实验四 肌肉组织氨基移换作用---纸层析
生物化学实验-氨基移换反应及其产物的鉴定
实验七 氨基移换反应及其产物的鉴定
丁鸣
一.实验目的和要求
1.学习鉴定氨基移换反应的简便方法及其原理；
2.学习纸层析的原理和操作技术。
二.实验基本原理
1.氨基移换反应： 在氨基移换酶（转氨酶)的催化下，氨基酸的α-氨基和α-酮酸的α-酮基之间发
生的互换反应。 转氨酶的种类很多，任何一种氨基酸进行转氨作用时都由其专一的转氨酶催
⑻ 显色剂（0.1%茚三酮-乙醇溶液）。
四.实验器材与仪器
⑴ 研钵或匀浆器:1套/每组（2人）；
⑵ 试管及试管架:1套/每组（2人）；
⑶ 恒温水浴箱（37℃、100℃）；
⑷ 铅笔、尺和圆规（学生自备）；
⑸ 毛细管（直径0.5mmபைடு நூலகம்；
⑹ 新华定性滤纸（直径11cm）；
⑺ 剪刀和镊子:各1把/每组（2人）；
取4支洁净、干燥的试管，按表1操作表1
管号 作 转氨酶提取液 0.25%碘乙酸
预温
试剂、操
（ml） （ml）
0. 1mol/L α－丙氨酸 pH8.0（ml） 0. 1mol/L α－酮戊二酸 pH8.0（ml） 0.01mol/L 磷酸缓冲液 pH8.0 （ml） 酶促反应 终止酶反应
1
2
3
4
1
1
2cm
5.5cm
1cm
3cm
用铅笔作出点样位置
用铅笔尖在圆心处截一小孔
“灯芯”制作
⑵ 点样：用毛细管依次点标准α-丙氨酸(Ala)、 谷氨酸(Glu)各点2次，其 余1－4号管样液各点2～3次。点样时，要待前次点样干燥（可用电吹风 吹干）后方可再次点样，点样直径不超过0.3cm。
1
2
3
6
实验四-氨基酸的纸层析法
姓名：郭沈杰年级专业：2012级生物科学同组者：蔡萍萍学号：12050011012实验四氨基酸的纸层析法一、实验目的了解并掌握氨基酸纸层析法的原理和方法。
二、实验原理以滤纸为支持物的层析法，称为纸层析法。
纸层析所用展层剂大多由水和有机溶剂组成。
展层时，水为固定相，它与滤纸纤维亲和力强；有机溶剂为流动相，它与滤纸纤维亲和力弱。
有机溶剂在滤纸上又下向上移动的，称为上行法；有上向下移动的，称为下行法。
将样品在滤纸上确定的原点处展层，由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配，且他们的分离系数各不相同，所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相同，于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来，形成距原点不等的层析点。
在一定条件下（室温、展层剂的组成、滤纸的质量、PH值等不变），不同的氨基酸有固定的移动速率（R f值）R f=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离混合氨基酸做样品时，如果只用一种溶剂展层，由于某些氨基酸的移动速率相同或相近，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，可将滤纸旋转90度，以第一次所的层析点为原点，在用另一溶剂展层，从而达到分离的目的。
这种方法称为双向层析法。
氨基酸无色，利用茚三酮反应，可将氨基酸层析点显色作定性、定量用。
本实验主要介绍的是单向层析法。
其中混合氨基酸有精氨酸、苯丙氨酸。
三、实验仪器1、新华滤纸2、层析缸3、细线4、点样管5、橡皮筋6、电吹风7、喷雾器8、铅笔9、直尺四、实验试剂1、精氨酸、苯丙氨酸、混合氨基酸（精氨酸、苯丙氨酸）2、展层剂：正丁醇：12%氨水：95%乙醇：蒸馏水=13：3：3：1（v:v）3、0.5%茚三酮—无水丙酮溶液：0.5g茚三酮溶于100ml无水丙酮，贮于棕色瓶中五、实验步骤1、取滤纸剪成20×10厘米的滤纸条一张，在一端打孔，系一根细线，在另一端2~3cm处用铅笔画一横线，在上面相同间隔画3圆点（原圈直径约5mm）。
2、取毛细管3支，分别吸取精氨酸、苯丙氨酸、氨基酸混合液少许，在原圈处点样，样点。
实验十一(二)：氨基移换反应(纸层析)
实验十一：肝脏组织中转氨酶活性的测定（二）：纸层析分析一、实验目的1.学习用纸层析法测定转氨基作用，检验上次实验的结果。
二、实验原理(略)三、实验试剂：1、1%谷氨酸2、1%丙氨酸3、1号试管提取物4、2号试管提取物5、层析液四、实验步骤：1、点样：取一圆形滤纸，在滤纸中心位置剪一小孔（直径1-2mm）,以圆心为中心画直径为1cm的圆作为点样的底线；在圆周上等距离点4个点，标注为1、2、3、4；分别用4支牙签（或枪头）在4个点上点样，样品依次为：标准谷氨酸溶液、标准丙氨酸溶液、样品1、样品2；用吹风机吹干后，可重复点样2-3次，如果第一次点样足够多，一次就可，每个样点的大小最好不超过3mm，四个点大小尽量一致。
2、做滤纸筒状刷：吸附层析液。
3、扩展剂：取小培养皿1个，加入苯酚-水扩展剂（高度0.5cm左右）；将小培养皿置于一个大培养皿中。
4、层析：将滤纸筒状刷直立于装有层析液的小培养皿中，并将筒状刷的上头插入滤纸中心的小孔内（不要高出滤纸表面，高出部分剪去），滤纸通过此筒状刷与层析液相连。
将滤纸平放在含有饱和酚溶液的培养皿上，并用上下一样大小的培养皿盖在滤纸上，酚溶液由滤纸小孔向四周扩展。
当酚溶液扩展到距离纸边沿1.5cm时，取出滤纸。
用铅笔画下酚溶液扩展的边沿，吹干。
5、显色：喷水合茚三酮溶液，加热显色。
标出各显色点，计算各点的Rf值。
五.结果分析：(1)用铅笔将层析色谱轮廓和显色点的中心点描出来；(2)测量原点至色谱中心和至溶剂前沿的距离，计算各种氨基酸色谱的 Rf 值。
(3)分析谷氨酸和丙酮酸之间是否进行了转氨基作用，并写出相关的反应式。
生物化学实验 转氨酶的提取氨基移换反应与纸上层析
生物化学实验转氨酶的提取氨基移换反应与纸上层析生物化学实验--转氨酶的提取、氨基移换反应与纸上层析实验三转氨酶的提取、氨基移换反应与纸上层析一、实验目的1、1.学习一种鉴定氨基移换作用的简便方法及其原理。
2.学习用纸层析法测定转氨基作用。
3、介绍氨基移换促进作用在中间新陈代谢中的意义。
二、实验原理、氨基移换酶也称转氨酶，它能催化α-氨基酸的氨基与α-酮酸的α-酮基互换，形成新的α-氨基酸与新的α-酮酸的作用.这种作用称为氨基移换作用。
它在生物体内蛋白质的合成与分解等中间代谢中，在糖、脂肪、蛋白质三类物质代谢的相互联系、相互转化上都起着很重要的作用。
任何一种氨基酸进行转氨作用时，都由其专一的转氨酶催化。
它们的最适ph接近7.4。
在各种转氨酶中，以谷氨酸草酰乙酸转氨酶(简称谷草转氨酶、got)及谷氨酸丙酮酸转氨酶(简称谷丙转氨酶、gpt)活力最强。
上述两种酶均广为存有于生物机体中，在正常人血清中也存有少量存有。
机体出现肝炎、心肌梗塞炎症时，血清联运氮酶活力明显减少，在临床上转氨酶活性的测量存有关键意义。
测量转氨酶活性的方法很多，例如分光光度法，纸上层析法及光电比色法等。
在氨基酸分解代谢中，联合脱氨基作用是大多数氨基酸的主要代谢方式，通过转氨基作用与谷氨酸氧化脱氨基作用偶联而完成。
此过程可用下式表示:植物中多种氨基酸是通过转氨基作用合成的。
纸层析：就是以滤纸做为支持物的分配层析法，就是20世纪40年代发展出来的一种生化拆分技术。
由于设备直观，操作方式便利，所须要样品量太少，分辨力较低等优点而广为的用作物质的拆分，并可以展开定性和定量的分析。
缺点就是进行时间较长。
分配层析法：是利用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的分配系数不同，而达到分离的目的的一种实验方法。
在一定条件下，一种物质在某种溶剂系统中的分配系数是一个常数即α=溶质在固定相的浓度/溶质在流动相的浓度。
溶剂系统：由有机溶剂和水组成，水和滤纸纤维素有较强的亲和力，因而其扩散作用降低形成固定相，有机溶剂和滤纸亲和力弱，所以在滤纸毛细管中自由流动，形成流动相，由于混合液中各种氨基酸的分配系数值不同，其在两相中的分配数量及移动速率（即迁移率rf值）就不同，从而达到分离的目的。
氨基移换作用实验报告
氨基移换作用实验报告实验报告氨基移换作用实验报告——以乙醇胺和乙酸异丁酯为例实验目的：1. 了解氨基移换反应的基本特征；2. 继续熟悉常用有机合成反应中的分离纯化技术。
实验原理：氨基移换反应是一种重要的有机合成反应。
在反应中，一个羧酸酯和一个胺类化合物经过反应可以形成一个新的酯类化合物和一个胺类化合物。
反应的机理如下：首先，酯中的羰基与胺中的氮原子反应生成一个极性复合物，接着，羰基和氮原子之间的单键断裂并生成一个中间体─有机酸水解反应中的酸性中间体。
最后，中间体于胺中的氮原子进行质子交换生成酯类和胺。
实验步骤：1. 取样装置：分别取两个干净的干燥试管，在每个试管中加入5.0 mL 乙酸异丁酯和5.0 mL 乙醇胺，并轻轻混合试管中反应溶液。
在实验中，咪唑可用作中间体。
2. 氮气通入：两个试管的溶液分别用氮气冲洗3分钟以上。
3. 恒温加热法：将两个试管放入一个恒温水浴中并加热至回流状态，反应时间为1小时。
4. 分离提纯：反应结束后，用10.0 mL的饱和氯化钠水溶液混合以上试管中的反应液。
然后加入10.0 mL的丙酮分液漏斗中。
放置在常温下,振荡分离，取得上层有机相後，将分离采得的溶液放置于的蒸馏器中。
蒸馏出有机物，得到色为棕色的油状物乙酸异丁酯。
5. 得到产物：乙酸异丁酯样品分别澄清，加入2 ~ 3 滴氢氧化钠试液。
对原反应物和产物皆施以酸碱反应，观察沉淀现象，以判断纯度并得到产物。
实验结果：实验中，乙酸异丁酯和乙醇胺均有大量的揮发性，并且氢键的性质使得两者在水溶液中难以充分混合，因此在ND通入气的过程中需要严格去除水气份，且整个实验过程要保持干燥。
在实验过程中，我们注意到在试管中反应溶液的颜色是发生了明显的变化的。
经过反应后，有机相变得更加显眼并呈现出深褐色。
最终得到了棕色的电子杂质过滤器。
实验结论：乙酸异丁酯和乙醇胺在反应中的氨基移换反应是一种可行的有机反应。
通过在实验中的各道操作，得到了棕色的电子杂质过滤器，并成功地提取出乙酸异丁酯。
生物化学实验：氨基酸移换反应
@ 纸上层析分离氨基酸
₤在15cm直径的圆形滤纸中心剪一个小圆孔。 ₤取一滤纸卷成圆筒，用剪刀将该圆筒状的滤纸的下端沿纵
向剪为灯刷状，而滤纸的上端插入至15cm直径的圆形滤纸的 小圆孔中。
₤圆筒装的滤纸灯刷状的一端放在盛有层析剂的培养皿中，
灯刷状的滤纸和层析剂（流动相）相接触。
层析剂：尿素：无水乙醇：水[：茚三酮]
转氨酶催化。
ʺ它们的最适pH接近7.4。在各种转氨酶中，以谷氨
酸—草酰乙酸转氨酶（简称谷草转氨酶、GOT）及 谷氨酸—丙酮酸转氨酶（简称谷丙转氨酶、GPT） 活力最强。
ʺ上述两种酶均广泛存在于生物机体中，在正常 人血清中也有少量存在。机体发生肝炎、心肌 梗塞病变时，血清中转氮酶活力显著增加。
ʺ本实验利用纸层析法，检查由谷氨酸和丙酮酸
30%乙酸
5滴
5滴
100℃ 10min,流水冷却,过滤取滤液
ʺ 纸上层析法检查
@ 点样
₤取15 cm直径的圆形滤纸，在圆心处用圆规划一个3.0cm的 同心圆。
₤在同心圆的圆周上取4个点， 每个点的距离相近，为点样 的位置。
₤用4支毛细管口分别取样品和对照的滤液，以及标准谷氨酸
和丙氨酸，再轻轻触到4个点样的位置上，使每种溶液分别 形成直径为2-3mm的圆斑，每次点样后，自然风干或吹风机 吹干，再点下一次，重复3-4次。
➢ (8) 标准丙氨酸溶液(0.1%) ➢ (9) 标准谷氨酸溶液(0.1%) ➢ (10)0.1%水合茚三酮乙醇溶液 ➢ (11)层析剂：尿素：无水乙醇：水 [：茚三酮]
= 0.5 g: 80 ml: 20 ml [: 0.1g] 。
➢ 2. 器材 ➢ (1) 解剖刀、剪及镊子。 ➢ (2) 解剖盘。 ➢ (3) 表面皿。 ➢ (4) 匀浆器。 ➢ (5) 台秤。 ➢ (6) 离心管和离心机（台式） ➢ (7) 试管及试管架 ➢ (8) 恒温水浴 ➢ (9) 毛细玻璃管
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2、掌握氨基酸纸层析的操作原理。
（二）实验原理：转氨基作用是氨基酸代谢过程中的一个重要反应，在转氨酶的催化下，氨基酸的а-酮酸与α-酮基的互换反应称为转氨基作用。
转氨基作用广泛地存在于机体各组织器官中，是体内氨基酸代谢的重要途径。
氨基酸反应时均由专一的转氨酶催化，此酶催化氨基酸的α－氨基转移到另一α－酮基酸上。
各种转氨酶的活性不同，其中肝脏的丙氨酸氨基转移酶（ALT）催化如下反应：α—酮戊二酸 + 丙氨酸谷氨酸 + 丙酮酸本实验以丙氨酸和α-酮戊二酸为底物，加肝匀浆保温后，用纸层析法检查谷氨酸的出现，以证明转氨基作用。
纸层析属于分配层析。
以滤纸为支持物，滤纸纤维与水亲合力强，水被吸附在滤纸的纤维素的纤维之间形成固定相。
有机溶剂与水不相溶，把预分离物质加到滤纸的一端，使流动溶剂经此向另一端移动，这样物质随着流动相的移动进行连续、动态的不断分配。
由于物质分配系数的差异，而使移动速度就不一样，在固定相中，分配趋势较大的组分，随流动相移动的速度就慢，反之，在流动相分配趋势较大的成分，移动速度快，最终不同的组分彼此分离，物质在纸上移动的速率可以用比值Rf表示： ????ALT物质在一定的溶液中的分配系数是一定的，故比值Rf也相对稳定，因此在同一层析体系中可用Rf值来鉴定被分离的物质。
（三）实验材料与仪器：试剂：1、0.01mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液。
2、0.2mol/L Na2HPO4溶液81ml与0.2mol/L NaH2PO4溶液19ml混匀,用蒸馏水稀释20倍。
转氨基作用(纸层析法,Paper Chromatography)
转氨基作用（纸层析法,Paper Chromatography）一．目的了解动物组织的转氨基作用，学习转氨基反应产物的纸层析鉴定方法。
二．原理氨基酸在体内分解代谢的主要方式是脱氨基作用。
脱氨基作用的主要方式有氧化脱氨基、转氨基、联合脱氨基及非氧化脱氨基。
转氨基是指在转氨酶的催化下，氨基酸的α-氨基与α-酮酸的α酮基的互换反应。
转氨酶广泛分布于动物体的各器官组织中，各种转氨基作用都有专一的转氨酶催化。
本实验将谷氨酸和丙酮酸与肝匀浆一起保温，在肝细胞的丙氨酸转氨酶催化下产生丙氨酸。
利用纸层析法鉴定丙氨酸的存在，证明组织内的转氨基作用。
为了防止底物丙酮酸被组织中其它酶所氧化或还原，可加碘乙酸（或溴乙酸）抑制糖的酵解作用和氧化作用。
结果：丙氨酸和α酮戊二酸没有反应产物用纸层析法鉴定转氨基产物丙氨酸的存在与否。
原理为：谷氨酸和丙氨酸是理化性质不同的两种氨基酸，前者为亲水性氨基酸，后者为疏水性氨基酸，据此二者在固定相（水）与流动相（酚试剂）中的分配程度不同，因而流速不同。
最后用茚三酮显色。
三．材料（一）仪器试管；离心管；离心机；剪刀及镊子；培养皿；表面皿；毛细管；喷雾器；吹风机。
（二）试剂1．0.1%丙氨酸溶液2．1%谷氨酸溶液3．1%丙酮酸钠溶液4．0.25%碘乙酸溶液5．0.01 mol/LpH7.4磷酸缓冲液6．0.1%茚三酮乙醇溶液7．层析溶剂（酚的饱和水溶液）四．方法（一）肝匀浆的制备取新鲜动物肝脏1克，置研钵中剪碎，加细砂少许，5ml预冷的0.01 mol/LpH7.4磷酸缓冲液，研磨成匀浆。
(二)转氨基反应1．取小试管2支，分别标明测定和对照，各加肝匀浆10滴，将对照管立即置沸水浴中10分钟，取出冷却。
2．两管各加1%谷氨酸10滴，1%丙酮酸钠 10滴，0.25%碘乙酸5滴，置4 0℃水浴中保温30分钟后取出。
3．两管各加5%三氯醋酸2滴，置沸水浴中5分钟（2000rpm），将上清液分别移入同样编号的小试管中备用。
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COOH CH－NH2 CH2 CH2 COOH ＋ COOH C=O CH3
α-酮戊二酸
丙氨酸
谷氨酸
丙酮酸
2. 层析
层析系统通常都有两个相组成：固定相和流动相。
混合物在层析系统中的分离决定于该混合物的组分 在这两相中的分配情况，一般用分配系数来描述。
常用的分配层析包括柱层析、纸层析、薄层层析。
纸层析法
肌肉组织氨基移换作用 （纸层析法）
一、实验目的
1. 了解氨基移换作用的原理。
2. 熟悉纸层析法的基本原理。 3. 掌握纸层析法分离鉴定氨基酸的方法。
二、实验原理
氨基移换作用（转氨基作用）
在转氨酶的作用下，某一氨基酸去掉α-氨基生成相 应的α-酮酸，而另一种α-酮酸得到此氨基生成相应的氨基 酸的过程。
4、显色
把层析后的滤纸取下，吹风机吹干后，用喷雾器
均匀喷洒0.5％茚三酮溶液，再用吹风机吹干。
四、实验结果
计算各个色斑的Rf值
五、结果分析
分析色斑的成分以及是否发生氨基移换反应
固定相：吸附在滤纸纤维之间的水分
流动相：层析液水饱和酚
谷氨酸：亲水性氨基酸 丙氨酸：疏水性氨基酸 分离原理： 利用混合物各组分在固定相和流动相中分配系数 差异而分离
3. 显色反应
茚三酮与α-氨基酸反应生成紫红色化合物
相对迁移率Rf
三、实验步骤
1、酶液的制备
2、氨基移换反应
加入物（ml） 肌匀浆 0.1 mol/L丙氨酸溶液 对照管 10滴
人体内最重要的两种转氨酶：
谷丙转氨酶（GPT）/丙氨酸转氨酶（ALT）
谷氨酸 +丙酮酸
GPT
α-酮戊二酸 +丙氨酸
谷草转氨酶（GOT）/天冬氨酸转氨酶（AST） 谷氨酸 +草酰乙酸
GOT
α-酮戊二酸 +天冬氨酸
正常人各组织中GPT及GOT 活性 (单位/克湿组织)
组织 GPT GOT 组织 GPT GOT
煮沸 5 min
0.5 ml
测定管 10滴
37 ℃ 5 min
0.5 ml
0.1 mol/Lα-酮戊二酸溶液
0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液
0.5 ml
1.5 ml
0.5 ml
1.5 ml
混匀， 37 ℃ 50 min
煮沸5 min
3、层析
圆滤纸上标记 点样 制作滤纸芯 滤纸芯插入圆滤纸
组装层析装置
肝
肾 心 4800 91000 156000 99000
胰腺
脾 肺 血清
2000 28000
1200 700 16 14000 10000 20
血清转氨酶活性，临床上可作为疾病诊断和预
后的指标之一。
COOH CH2 CH2 C=O COOH ＋ COOH H－C－NH2 CH3 ALT