溶菌酶检验标准
溶菌酶活力测定实验报告
1. 掌握溶菌酶活力测定的原理和方法；2. 熟悉分光光度计的使用；3. 了解溶菌酶对革兰氏阳性菌细胞壁的溶解作用。
二、实验原理溶菌酶（N-乙酰胞壁质聚糖水解酶）是一种能够催化某些细菌（革兰氏阳性菌）细胞壁多糖水解的酶，从而溶解细菌细胞壁，起到杀菌作用。
测定溶菌酶活力时，可用细菌细胞壁作为底物，细胞壁溶解后，菌悬液浊度降低，通过分光光度法测定菌悬液浊度变化，计算溶菌酶活性。
三、实验材料与试剂1. 试剂：1. 1mol/L氢氧化钠溶液；2. 1mol/L盐酸溶液；3. 0.1mol/L磷酸缓冲液（pH6.2）：NaHPO·2H2O 0.392g，溶于蒸馏水并稀释至1000mL，调节pH至6.2；4. 牛肉膏培养基；5. 溶菌酶结晶标准品（酶活力单位为70000U/mg）。
2. 仪器：1. 分光光度计；2. 离心机；3. 移液器；4. 电子天平；5. 烧杯；6. 漏斗；7. 移液管。
1. 准备实验试剂和仪器；2. 配制0.1mol/L磷酸缓冲液（pH6.2）；3. 将枯草杆菌制成菌悬液；4. 将溶菌酶标准品稀释成不同浓度；5. 分别取不同浓度的溶菌酶标准品和菌悬液，加入反应体系中；6. 在分光光度计上测定菌悬液在450nm波长下的吸光度值；7. 根据吸光度值和溶菌酶标准品浓度，绘制酶活力曲线；8. 测定待测溶菌酶样品的酶活力。
五、实验结果与分析1. 酶活力曲线：根据实验数据，绘制酶活力曲线，结果表明酶活力与溶菌酶浓度呈线性关系。
2. 待测溶菌酶样品的酶活力：根据酶活力曲线，计算待测溶菌酶样品的酶活力。
六、实验结论通过本实验，我们成功掌握了溶菌酶活力测定的原理和方法，熟悉了分光光度计的使用，并了解了溶菌酶对革兰氏阳性菌细胞壁的溶解作用。
实验结果表明，溶菌酶活力与溶菌酶浓度呈线性关系，为后续相关研究提供了实验依据。
七、实验注意事项1. 实验过程中，注意控制反应体系的pH值，以保证溶菌酶活性；2. 使用分光光度计测定吸光度值时，注意选择合适的波长；3. 实验过程中，操作要规范，避免污染。
尿溶菌酶测定(ULYSO)
尿溶菌酶测定（ULYSO）
尿溶菌酶测定（ULYSO）介绍：
溶菌酶是一种小分子量的碱性蛋白水解酶，具有溶解某些细菌的作用。
急性淋巴细胞白血病病人在病情缓解、血象改善的同时，尿液中溶菌酶有回升的倾向，尿溶菌酶测定对白血病疗效观察是一项较好指标。
尿溶菌酶测定（ULYSO）正常值：
0～2mg/L (0～2μg/ml)。
尿溶菌酶测定（ULYSO）临床意义：
异常结果：
升高：见于急性单核细胞性白血病、急性粒细胞白血病、慢性肾炎等。
需要检查的人群：有贫血、发热、原因不明无痛肿大、出血等症状或有水肿、血尿、高血压等症状的人群。
尿溶菌酶测定（ULYSO）注意事项：
检查时注意：做该检查时应尽量采用新鲜晨尿。
随机留取的尿液以中段尿为宜。
不适宜人群：月经期女性
尿溶菌酶测定（ULYSO）检查过程：
检查过程：与常规尿检一样，使用清洁干燥的容器，以医院提供的一次性尿杯和尿试管为好。
取10毫升左右尿液，送到医院的指定的检验窗口。
检查方法是用显微镜对尿进行检查。
溶菌酶的测定方法
溶菌酶的测定方法溶菌酶（lysozyme）是一种广泛存在于生物界的酶类分子，能够切断细菌细胞壁的三葡聚糖链（N-醋酸氨基葡庚糖-N-乳酸氨基葡庚糖-β1,4-N-乳酸氨基葡庚糖）。
溶菌酶的测定方法可以从不同的角度进行，包括溶菌酶活性的测定、溶菌酶的产量测定以及溶菌酶在生物体内的测定。
一、溶菌酶活性的测定方法：1. 醋酸甲酯法：该方法通过测量溶菌酶对醋酸甲酯的水解产生的醋酸乙酯的量来间接测定其活性。
首先使用醋酸甲酯制备醋酸乙酯标准曲线，然后将酶样液和醋酸甲酯复合反应一段时间，加入硫酸中断反应，测定产生的醋酸乙酯的吸光度，并通过标准曲线计算出酶的活性。
2. 改良的漆酶法：该方法以溶菌酶对大肠杆菌产生的透明圈直径为基础，通过测量透明圈的直径或面积来间接测定其活性。
方法简单易行，主要用于溶菌酶活性快速筛选。
3. 电导法：该方法基于溶菌酶在水溶液中产生的游离离子影响电导率的原理。
通过将一定浓度的酶溶液加入含有特定离子的缓冲溶液中，测定加入酶溶液前后的电导差异，从而计算出酶的活性。
二、溶菌酶的产量测定方法：1. 透明圈法：该方法将溶菌酶产生菌株接种于含有含有菌斑形成的凝胶平板上，经过一定时间后，用碘溶液显色，可在平板上观察到菌株周围出现的透明圈，通过透明圈的直径或面积来判断酶的产量。
2. 血凝法：该方法使用牛血液和凝血酶来测定溶菌酶产量。
将溶菌酶产生菌株培养得到的培养基与牛血液相混合，通过观察血凝情况来判断溶菌酶产量的大小。
三、溶菌酶在生物体内的测定方法：1. 酶活测定：通过采集动物的血液、组织或细胞，制备相应的提取液，然后通过测定其对某种特定底物的酶活性来间接测定生物体内溶菌酶的水平。
2. 分子生物学方法：通过采用PCR扩增技术、核酸杂交等方法，检测生物体内溶菌酶基因的表达水平和突变情况，从而间接测定生物体内溶菌酶的含量。
总结起来，溶菌酶的测定方法可以根据需求选择。
溶菌酶活性的测定方法主要包括醋酸甲酯法、漆酶法和电导法；溶菌酶的产量测定方法主要有透明圈法和血凝法；溶菌酶在生物体内的测定方法包括酶活测定和分子生物学方法。
溶菌酶的提取和活性测定
实验讲义溶菌酶的提取和活性测定南方医科大学药学院I 溶菌酶的提取和部分纯化【试验目的】掌握根据等电点的差异，用离子交换层析方法进行分离纯化蛋白质。
【试验原理】溶菌酶（lysozyme ）又称胞壁质酶，是一种具有抗菌作用的粘多糖酶，相对分子量为1.44×104，可以催化水解细菌细胞壁N－乙酰胞壁酸和N－乙酰氨基葡萄糖的ß－1，4糖苷键，使细胞壁不溶性多糖成份分解成可溶性的糖肽，细菌细胞内容物溢出，使细菌溶解。
溶菌酶广泛存在于动植物中，比如鸡蛋、人的泪液、乳汁等等，其中以鸡蛋清中的含量最高。
下表是鸡蛋清中各种蛋白质的种类、含量和某些特性。
从表中可以看出，蛋清中大部分蛋白质的等电点在6.05以下，只有溶菌酶和卵白素的等电点在10以上，而溶菌酶的含量是卵白素的70倍。
在pH值7.0的缓冲液中，只有溶菌酶和卵白素带正电荷，其他蛋白质带负电荷，因此，可以通过阳离子交换层析，把溶菌酶和其他蛋白质分离，使溶菌酶得到部分纯化。
【仪器、材料和试剂】(一)、仪器分光光度计（二）、材料1、磷酸氢二钠（Na2HPO4）2、磷酸二氢钠（NaH2PO4）3、新鲜鸡蛋4、Amberlite阳离子交换树脂5、氯化钠（三）试剂1、PBS缓冲液：0.10M的磷酸盐缓冲液，pH7.0。
2、杂蛋白洗脱液：NaCl溶于0.10M的磷酸盐缓冲液（pH7.0），浓度0.05M。
3、溶菌酶洗脱液：NaCl溶于0.10M的磷酸盐缓冲液（pH7.0），浓度0.5M。
【实验步骤】（一）树脂的再生Amberlite阳离子交换树脂用0.5mol/L NaOH 浸泡30min，水洗至中性；再用0.5mol/L HCl 浸泡30min，水洗至中性。
在PBS缓冲液平衡12小时以上。
（二）蛋清样品的准备市售新鲜鸡蛋3个，破蛋壳取出蛋清，除去黏稠状物体，加入2倍体积的PBS 缓冲液（pH7.0），搅拌均匀。
八层纱布过滤，取30ml澄清液体，其中取0.5mL 置于EP管中，于-20°C冻存备用，标记为样品1。
食品添加剂 溶菌酶 标准文本(食品安全国家标准)
食品安全国家标准 食品添加剂 溶菌酶1 范围本标准适用于从鸡蛋清中提取溶菌酶，然后经提取、精制等工艺制得的食品添加剂溶菌酶。
2 技术要求 2.1 感官要求感官要求应符合表1的规定。
表1 感官要求项 目要 求检验方法固体液体色泽 白色至淡黄色 浅黄色至深褐色 将适量试样均匀置于烧杯或白瓷盘内，于自然光线下观察其色泽和状态。
状态粉末液体2.2 理化指标理化指标应符合表2的规定。
表2 理化指标2.3 微生物指标微生物指标应符合表3的规定。
表3 微生物指标项 目指 标 检验方法菌落总数/[CFU /g （mL ）] ≤ 50000 GB 4789.2 霉菌和酵母菌/[CFU /g （mL ）] ≤ 100 GB 4789.15 大肠杆菌/[MPN/g （mL ）] ＜ 3.0 SN/T 0738 沙门氏菌/25g （mL ） 不得检出 GB 4789.4金黄色葡萄球菌/25g （mL ）不得检出GB 4789.10定性检验附 录 A项 目指 标 检验方法固体液体酶活力/[u/mg （mL ）] ≥ 符合声称附录A 中A.3 水分，w /% ≤ 6 — GB 5009.3 灰分，w /% ≤ 1.50.3 GB 5009.4 pH3.0～7.0 附录A 中A.4 铅（Pb ）/（mg/kg ） ≤ 2.0 GB 5009.12 总砷（以As 计）/（mg/kg ）≤1.0 GB 5009.11检验方法A.1 一般规定本标准除另有规定外，所用试剂的纯度应在分析纯以上，所用标准滴定溶液、杂质测定用标准溶液、制剂及制品，应按GB/T 601、GB/T 602、GB/T 603的规定制备，实验用水应符合GB/T 6682中三级水的规定。
试验中所用溶液在未注明用何种溶剂配制时，均指水溶液。
A.2 鉴别试验0.01%醋酸盐缓冲溶液（pH 5.4）于279 nm～281 nm处有最大吸收。
A.3 酶活力的测定A.3.1 方法原理溶菌酶可水解细菌的细胞壁，造成溶壁微球菌的溶解而引起溶液吸光度值的降低。
溶菌酶活性的测定
溶菌酶活性的测定方法一1.取血，断尾或腹主动脉采血，在室温下静置1h，然后4℃冰箱中保持4h，2000r/min离心10min，取上层血清备用；2.用0.1mol/L的磷酸缓冲液(PBS,PH6.4)将溶壁微球菌(Micrococcuslysodeikticus)配制成一定浓度的菌悬液（O.D.570=0.3，菌浓度为4×106cfu/mL）；3.取3.0 mL该悬液于离心管中，再加入50μl血清混匀，570nm下测初始光密度值（A0）；4.然后将试液移于37℃水浴30 min；5.取出后立即置于冰浴10 min以终止反应，测反应后的光密度值（A）；6.计算。
公式：U=(A0-A)/AU：溶菌活力；A0：反应前光密度值；A：反应前光密度值方法二1.取血，断尾或腹主动脉采血，在室温下静置1h，然后4℃冰箱中保持4h，2000r/min离心10min，取上层血清备用；2.用0.067mol/L的磷酸缓冲液(PBS,PH6.4)将溶壁微球菌(Micrococcuslysodeikticus)配制成0.2mg/ml的菌悬液；3. 3.0 mL该悬液于离心管中，再加入40μl血清混匀，540nm下测初始光密度值（A0）；4.然后将试液移于28℃水浴30 min；5.取出后立即置于冰浴10 min以终止反应，测反应后的光密度值（A）；6.计算。
公式：U=(A0-A)/AU：溶菌活力；A0：反应前光密度值；A：反应前光密度值方法三准确称取溶菌酶标准品，用pH 6.4，1/15 mol/L PBS配成1ug/mL，，临用时用PBS稀释成500，100，50，25，10 ug/mL标准液，用以制成标准曲线。
以溶壁微球菌（Micrococcus lysoleikticus）冻干粉为底物，用1/15 mol/L，pH 6.4磷酸缓冲液配成一定浓度的悬浊液（用722型分光光度计于640 nm测定并调整其浓度为透光率达30％-40％）。
溶菌酶检测实验报告
1. 了解溶菌酶的性质和作用；2. 掌握溶菌酶检测的方法；3. 学会使用比色法检测溶菌酶活性。
二、实验原理溶菌酶是一种水解酶，主要作用于细菌细胞壁中的肽聚糖，使细菌细胞壁破裂，导致细菌死亡。
本实验通过检测溶菌酶对细菌的裂解作用，从而判断溶菌酶的活性。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）溶菌酶样品；（2）细菌菌液；（3）细菌对照菌液；（4）蒸馏水；（5）0.9%生理盐水；（6）1%琼脂；（7）无菌试管；（8）无菌棉签；（9）比色计。
2. 实验仪器：（1）恒温培养箱；（2）高压蒸汽灭菌器；（3）移液器；（4）电子天平；（5）显微镜。
1. 制备细菌菌液：（1）将细菌菌种接种于含有1%琼脂的培养基平板上，置于恒温培养箱中培养24小时；（2）用无菌棉签蘸取菌落，将其涂抹于无菌试管中，加入适量生理盐水，制成细菌菌液。
2. 溶菌酶活性检测：（1）取无菌试管6支，分别编号为1-6号；（2）向1-5号试管中加入1ml细菌菌液，6号试管作为空白对照；（3）向1-5号试管中加入不同浓度的溶菌酶样品，6号试管中加入等体积的蒸馏水；（4）将试管置于恒温培养箱中培养一段时间；（5）观察各试管中的细菌生长情况，记录透明圈直径；（6）计算溶菌酶活性。
五、实验结果与分析1. 结果：（1）1-5号试管中均出现透明圈，6号试管中细菌生长良好；（2）随着溶菌酶浓度的增加，透明圈直径逐渐增大。
2. 分析：（1）溶菌酶具有裂解细菌细胞壁的作用，使得细菌死亡；（2）溶菌酶活性与透明圈直径呈正相关，即溶菌酶浓度越高，透明圈直径越大；（3）通过计算，得到不同浓度溶菌酶的活性。
六、实验结论本实验通过比色法检测了溶菌酶的活性，结果表明溶菌酶具有裂解细菌细胞壁的作用，且其活性与溶菌酶浓度呈正相关。
1. 实验过程中，应注意无菌操作，避免污染；2. 溶菌酶浓度对实验结果有较大影响，应选择合适的浓度进行实验；3. 实验过程中，观察透明圈直径时，应注意与空白对照进行对比；4. 本实验仅检测了溶菌酶的活性，未对溶菌酶的纯度进行检测，后续实验可进一步研究。
溶菌酶活性检验方法(药典)
溶菌酶拼音名：Rongjunmei英文名：Lysozyme书页号：E6-141本品系自新鲜鸡蛋清中提取的一种能分解粘多糖的碱性蛋白酶，常与氯离子结合成为溶菌酶氯化物。
按干燥品计算，每1mg的效价不得少于6250单位。
【性状】本品为白色或微黄色的结晶性或无定形粉末；无臭，味甜；水溶液遇碱易破坏。
本品在水中易溶，在丙酮或乙醚中不溶。
【鉴别】(1)取本品约2mg，加水2滴使溶解，加10％氢氧化钠溶液5滴与10％硫酸铜溶液1滴，混匀后显紫红色。
(2)取本品，加醋酸－醋酸钠缓冲液（取无水醋酸钠6.7g，加水约900ml，振摇使溶解，用醋酸调节pH值至5.4，加水稀释至1000ml,摇匀。
）制成每1ml中含溶菌酶0.4mg的溶液，照分光光度法（中国药典1995年版二部附录ⅣＡ）测定,在280nm的波长处有最大吸收，吸收度应为0.39～0.49。
【检查】酸度取本品0.1g，加水至10ml溶解后，依法测定（中国药典1995年版二部附录ⅥＨ），pH值应为3.5～6.5。
干燥失重取本品0.2g，置五氧化二磷干燥器中,减压干燥3小时，减失重量不得过5.0％（中国药典1995年版二部附录ⅧＬ）。
炽灼残渣取本品0.2g，依法检查（中国药典1995年版二部附录ⅧＮ），遗留残渣不得过4.0％。
总氮量取本品，照氮测定法（中国药典1995年版附录ⅦＤ第二法），按干燥品计算，含总氮量应为15.0～17.0％。
【效价测定】供试品溶液的制备取本品约25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加磷酸盐缓冲液[取磷酸二氢钠10.4g与磷酸氢二钠7.86g及乙二胺四乙酸二钠0.37g，加水溶解使成1000ml,调节pH值至6.2]适量使溶解,并稀释成每1ml中含溶菌酶50μg的溶液。
底物悬浮液的制备称取溶酶小球菌15～20mg，加磷酸盐缓冲液(pH6.2)0.5～1ml,在研钵内研磨3分钟，再加磷酸盐缓冲液(pH6.2)适量，使总体积约为50ml，使悬浮液于25±0.1℃时，在450nm的波长处测得的吸收度为0.70±0.05(临用前配制)。
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1术语和定义
溶菌酶酶活性单位：在25℃、pH值为6.2的条件下，于450nm处每分钟引起溶酶小球菌体（Micrococcus Lysodeiktidus）溶液吸光度下降0.001所需要的酶量为一个酶活性单位U。
本定义适合“比浊法”。
溶菌酶效价：溶菌酶在一定浓度范围内，其对数计量与抑菌圈直径（面积）呈对数关系，通过检测其对微生物的抑制作用，比较标准品与样品产生抑菌圈的大小，计算出样品的效价，单位为u。
本定义适合“管碟法”。
2技术要求
2.1外观和性状要求
粉酶为白色或微黄色的结晶或无定形粉末。
2.2技术指标
4.2.1粉酶水分含量：≤12%。
4.2.2粉酶粒度：420μm孔径分析筛筛上物≤4%。
4.2.3粉酶炽灼残渣：≤10.0%。
4.2.4酶活（效价）指标
4.2.5卫生指标
符合GB 13078和NY/T 722的有关规定。
3试验方法
本标准所用试剂和水，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和GB/T 6682中规定的三级水，所用试液中的标准溶液，在没有注明其他要求时均要求按GB/T 601，GB/T 602制备。
3.1外观的测定
取样品少许放入烧杯，下衬白纸进行目测。
3.2粉酶水分的测定
按GB/T 6435 规定进行检测。
3.3粉酶粒度的测定
按GB/T 5917 规定进行检测。
3.4粉酶炽灼残渣的测定
按《中国兽药典》规定进行检测。
3.5卫生指标的测定
按饲料卫生标准GB13078和NY/T 722规定的方法进行。
3.6溶菌酶酶活性（效价）的测定
溶菌酶微生物测定法系在适宜条件下，通过检测溶菌酶对微生物的抑制作用，计算出溶菌酶活性（效价）的方法。
依据试验设计原理不同，可分为比浊法和琼脂扩散法（即管碟法）。
3.6.1试剂和溶液
5.6.1.1溶酶小球菌（Micrococcus Lysodeiktidus）
将溶酶小球菌接种于固体培养基上，置37℃培养48小时，用无菌水将菌体洗下，用纱布滤过，滤液离心后，倾去上层清液，用水洗涤菌体数次，然后用少量水悬浮，冰冻干燥，得淡黄色粉末，供测定用，保存一年。
使用时，在营养琼脂斜面上活化，传代培养，工作用菌种不超过5代，斜面菌种从培养好到使用时间，最长不超过2个月。
并将培养好的斜面菌种，放置4℃冰箱保存。
制备的菌悬液可以使用一周，不用时放置4℃冰箱保存。
5.6.1.2磷酸缓冲液
称取磷酸二氢钠（NaH2PO4.2H2O）11.7g, 磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O）7.86g，加900mL水溶解,调pH 值至6.2，定容至1000mL。
5.6.1.310％氢氧化钠溶液
5.6.1.41％硫酸铜溶液
5.6.1.530%三氯醋酸
5.6.1.6斜面培养基：营养琼脂
5.6.1.7抗生素检定培养基II号
5.6.1.8溶菌酶标准品
3.6.2仪器
5.6.2.1分析天平：精密度0.1m g；
5.6.2.2牛津杯：牛津杯内径6.0±0.1mm，外径7.8±0.1mm，高10.0±0.1mm，每套牛津杯的重量差异不超过±0.05g，内外壁及两端面光滑平坦。
管壁厚薄一致；
5.6.2.3陶瓦盖：内径约103mm，外径108mm,平坦，吸水性强。
应定期清洗、干燥或干热灭菌；
5.6.2.4游标卡尺：精度0.02mm；
5.6.2.5双碟：内径约90mm，外径16mm～17mm的硬质玻璃或塑料培养平皿，碟底厚薄均匀，水平透明，无色斑气泡；
5.6.2.6超净工作台：有效工作面局部洁净度100级。
用于试验菌的接种传代或菌悬液制备；
5.6.2.7pH酸度计：精确到0.01；
5.6.2.8分光光度计：配10mm比色皿，可在450nm下测定吸光值；
5.6.2.9离心机：转速为4000r/min以上；
5.6.2.10秒表：每小时误差不超过5s；
5.6.2.11恒温培养箱：设置漂移温度为35℃～37℃；
5.6.2.12高压灭菌锅
5.6.2.13烘箱
5.6.2.14其它玻璃器皿：刻度吸管: 1 mL，2mL，5mL，10mL，25mL无菌吸管等；
3.6.3试验方法
5.6.3.1鉴别
固体样品：取本品10mg，溶于1mL水中，加30%三氯醋酸2滴，产生白色沉淀。
取试管一支，加5%溶菌酶水溶液2滴、10%氢氧化钠5滴及1%硫酸铜溶液1滴，混匀后，应显紫玫瑰色。
5.6.3.2方法一：比浊法
特定浓度的溶酶小球菌悬浮液在450nm条件下存在一定吸光度，溶酶菌作用于溶酶小球菌底物会引起吸光度降低，通过计算指定时间内吸光度降低的幅度可以计算出溶菌酶的活力。
①试验步骤：
精确称取样品（液体样品需在离心机上以3500r/min离心10min后取上清液）不少于20mg，用pH6.2
的0.1mol/L磷酸缓冲液稀释到酶活单位为100U/ mL ~200U/mL，备用。
将保存好的溶酶小球菌在营养琼脂斜面上活化，传代两次后的菌体37℃培养48小时，再用生理盐水从培养基上洗脱下来，并稀释到一定倍数，使其在25℃时，在450nm波长处测定的吸光度A0为0.65～0.75之间。
精密取底物悬浮液2.5mL，放入比色杯中，在450nm波长处测定其吸光度，作为零时读数，然后取样品溶液0.5mL，加入比色杯中，用秒表开始计时，迅速混合，以磷酸缓冲液做空白，到60秒时记下吸光度A60、。
②试样酶活力的计算：
1000
X D = × (A0-A60) × N × 2 ————————（1）
M
式（1
N —样品总的稀释倍数
5.6.3.3 方法二：管碟法
利用溶菌酶的抗菌性质及其溶液在琼脂培养基内的扩散作用，将未知效价的样品液与已知效价的标准溶液，在同一条件下，在摊布高度敏感性特定试验菌的培养基上进行一定时间的对照培养，溶菌酶溶液在培养基内的扩散到达适当范围内时就产生了抑制试验菌生长的透明抑菌圈，并且在一定的溶菌酶浓度范围内，溶菌酶对数浓度与抑菌圈直径成正比。
经比较标准液与样品两者抑菌圈直径或面积大小，采用二剂量法，即可推算出样品的效价。
① 菌悬液的制备：
将保存好的溶酶小球菌在营养琼脂斜面上活化，传代两次后的菌体37℃培养48小时，再用10mL 生理盐水将一支培养好的溶酶小球菌斜面菌体洗下制成菌悬液，尽量保证每次所加指示菌的浓度一样，供测定用。
② 测定平板的制备：
底层：用灭菌破口移液管(25mL)，吸取已融化的培养基20mL 注入双碟内，等凝固后更换干燥的陶瓦盖。
菌层：取出溶酶小球菌菌悬液，按1%的菌量添加，吸取菌悬液加入已融化冷却至50℃～55℃的培养基内，摇匀作为菌层用。
用灭菌10mL 破口移液管，吸取菌层培养基5mL ，使均匀分布在底层培养基上，置水平台上，用陶瓦盖覆盖，放置40min ，待凝固，备用。
③ 待测酶液的准备：
精确称取样品（液体样品需在离心机上以3500r/min 离心10min 后取上清液）不少于20mg ，用pH6.2的0.1mol/L 磷酸缓冲液稀释到酶活单位在5000U/mL 左右，备用。
④ 标准品、样品的滴加：
取8个双碟，，在每个双碟中对称放入4个牛津杯，分别成对角滴加标准品高(SH)、标准品低（SL ）及样品高(TH)、样品低(TL)两种浓度的溶液，直至牛津杯口平满。
注意滴加溶液间隔不可过长，因溶液的扩散时间对测定结果有影响。
（注意：标准品必须现配现用，不能隔夜。
从测定平板的制备到进入培养箱培养，整个过程必须在2小时内完成）。
⑤ 双碟的培养及抑菌圈的测量
将双碟置于37±0.5℃培养箱中，培养16小时～18小时后，取出双碟，测定抑菌圈直径（如有破圈或不完整的抑菌圈，则应舍弃该碟）。
样品的高低剂量透明圈直径尽量和标准品的高低剂量透明圈直径接近，整个系统的透明圈直径控制在15mm ～19mm 之间。
⑥ 结果判定：
微生物测定结果的正确性和精密度受很多因素影响，为了使测定结果更能真实的反映客观情况，符合设计原理，就必须将测定结果按生物检定统计，进行可靠性测验及效价计算和可信限计算。
统计学分析按药典附录的生物检定统计法进行F 的显着性测验，要求直线回归和剂间要非常显着
（P<0.01），偏离平行不应显着(P>0.05)；且可信限率不得超过5％。
实验结果在可靠性成立前提下，方可根据设计的计算公式进行样品效价计算。
将样品的估计效价控制在实际效价的90％～110％，否则，需要重新估计效价进行测定。
%100log 112212121⨯⎥⎦
⎤⎢⎣⎡⨯--+--+=-I S T S T S S T T R ———————— （2）
P T = R X A T ———————— （3）
式中：
R
: 供试品效价（相当于标示量或估计效价的百分数； S 2
: 标准品高浓度溶液所致抑菌圈直径（或面积）的总和； S 1
: 标准品低浓度溶液所致抑菌圈直径（或面积）的总和； T 2 : 供试品高浓度溶液所致抑菌圈直径（或面积）的总和；
T1: 供试品低浓度溶液所致抑菌圈直径（或面积）的总和；
I : 高、低剂量之比的对数值，2：1时，I=0.301; 4：1时，I=0.602;
A T: 估计效价；
P T T: 供试品实测效价；。