11 电泳分离技术解析
电泳分离技术
凝胶的浓度和交联度
▪ 浓度和交联剂浓度决定胶的物理状 态及分子筛的孔径的大小
➢一般浓缩胶：2-5%，a:b=20 ➢分离胶：7-10%，a:b=40 ➢标准胶浓度：7%
在浓度为7.5% 的凝胶中，大多数生物 体内的蛋白质能得到满意的分离效果。 因此，把浓度为7.5% 凝胶称为标准胶。
• 区带电泳(zone EP)
• 只能起到部分分离的作用，如将浓度对距离作图，则得出一
个个台阶状的图形;
• 等速电泳(isotachophoresis)
• 在电泳达成平衡后，各区带相随，分成清晰的界面，以等速 移动。按浓度对距离作图也是台阶状，但不同于上述移界电
泳，它的区带没有重叠，而是分别保持; • 等电聚焦 (isoelectricfocusing)
核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系: 共价闭环 超螺旋结构DNA>直线DNA >双链环状DNA
2、聚丙烯酰胺凝胶电泳
▪ 聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)早在1959年由 Raymends和 Weintraub．L建立。1964年， 此法进一步从理论和实验技术上得到改进并推 广应用。由于具有较高的分辨率和灵活性，目 前已被广泛应用于蛋白质等生物大分子的分离
5% 7.5~20% -
● 不连续胶有聚焦样品的作用
聚丙烯酰胺凝胶电泳原理
三种物理效应
⑴样品浓缩效应 ⑵分子筛效应 ⑶电荷效应
三种物理效率使样品分离效果好，分辨率高
（1）样品浓缩效应：由凝胶系统的不连续性产生。
①凝胶孔径不连续性 ②缓冲液离子成份的不连续性 ③pH的不连续性
述电泳分离的基本原理
述电泳分离的基本原理电泳分离（Electrophoresis）是一种将带电的分子在电场中移动，根据其大小、形状和电荷来分离的技术。
它广泛应用于生物医学研究、分子生物学、基因工程和法医学等领域，具有高分辨率、高效率、易操作和经济快捷的特点。
电泳分离的基本原理是利用电场作用下分子的电荷与大小之间的相互作用力，将不同分子迁移速率差异实现分离。
电泳分离可以用于DNA、RNA、蛋白质等大分子的分离和定性。
其主要包括几个方面的原理：1. 电场：电泳分离的基础是电场的产生。
电场是由电场源（如电源）产生的，通过两个电极之间建立的电场引发分子的迁移。
电场的大小通过电势差（电压）来控制，电势差越大，电场强度越大，分子迁移速度越快。
2. 分子电荷：电泳分离依赖于溶液中分子的电荷特性。
分子通过在溶液中解离或离解而带上电荷，使其在电场中产生迁移。
正电离子在电场中向阴极（正电极）迁移，而负电离子则向阳极（负电极）迁移。
3. 分子大小和形状：分子的大小和形状也会影响电泳分离效果。
分子大小决定了其在电场中的迁移速率。
一般来说，较大的分子会比较小的分子迁移速率慢，因为较大分子的摩擦力较大。
此外，分子的形状也可以影响其在电场中的迁移速率。
4. pH值：溶液的pH值会影响电泳分离的结果。
pH值决定了溶液中分子的电荷状态。
在酸性环境下，溶液中的氢离子浓度增加，OH-离子浓度减少，溶液呈酸性，大部分分子以带正电荷形式存在。
在碱性环境下，溶液中的OH-离子浓度增加，H+离子浓度减少，溶液呈碱性，大部分分子以带负电荷形式存在。
因此，调节pH值可以通过改变分子的电荷状态来实现分离。
电泳分离有多种不同的形式，根据分离的机制可以分为凝胶电泳、毛细管电泳、等温电泳等。
1. 凝胶电泳：凝胶电泳是最常见的电泳技术。
凝胶电泳根据分子的迁移速率和尺寸的差异来分离分子。
凝胶可以是聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）或琼脂糖凝胶等。
通过不同孔径大小的凝胶，可以实现不同分子大小的分离。
实验十一免疫电泳
免疫电泳技术将可溶性抗原（如人血清蛋白）与相应抗体（如兔抗人血清的抗体）混合，当两者比例合适并有电解质（如氯化钠、磷酸盐等）存在时，即有抗原-抗体复合物的出现，此为沉淀反应。
如以琼脂凝胶为支持介质，则在凝胶中出现可见的沉淀线、沉淀弧或沉淀峰。
根据沉淀的出现与否及沉淀量的多寡，可定性、定量地检测出样品中抗原或抗体的存在和含量，免疫学的一些测定方法即基于此特性。
抗原与抗体的结合在沉淀反应中，呈一定的分子比例。
不同抗原和抗体之间的分子比例是不同的，但只有在分子比例合适时，才出现可见的沉淀。
所以沉淀能否出现并不完全反映抗原和抗体是否存在和发生结合。
抗原结合多个抗体分子，称抗原为多价；抗体一般只能结合两个抗原分子（IgM类抗体分子通常可以结合5个抗原分子）的抗原决定法簇，故为二价。
只有在彼此的结合价饱和时，才出现大量的抗原-抗体复合物沉淀。
当抗原与抗体的比例合适时，即二者结合价彼此饱和，就可形成网状结构的大分子抗原-抗体复合物沉淀，称为等价带。
若比例不合适时，抗体或抗原过量，则虽有抗原、抗体的结合，但不能大量形成网状结构的大分子复合物，沉淀量很少，甚至不出现沉淀。
在抗原、抗体数量关系曲线中，抗体过剩区域称为抗体过剩带，抗原过剩区域称为抗原过剩带。
如图1所示，在等价带的反应液中加入过量的抗原或抗体，沉淀复合物就会有部分溶解，甚至全部溶解的现象。
这是由于新加入的抗原或抗体竞争地结合相应的抗体或抗原，使网状大分子结构破坏，形成小分子复合物，致使沉淀出现溶解，沉淀量减少甚至完全消失。
在沉淀反应中，由于抗原过量而不出现沉淀的现象，称为前带现象。
此时不能误认为无沉淀就是无抗原存在，为了检测就必须稀释抗原。
抗体过量时，称为后带现象，同理需要稀释抗体进行检测。
图1的位置抗原与抗体的结合是依赖于两者分子结构的互补性，故其特异性高。
这种结合也是相当稳定的。
在一定条件下（过酸、过碱或浓盐存在下），二者可以分开，即结合是可逆的。
电泳分离技术
不同分子在同一电场中可能具有不同的泳动度
泳动度
泳动度与带电颗粒所带净电荷的数量、颗粒大 小和形状有关。
被分离的球形分子在电场中所受的力(F)为： F=EQ
➢ 式中 E：电场强度，即每厘米支持物的电位 降；Q为被分离物所带净电荷。
（二）、影响电泳速度的因素
• 样品本身：带电量，分子大小，形状 • 电场强度：电压 • 缓冲液：成分， pH ，离子强度 • 支持介质：电渗作用，吸附作用 • 温度
影响泳动度的因素
1．电场强度 是指每厘米的电位降，也称电位梯度(电势
梯度)。电场强度越高，则带电颗粒泳动越快。根据电场 强度的不同，电泳可分为两种。 ➢ (1)常压(100～500 V)电泳 其电场强度为2～10 V／cm。 分离时间较长，从数小时到数十小时，适合于分离蛋白质 等大分子物质。 ➢ (2)高压(2000～10000 V)电泳 其电场强度为50～200V／ cm，电泳时间很短，有时只需几分钟。多用于分离氨基酸、 多肽、核苷酸、糖类等小分子物质。
电泳技术概述
▪ 70年以来，电泳技术围绕制胶、电泳、染色三个技术 环节，不断改进，以实现下列目标： 1、提高分辨率及灵敏度。 2、简化操作，缩短电泳时间。 3、扩大应用范围。
目前，电泳技术已成为生物化学与分子生物学以及与其密 切相关的医学、农、林、牧、渔、制药及某些工业分析中 必不可少的手段。
二、电泳技术的基本原理
电泳是指带电粒子在电场的作用下，向着与其 电性相反的电极移动的现象。
电泳技术指利用电泳现象对混合物进行分离分 析的技术。
蛋白质分子在不同pH下的解离状态
NH3+ P
NH3+
NH2
P
P
COOH
COO-
电泳分离技术
谢谢
THANKS
样本分析。
电场不均匀性
电泳过程中电场的不均匀性可 能导致分离效果不佳。
高成本
电泳分离技术所需的设备和试 剂成本较高，增加了实验成本
。
操作复杂度
电泳分离技术的操作相对复杂 ，需要专业人员进行操作和维
护。
05 电泳分离技术的发展趋势和未来展望
CHAPTER
技术创新和改进
高效电泳分离技术的研发
通过改进电泳分离技术的原理和工艺，提高分离效率和准确性，降低能耗和成本。
21世纪
随着生物技术的快速发展，电泳分离技术在基因组学、蛋白质组学等 领域的应用越来越广泛，成为生命科学研究的重要手段之一。
02 电泳分离技术的基本原理
CHAPTER
电泳现象
定义
电泳现象是指带电粒子在电场中受到电场力的作用而发生迁移的 现象。
原理
带电粒子在电场中受到电场力的作用，产生定向移动，使得粒子在 电场中分布不均，从而实现分离。
细胞分离
利用电泳分离技术可以分离不同种类的细胞，如淋巴细胞 分型、干细胞分离等，为细胞治疗和药物筛选提供支持。
在化学和环境科学领域的应用
有机物分离
电泳分离技术可用于有机物的分 离和纯化，如氨基酸、肽类、糖 类等，在化学合成和药物制备中 具有重要应用。
环境监测
电泳分离技术可用于环境样品中 污染物的分离和检测，如重金属 离子、有机污染物等，为环境监 测和治理提供技术支持。
电泳分离技术
目录
CONTENTS
• 引言 • 电泳分离技术的基本原理 • 电泳分离技术的应用 • 电泳分离技术的优缺点 • 电泳分离技术的发展趋势和未来展望 • 结论
01 引言
电泳分离
支持介质的筛孔大小对待分离生物大分子的电泳迁移速度有明显的影响。在筛孔大的介质中泳动速度快，反 之，则泳动速度慢。
电泳时电流通过支持介质会产生热量，按焦耳定律，电流通过导体时的产热与电流强度（I）的平方、导体的 电阻（R）和通电的时间（t）成正比（Q=I2Rt）。
电泳的分类
电泳法可分为自由电泳（无支持体）及区带电泳（有支持体）两大类。 自由电泳包括Tise-leas式微量电泳、显微电泳、等电聚焦电泳、等速电泳及密度梯度电泳。 区带电泳则包括滤纸电泳（常压及高压）、薄层电泳（薄膜及薄板）、凝胶电泳（琼脂、琼脂糖、淀粉胶、 聚丙烯酰胺凝胶）等。
谢谢观看
影响的主要因素
0 1
电场强度
0 2
溶液的pH
0 4
电渗
0 6
温度
0 3
溶液的离子 强度
0 5
支持介质的 筛孔
电场强度是指每厘米距离的电压降，又称为电位梯度或电势梯度。电场强度对颗粒的泳动速度起着十分重要 的作用。电场强度越高，带电颗粒的泳动速度越快。根据电场强度的大小可将电泳分为高压电泳和常压电泳。常 压电泳的电场强度一般为2～10V/cm，电压为100～V，电泳时间从几十分钟到几十小时，多用于带电荷的大分 子物质的分离；高压电泳的电场强度为20～200V/cm，电压大于500V，电泳时间从几分钟到几小时，多用于带电 荷的小分子物质的分离。
溶液的离子强度越高，颗粒的泳动速度越慢。
在电场中，溶液对于固体支持物的相对移动称为电渗。例如，在纸电泳中，由于滤纸纤维素上带有一定量的 负电荷，使与滤纸相接触的水在电场中，液体对于固体支持介质的相对移动称为电渗现象。由于电泳支持介质表 面可能会存在一些带电基团，如滤纸表面通常有一些羧基，琼脂可能会含有一些硫酸基，而玻璃表面通常有SiOH基团等等。这些基团电离后会使支持介质表面带电，吸附一些带相反电荷的离子，在电场的作用下向电极方向 移动，形成介质表面溶液的流动。在pH>3时，玻璃表面带负电，吸附溶液中的正电离子，使玻璃表面的溶液层带 正电，在电泳中向负极迁移，带动电极液产生向负极的电渗流。如果电渗方向与待分离分子电泳方向相同，则加 快电泳速度；反之，则降低电泳的速度。
电泳分离原理
电泳分离原理
电泳分离原理是一种基于不同物质在电场中迁移速率不同而实现的分离技术。
其基本原理是利用物质在电场作用下的带电性及不同荷质比的差异，通过在一个带电场中对含有混合物的溶液或凝胶进行处理，使其中的成分在电场作用下沿着一定方向迁移，从而实现它们的分离。
电泳分离根据具体的物质性质和条件可以采用不同的方法，常见的有毛细管电泳、凝胶电泳、平板电泳等。
这些方法在电场中运用不同的介质，如液体或凝胶，将需要分离的混合物分散其中，然后通过施加电场，使带电的物质在介质中发生迁移。
迁移的速率取决于物质的特性，如电荷量、荷质比、形状、大小等。
在毛细管电泳中，将待分离的物质溶解在背景电解液中，然后将其注入至两端通电的毛细管中。
施加电场后，带电的溶液分子会在电场力的作用下在毛细管内迁移，迁移速率与物质的荷质比有关。
由于不同物质的荷质比不同，它们在电场中的迁移速度也不同，从而实现分离。
凝胶电泳则是将待分离的物质溶解在凝胶中，通过施加电场使其在凝胶内迁移。
凝胶可以是聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等，其主要作用是形成孔隙结构，以便分子在其中迁移。
由于不同物质在凝胶中的迁移速率不同，它们会在电场作用下逐渐分离开来。
总之，电泳分离原理是基于物质在电场中的迁移速率差异实现
的分离技术。
通过控制电场和选择合适的分离介质，可以实现对具有不同特性的物质的高效分离。
10%_sds-page凝胶电泳中分离,并将分离的蛋白转移至pvdf膜__概述说明以及解释
10% sds-page凝胶电泳中分离,并将分离的蛋白转移至pvdf膜概述说明以及解释1. 引言1.1 概述本文旨在探讨利用10% SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，并将这些分离的蛋白转移到PVDF膜上的方法与原理。
SDS-PAGE凝胶电泳是一种常用的蛋白质分析技术，通过该技术可以将复杂的蛋白质混合物按照其分子量进行分离。
而将分离的蛋白质转移到PVDF膜上则能够方便地进行后续的免疫检测和其他进一步分析。
1.2 文章结构本文共包含五个部分。
引言部分主要对研究内容进行概述，明确文章的目的和主题。
第二部分将详细介绍SDS-PAGE凝胶电泳技术的原理、凝胶制备与样品装载、电泳条件设定和运行等。
第三部分将阐述蛋白转移至PVDF膜的方法与原理，包括选择PVDF膜及转印装置，并提供操作步骤以及转印条件优化等相关信息。
第四部分将对实验结果进行解读和讨论，包括对SDS-PAGE凝胶上蛋白质分离的结果进行分析，评估和讨论PVDF膜上蛋白转移的情况及其影响因素。
最后，第五部分将总结研究内容和发现，并对研究结果提出启示和展望。
1.3 目的本文的目的是介绍SDS-PAGE凝胶电泳技术在蛋白质分离中的应用，以及将分离的蛋白质转移到PVDF膜上的方法与原理。
通过深入研究这些实验技术和步骤，我们可以更好地理解SDS-PAGE凝胶电泳和PVDF膜转印的工作原理，为科学研究提供有效手段，并拓展其在生物医学领域等其他相关研究中的应用前景。
2. SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白2.1 SDS-PAGE凝胶电泳原理SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）是一种常用的蛋白质分析方法，它基于蛋白质的分子大小和电荷差异，将混合的蛋白质样品在聚丙烯酰胺凝胶中进行分离。
该方法主要依赖于SDS（十二烷基硫酸钠，即十二烷基硫酸钠），一种带有负电荷的表面活性剂。
在SDS-PAGE中，蛋白质样品首先经过加入SDS、还原剂（如巯基乙醇）和热处理，使得蛋白质完全解聚为带有相同比例的亚单位，并使其具有近似均一的线性形式。
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解质有清晰的界面。电泳开始后，带电粒子向另一极
（正极）移动，泳动速度最快的离子走在最前面，其
他离子依电极速度快慢顺序排列，形成不同的区带。
只有第一个区带的界面是清晰的，达到完全分离，其
中含有电泳速度最快的离子，其他大部分区带重叠。
9
电泳技术
电泳种类II ：
区带电泳
是在一定的支持物上，于均一的载体电解质 中，将样品加在中部位置，在电场作用下，样品 中带正或负电荷的离子分别向负或正极以不同速 度移动，分离成一个个彼此隔开的区带。区带电
丙烯酰胺凝胶电泳;
(4)丝线电泳:如尼龙丝,人造丝电泳 。
12
电泳技术
区带电泳2
按支持物的装置形式不同,区带电泳可分为: (1) 平板式电泳:支持物水平放置,是最常用的 电泳方式;
(2) 垂直板电泳:聚丙烯酰胺凝胶可做成垂直
板式电泳.
(3) 柱状(管状)电泳:聚丙烯酰胺凝胶可灌入适
当的电泳管中做成管状电泳.
电荷移动规律
电泳技术
利用电泳可以确定胶体微粒的电性质，向阳极移动的 胶粒带负电荷，向阴极移动的胶粒带正电荷。
一般来讲，金属氢氧化物、金属氧化物等胶体微粒吸 附阳离子，带正电荷；
非金属氧化物、非金属硫化物等胶体微粒吸附阴离子， 带负电荷。
因此，在电泳实验中，氢氧化铁胶体微粒向阴极移动， 三硫化二砷胶体微粒向阳极移动。利用电泳可以分离 带不同电荷的溶胶。
电泳技术
1
电泳技术
前 言
1937年，瑞典科学家Tiselius设计了世界上第一台电泳 仪，建立了移界电泳法，并于1948年荣获诺贝尔奖。70
年以来，电泳技术围绕制胶、电泳、染色三个技术环节，
不断改进，以实现下列目标： 1、提高分辨率及灵敏度。 2、简化操作，缩短电泳时间。 3、扩大应用范围。
各类电泳技术已广泛应用于生命科学各个领域。
13
电泳技术
区带电泳3
按pH的连续性不同,区带电泳可分为: (1)连续pH电泳:电泳的全部过程中缓冲液pH保 持不变。如纸电泳,醋酸纤维素薄膜电泳;
(2)非连续pH电泳:缓冲液和支持物间有不同的
pH，如聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳;
14
电泳技术
电泳的基本原理
生物大分子如蛋白质,核酸,多糖等大多都有阳离 子和阴离子基团,称为两性离子.常以颗粒分散在 溶液中,它们的静电荷取决于介质的H+浓度或与 其他大分子的相互作用.在电场中,带电颗粒向阴 极或阳极迁移,迁移的方向取决于它们带电的符
电泳技术
电泳特点
在确定的条件下，带电粒子在单位电场强度作 用下，单位时间内移动的距离（即迁移率）为 常数，是该带电粒子的物化特征性常数。
不同带电粒子因所带电荷不同，或虽所带电荷 相同但荷质比不同，在同一电场中电泳，经一 定时间后，由于移动距离不同而相互分离。分
6
开的距离与外加电场的电压与电泳时间成正比。
4
Arne Wilhelm Kaurin Tiselius
电泳技术 阿恩· 威廉· 考林· 提塞留斯 提塞留斯是瑞典著名生化学家 和物理化学家。1902年8月10日 出生在斯德哥尔摩，在乌普沙拉 大学获三个硕士和一个博士学位， 毕业后留校任教。 他改进、设计了电泳仪，成功 地分离了血清中的蛋白质，对氨 基酸和肽也作了分离研究，改进 了色层分离法，他设计的电泳仪 至今还在应用，发展了生物化学 的研究手段，荣获1948年诺贝尔 化学奖。 他还多年担任诺贝尔基金评审 的委员，副会长和会长之职。 1971年10月29日因心脏病突发 而卒于家中，终年69岁。
时，其净电荷为零，泳动速度下降到零，具有不同等
电点的物质最后聚焦在各自等电点位置 ，形成一个个
清晰的区带，分辨率极高。
11
电泳技术
区带电泳1
按支持物的物理性状不同,区带电泳可分为: (1)滤纸为支持物的纸电泳; (2)粉末电泳: 如纤维素粉,淀粉,玻璃粉电泳;
(3)凝胶电泳:如琼脂,琼脂糖,硅胶,淀粉胶,聚
泳按支持物的物理性状不同，又可分为纸和纤维
膜电泳、粉末电泳、凝胶电泳与丝线电泳等。
10
电泳技术
电泳种类III：
等电聚焦电泳 是将两性电解质加入盛有pH梯度缓冲液的电泳槽 中，当其处在低于其本身等电点的环境中则带正电荷， 向负极移动；若其处在高于其本身等电点的环境中， 则带负电向正极移动。当泳动到其自身特有的等电点
2
电泳技术
电泳
定义1： 液体介质中带电的胶体微粒在外电场作用下相对 液体的迁移现象。 定义2： 依据分子或颗粒所带的电荷、形状和大小等不同， 因而在电场介质中移动的速度不同，从而达到分 离的技术。 定义3： 带电物质或细胞在电场中的泳动。根据大分子或 颗粒的电荷、大小和形状不同，使其在通过电场 中的凝胶或介质时发生分离的方法。
使其应用十分广泛。电泳技术除了用于小分子物质的分离分 析外，最主要用于蛋白质、核酸、酶，甚至病毒与细胞的研 究。由于某些电泳法设备简单，操作方便，具有高分辨率及 选择性特点，已成为医学检验中常用的技术。
8
电泳技术
电泳种类I ：
移动界面电泳
是将被分离的离子（如阴离子）混合物置于电泳
槽的一端（如负极），在电泳开始前，样品与载体电
7
电泳技术
应用领域
1809年俄国物理学家Peнce首先发现了电泳现象，但直到 1937年瑞典的Tiselius建立了分离蛋白质的界面电泳
（boundary electrophoresis）之后，电泳技术才开始应用。
本世纪60-70年代，当滤纸、聚丙烯酰胺凝胶等介质相继引
入电泳以来，电泳技术得以迅速发展。丰富多彩的电泳形式
3电场作用下，向着与其电性相反的 电极移动，称为电泳(electrophoresis, EP)。
利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分
离的技术称为电泳技术。
1937 年瑞典学者 A.W.K.提塞留斯设计制造了
移动界面电泳仪 ，分离了马血清白蛋白的3种
球蛋白，创建了电泳技术。
号.
15
电泳技术
影响电泳的因素
1. 电泳介质的pH值 溶液的pH值决定带电物质的解离程度,也决定物质 所带净电荷的多少.对蛋白质,氨基酸等类似两性电解 质,pH值离等电点越远,粒子所带电荷越多,泳动速度越快, 反之越慢.因此,当分离某一种混合物时,应选择一种能扩 大各种蛋白质所带电荷量差别的pH值,以利于各种蛋白 质的有效分离.为了保证电泳过程中溶液的pH值恒定,必 须采用缓冲溶液.