｔ ａｌ． Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
２．２ 与细菌 Ｌ 型鉴别结果
试 验 选 用 美 国 Ｄｉｆｃｏ 公 司 生 产 的 琼 脂 粉 制 备 固 体 培
将分离纯化的菌株， 接种到不含青霉素和醋酸 养基， 鸡毒支原体在该培养基上生长良好， 所形成的
铊的 ＦＭ－ ４ 液体培养基中连续传代 １０ 次后， 不回复 菌落大， 有的菌落用肉眼都能观察。
基金项目： 国家自然科学基金资助项目（ ３０２７１０００） １．４．４．２ 模板 ＤＮＡ 的制备： 按水煮沸法提取［４］。
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２．３．４ 保 持 鸡 舍 通 风 方 向 由 上 向 下。
通过以上这些措施， 从根源上 切 断 了 鸡 球 虫 病 的 感 染 途 径 。操 作 虽然不复杂， 但要真正做到且持之
２００３， ２５（ ４） ： ３０９～３１２
分 离 纯 化 的 可 疑 菌 株 经 姬 姆 萨 染 色 ， 在 显 微 镜 ［６］ 张道永， 王文贵， 林 毅 ， 等．四 川 地 区 鸡 毒 支 原 体 的
（ １０×１０） 下 镜 检 ， 菌 体 主 要 呈 蓝 紫 色 球 状 ， 有 少 量 呈 分 离 鉴 定 及 血 清 学 定 型 ［Ｊ］． 中 国 预 防 兽 医 学 报 ，
１．４．２ 菌 落 形 态 观 察： 将 分 离 纯 化 后 的 待 检 培 养 液
１．２ 病料采集
０．２ｍＬ， 接 种 于 固 体 培 养 基 中 ， 置 于 密 封 烛 缸 中 ３７℃
自 ２００４ 年 至 ２００５ 年 ， 对 广 东（ 广 州 、鹤 山 、台 培养 ７～１０ 天后， 置于低倍镜下观察菌落形态。
ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｄｅｃｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐ－
ｔｉｃｕｍ［Ｊ］．ａｖｉａｎ ｄｉｓｅａｓｅ， １９９１， ３５： ６２～２９
［４］ 林居纯． 氟 喹 诺 酮 类 药 物 耐 药 性 检 测 基 因 芯 片 的
研究［Ｄ］．华南农业大学博士学位论文（ 未 发 表） ．２００５：
查。对上述地区养鸡场， 无菌操作采取疑为鸡毒支原 物 。 取 沉 淀 物 涂 片 ， 用 甲 醇 固 片 ２～５ｍｉｎ， 用 ＰＢＳ（ ｐＨ
体感染 病 、死 鸡 的 气 囊 、支 气 管 、肺 组 织 等 １９４ 份 样 ， ６．９８） 稀释 １０ 倍的姬姆萨染色液染色 ４０ｍｉｎ， 镜检。
置 于 鸡 毒 支 原 体 培 养 液 中 保 存 ， 送 往 实 验 室 做 鸡 毒 １．４．４ ＰＣＲ 及测序鉴定：
以 恒 并 不 容 易 。某 种 鸡 场 采 取 笔 者 推荐的生物安全法， 从 ２０００ 年至 今基本上杜绝了鸡球虫病的暴发， 偶有个别鸡和鸡群出现， 发病率也 在 ０．３％以 内 ， 少 量 投 药 就 可 轻 易
防 治 。所 以 采 用 生 物 安 全 方 法 取 得 了令人满意的效果， 有力地保障了 种鸡场的正常生产， 各种生产技术 指标达到较高的水平。
临床菌株扩增产物， 送上海博亚生物有限公司测序。 泌物中含菌量少有关。此外， 由于鸡毒支原体常与大
２ 结果
肠杆菌混合感染， 故从气囊组织， 尤其气囊中已有干
２．１ 鸡毒支原体分离结果
酪样物时， 也较难分离。从支气管和肺组织中则容易
从 北 京 市 采 集 １９ 份 样 本 中 分 离 出 １２ 株 可 疑 菌 分离出鸡 毒 支 原 体 ， 特 别 是 与 肺 相 连 的 小 支 气 管 ， 因
Ｇｅｎｂａｎｋ ＭＧ－ Ｒ 株 ＦＭＧ － ２ 核 苷 酸 序 列 相 似 性 为 ［８］ Ｍｅｋｋｅｓ ＤＲ， Ｆｅｂｅｒｗｅｅ Ａ． Ｒｅａｌ － ｔｉｍｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
９８．８６％。
ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃ－
３ 讨论与结论
ｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ ［Ｊ］． ａｖｉａｎ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，
３．１ 鸡毒支原体的分离与纯化
２００５， ３４（ ４） ： ３４８～３５４
５１０６４２； ２ 四川农业大学动物科技学院， 四川雅安 ６２５０１４）
ｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ ，ＭＧ）可 引 起 鸡 慢 性 呼 吸 中图分类号： Ｓ８５４．４＋３ 文献标识码： Ｃ 文章编号： １００８－ ３８４７（ ２００７） ０８－ ００２１－ ０２ 道 疾 病 、火 鸡 传 染 性 窦 炎 。 临 床 主
１ 材料与方法
含 青 霉 素 和 醋 酸 铊 的 ＦＭ－ ４ 液 体 培 养 基 中 连 续 传 代
１．１ ＭＧ 液 体 培 养 基（ ＦＭ－ ４ 完 全 培 养 基） 及 固 体 培 ５ 次 ， 然 后 将 培 养 物 接 种 到 固 体 培 养 上 ， 观 察 菌 落 形
养基的制备
态。
按 毕 丁 仁 等 报 道 方 法 的 制 备 ［２］。
的“油 煎 蛋 状 ”， 即 菌 落 中 央 厚 硕 隆 起（ 称 脐 心） ； 有 些 合细菌 Ｌ 型鉴别结 果 、菌 落 形 态 观 察 、染 色 镜 检 观 察
菌落脐不明显， 呈水滴状， 内有沙砾样物呈放射状排 和流行病学调查， 确诊所分离的病原为鸡毒支原体，
列。此外， 还观察到支原体的出芽和裂殖两种增殖方 其分离率为 ３５．５７％（ ６９／１９４） 。
养禽与禽病防治 ２００７ 年第 ８ 期
－ ２１ －
摘 要 ： 从 广 东 、四 川 及 北 京 地
区患有慢性呼吸道疾病的不同鸡 场采集 １９４ 份 样 本 ， 接 种 ＦＭ－ ４ 培 养 基 进 行 分 离 培 养 。对 符 合 鸡 毒 支
鸡毒支原体的
原 体 培 养 特 性 培 养 物 采 用 ＰＣＲ 加
为细菌。
３．２ 鸡毒支原体的鉴定
２．３ 菌落形态观察
鸡毒支原体的鉴定诊断在临床上主要采用血清
分离纯化的菌株在液体培养基中生长呈清亮黄 方法， 但由于存在非特异性交叉反应， 这给临床诊断
色， 轻轻振荡， 有沙粒样菌体悬浮。在固体培养基上 带来一定困难。随着分子生物学技术的发展， 采用
培 养 ７～１０ 天 后 ， 有 些 菌 株 用 肉 眼 观 察 ， 可 见 针 尖 大 ＰＣＲ 或分子杂交 方 法 检 测 鸡 毒 支 原 体 的 报 道 逐 渐 增
３４～３６
图 １ 编 号 为 Ｂｊ１ 临 床 分 离 株 在 固 体 培 养 基 上 培 养 ［５］ 吴清民， 杨秀玉， 沈 志 强 ， 等．鸡 毒 支 原 体 的 分 离 鉴
１０ 天后的菌落形态（ １０×１０）
定 和 最 低 抑 菌 浓 度 测 定 ［Ｊ］． 中 国 预 防 兽 医 学 报 ，
２．４ 姬姆萨染色镜检
细短杆状或弧形等形态。
１９９９， ２１（ ２） ： ９３～９５