冰冻切片制作与染色过程中常见问题与处理
冰冻切片制作与染色过程中常见问题与处理
• 切片判读正确-反映真实的科学现象
• 知识结构背景
• 组织学结构的熟悉…… • 认识病理改变：炎细胞侵润、坏死、水肿、蛋白变性、纤维化、增 生、凋亡…… • 审美观、拍照角度、视野、曝光时间、对比度……
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– 常规HE染色 – 特殊染色
• 如：Masson(Thichrome staining)，油红O，尼氏染色， 台盼蓝（肥大细胞）染色
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(1) 所有切片呈阴性
1）染色未完全严格按照操作步骤进行 2）漏加一种抗体，或抗体失活 3）缓冲液内含叠氮化钠，抑制了酶的活性 4）底物中所加H2O2 量少或失活 5）复染或脱水剂使用不当
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（2）所有切片呈阳性反应，其原因：
①切片在染色过程中抗体过浓，或干片了。 ②缓冲液PH值不准确，洗涤不彻底。 ③使用已变色的显色底物溶液，或显色反 应时间过长。 ④抗体温育的时间过长。
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4. 染色：抗体孵育和选择: 免疫组化最关 键环节
试剂公司提供标准化的试剂
• 组织固定时
– 固定液要有足够的量(固定液是组织体积的8-10倍) – 保持一定时间，快速灌注固定后，相同的固定剂再固定 2-4h（ 4℃冰箱）
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减少冰晶的形成
• 公认：未经固定的组织切片冰晶较多 • 固定后的组织切片仍然会有一定的冰晶， 为防止冰晶的形成 • 采取如下方法
冷冻切片常见问题与解决方法
冷冻切片常见问题与解决方法叶敏;刘尽国;赵兰香;张杰【期刊名称】《临床与实验病理学杂志》【年(卷),期】2013(029)009【总页数】2页(P1030-1031)【关键词】冷冻切片;取材;包埋;发白;染色【作者】叶敏;刘尽国;赵兰香;张杰【作者单位】上海市胸科医院病理科,200030;上海市胸科医院病理科,200030;上海市胸科医院病理科,200030;上海市胸科医院病理科,200030【正文语种】中文【中图分类】R361.2术中冷冻切片是目前临床病理检查中最常用的快速制片方法之一。
其是在低温下将新鲜组织冷冻至一定硬度，然后再进行切片的制片方法。
由于低温时组织细胞会损伤、组织细胞着色力差及短时间内快速出片等因素的影响，制片过程中常会出现空洞和冰晶、组织细胞变形和皱缩、切片染色背景不清晰、颜色对比不协调、发白等问题。
现将上述问题及处理方法讨论如下。
1 常见问题与解决方法［1］1.1 冷冻切片出现空洞和冰晶现象(图1) (1)原因:组织内有过多水分，脱水不过关、取材时遇到水，冷冻时间过长，组织冷冻的温度过低。
(2)对策:①取材大小、厚薄要适宜，过大、过厚影响冷冻速度。
②新鲜组织应避免遇水，取材器械干燥洁净，若组织本身带水或血较多，用滤纸把水或血吸干。
取材后需用合成胶水或OCT 作组织块包埋剂，进行包埋。
合成胶水和OCT 均具有黏稠性和渗透性，能将组织牢固地固定在冷冻头上。
③冷冻时间要短，只有速冻才能减少组织内冰晶的形成，最好将速冻头压在组织上，冻好后便可切片，对容易形成冰晶的肌肉、脑组织应采取干冰或液态氮冷冻，以减少冰晶形成。
④以冷冻切片机设置的温度(冷冻头OT 为－25 ℃，CT 为－20 ℃)为宜。
温度太低，组织容易变脆、变硬，切片易出现空洞现象。
1.2 组织破碎或形成空洞现象(图2) (1)原因:组织冷冻时间过长;组织比较硬、脆。
(2)对策:可用手贴在组织上或用嘴向组织哈气稍加温使其软化即可切出完整的切片。
冷冻切片常见问题分析与预防
冷冻切片常见问题分析与预防骆新兰收稿日期:1998 03 30作者单位:广东省人民医院病理科,广州 510080作者简介:骆新兰,男,30岁,技师冷冻切片是借助低温使组织冻结达到一定的硬度进行切片的一种方法。
它是术中诊断的一种重要方法。
但由于各种原因,影响冷冻切片的质量,拖延病理报告发出的时间,直接影响着病理诊断的及时性、准确性,间接影响着病人的预后。
归结起来有以下几方面。
1 切片不全或不能切片切片不全是指切出的切片组织切面不完整、有缺损现象;不能切片是指组织块的温度过高或过低不能制作一张完整的切片。
切片不全直接影响着冷冻报告切片的准确性。
导致切片不全或不能切片的常见的原因有几下几方面。
1 1 组织内含过多的脂肪或坏死组织 脂肪或坏死组织较一般的组织冷冻的温度要低些,当活组织达到所需的温度时,其还比较软,从而影响切片的完整性和拖延冷冻报告发出的时间。
1 2 组织块过冷 组织冷冻过度易致切片破碎或呈粉沫状,不能制作一张完整的切片。
1 3 组织块冷冻不均匀 在配合使用液氮时,组织块放入液氮时不能保持水平状态且液氮量不足的情况下,可产生此现象。
1 4 冻头的温度不足 冷冻切片时要求冻头的温度保持在-25 ~-30 左右,冻头的温度达不到要求时,组织很快回软,也不能保证切片的完整。
1 5 组织块过大 预防与处理: 注意组织的性质。
冷冻切片的组织除了要保持新鲜外,还应注意避免组织内含过多的脂肪(脂肪组织除外)及坏死组织。
!组织大小要适中。
冷冻切片机内切片刀移动的范围有一定的限制,超出其范围时,易致切片不全。
一般情况下,冷冻切片的组织块大小1cm ∀1cm ∀0 3cm,但卵巢肿瘤及脂肪组织可稍为大些。
另外,包埋时,应将组织平放在冻头的中央。
#掌握好冷冻时间。
根据组织块的大小、性质,确定冷冻时间,一般13~17s(使用液氮者),若组织较大或脂肪组织时间可适当长些,而甲状腺、脑组织和淋巴结等冷冻的时间相对要短些。
术中冷冻切片的规范化操作及常见问题分析
术中冷冻切片的规范化操作及常见问题分析摘要】目的：优化冰冻切片技术，提高术中病理诊断的准确率。
方法：收集2014～2015年期间本院病理科冰冻切片2000余例，重新阅片，分析讨论发现的问题及原因。
结果：不规范的冰冻切片操作严重影响冰冻切片。
结论：规范化操作可以提高病理诊断的科学性、可靠性。
【关键词】冰冻切片；规范化操作；病理诊断【中图分类号】R636 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2016）06-0205-02术中冷冻切片是目前病理科最为常用的快速制片方法之一，它是借助低温冷冻将手术切除标本的组织块快速冷冻达到一定硬度进行切片的一种方法[1]。
高质量的冷冻切片对于确保术中病理诊断的科学性、可靠性具有极其重要的作用，从而有效降低术中病理诊断的风险。
1.材料与方法1.1 取材送检标本要及时、新鲜，不能沾水和放入固定液，特别是脑组织避免用生理盐水纱布包裹。
取材时尽量避开组织坏死出血区，剔除不必要的脂肪组织、毛发及钙化物等。
细小组织全取材，大组织的取材大小在1.5cm×1.5cm×0.2cm，以厚度不超过0.3cm为宜。
1.2 包埋包埋冻头使用后应用纸巾擦干净后放在冷冻切片机的冷冻台上预冷。
根据组织的特性及医生要求来确定包埋方向，囊壁组织可卷曲成团，皮肤和管腔样组织应立埋。
包埋剂应适量，大块组织可直接放置于滴加包埋剂的组织托上，再用冷冻锤压在组织块上，使其上下一起迅速制冷，既缩短冷冻的时间，又使组织块十分平整，利于切片。
小组织（如穿刺、切缘等组织）包埋时应先滴加少许包埋剂在组织托上，等包埋剂渐渐发白，再将小组织放在组织托上，再用冷冻锤压，避免应切片不完整而导致病理漏诊。
1.3 切片包埋后组织的冷冻是整个冷冻切片十分关键的步骤之一，冷冻的好坏直接影响到切片的质量。
在实践中，我们总结了不同组织的最佳冷冻温度（表1）。
冻好的组织块应先进行粗修，暴露组织的最大面后再进行切片，切片时用力均匀。
冰冻切片各流程常用方法
冰冻切片各流程常用方法下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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冷冻切片常遇到的问题及解决对策
3 冻切片机工作室温度的设置 根据器官组织形态结构和 组成成分的 不同, 切片时 要相应 调 整切片机工作室温度, 我们在进行冷 冻切片 时得到 的经验 见 表 1:
表 1 没有固定的冰冻组织适合切片的温度如下
组织
标本的切片温度
脑 肝 淋巴结 肾 脾 肌肉 甲状腺 皮肤 乳腺 含脂肪乳腺 脂肪组织
- 12 - 14 - 14 - 16 - 16 - 20 - 20 - 25 - 25 - 30 - 30以下
组织冷冻切片 是借 助低 温使组 织达 到一 定的 硬度 然后 收稿日期: 2006- 04- 10
进行切片的一 种技 术方法 [ 1]。因 其制 作过 程较 传统 的石 蜡 切片相对简便、快捷, 不需经过 固定、包埋和 切片后 温箱中 烤 干处理等实验步骤, 且能很好地保存 组织抗 原和酶 的活性 而
另外, 在切片前 修整 冷 冻组 织块 最容 易损 伤刀 刃, 最好 在急冻组织块稍冻硬以后立刻修 整, 以 减少冻 硬的包 埋剂对 刀刃的损害。组织 块冷冻 时可 根据 组织 块大 小加 入适 量的 包埋剂, 我们 用市售液 体胶 水替 代进 口包 埋剂, 切 片效 果良 好, 且经济简 便。切片后 组 织要 进行 及时 固定, 固 定的 作用 在于使蛋白变性、凝固 、沉淀, 终止或 抑制酶 活性, 保持细 胞、 组织原有的形态结构和抗原性, 此外固 定还兼 有硬化 和媒染 组织切片的效果。对于不同的组 织和抗 原成分的 组织切 片, 需选择合适的固 定剂 及适宜 的温 度和 时间。 蛋白 类抗 原用 丙酮固定, 多 糖类抗原用乙醇固定效 果比较好 [ 6] 。切 片一般 在 4 固定液 5分 钟左右。
2 切片机的温度调试 高质 量 的冷 冻切 片 机一 般有 三 个设 置温 度, 工 作 室温
冰冻切片制作与染色过程中常见问题与处理课件
详细描述
为确保组织固定时间与温度的准确控制，应 遵循以下建议：首先，根据组织类型和大小，
选择合适的固定液和浓度，并确保固定液的 新鲜性；其次，根据固定液的特性，严格控 制固定时间和温度，避免固定过度或不足； 最后，在固定过程中，保持组织的湿润和通
透性，以便更好地渗透固定液。
调整切片温度及厚度
要点一
该技术利用组织在冷冻状态下形成的硬度和脆性，使用锋利的刀片将其切割成薄 片。
冰冻切片技术的应用范围
冰冻切片技术主要应用于病理学诊断，尤其是对肿瘤、炎症 和其他疾病的快速诊断。
此外，冰冻切片技术也常用于科研，例如对组织结构和细胞 功能的研究。
冰冻切片的制备流程
冰冻切片的制备流程包括组织固定、包 埋、切片、染色等步骤。
详细描述
为防止切片脱落，可以尝试调整冰冻切片机 的工作温度和切片厚度，并选择合适的染色 液浓度。在制作过程中，可以尝试增加固定 时间或使用更粘稠的包埋剂来增强切片的稳 定性。
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冰冻切片制作与染色技术 优化建议
严格控制组织固定时间与温度
总结词
组织固定是冰冻切片制作过程中的关键环节， 对切片质量和染色效果有重要影响。
总结词
切片温度和厚度的调整对切片质量和染色效果具有重 要影响。
要点二
详细描述
在冰冻切片制作过程中，应根据组织类型和实验需求， 选择合适的切片机和切片刀，并调整切片温度和厚度。 一般来说，较薄的切片更容易染色和观察，但过薄的 切片可能会导致组织结构破坏和细胞丢失。同时，应 根据染液特性，选择合适的染色时间和温度，以确保 染色效果。
使用新鲜染液并定期更换
总结词
使用新鲜染液并定期更换可以确保染色结果的准确性和 可靠性。
冷冻切片方法及注意事项
一、实验前准备清理实验台及仪器。
开启冷冻切片机并将冷冻切片机预降至所需温度（- 15~-20 ℃*）。
准备好处理好的载玻片、刀片、胶水以及药品。
二、取材解剖之后迅速取出所需的新鲜组织，用干纱布或滤纸擦干后不需固定直接取材（24×24×2mm*）,以防形成冰晶造成切片中形成形状不一的空泡,使细胞内结构移位。
（注：取材中目的标本既要明确也要确保其结构的完整性，应避免不必要的脂肪及坏死组织附着;要尽量剔除毛发、硬骨或钙化物;保乳手术切缘由于脂肪组织较多,取材厚度最好不要超过3mm，厚者冰冻费时，大者难以切完整。
甲状腺及淋巴结组织要带全组织被膜并除去多余的脂肪组织。
）三、冷冻切片1、取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上冰冻，用吸热器压住组织，至包埋剂与组织冻结成白色冰体即可切片（1~3分种）。
2、将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。
3、调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10μm间。
4、调好防卷板。
制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。
切片时，以切出完整、平滑的切片为准。
切好的组织在干净的玻片上黏附时顺着一个方向稍微用力轻轻一带,可避免组织摊片过程中皱折,保证组织结构的完整及切片的美观。
注：①包埋剂的选用：包埋剂是对冷冻切片质量一重要影响因素，包埋剂用量要适宜，过多或过少都会影响标本冷冻质量。
常用的有三种包埋剂OCT剂、B超藕合剂以及普通胶水。
B超藕合剂适用于细胞丰富质地较嫩的组织,普通胶水或OCT剂适用于纤维丰富质地偏硬组织。
（OCT包埋剂骤冷时固化，其冷冻速度和软硬韧度与组织相近，其还具有水溶性，不影响染色等优点。
）②组织块过小：先将少量胶挤在托架上预先放在冰冻机中冷冻,约30秒钟左右待胶凝固时将小组织放上,组织周围再加一些胶,再次置于冷冻机中冷冻,这样组织被垫高,就能快速切出高质量的切片。
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防止切片卷缩
? 常见原因
– 切片刀钝或粘有组织碎屑 – 防卷板位置不正确或防卷板较脏 – 静电或者气流作用 – 防卷板温度高、室温高
? 采取对策：
– 保持防卷板干净、平整、无缺损、无刮伤 – 戴口罩，以避免呼出的气流直接吹到防卷板 – 切片时间过长时，应注意间隔一会儿，盖上冷冻室
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同一载玻片上 ? 包括各个所有组 ? 染色齐性
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载玻片上标记（铅笔） ? 组织类型 ? 时间 ? 组别 ? 检测抗原类型
? 固定剂种类：醛类、非醛类、丙酮及醇类
– 中性缓冲液配制多种聚甲醛较为常用
? 组织固定时
– 固定液要有足够的量(固定液是组织体积的8-10倍) – 保持一定时间，快速灌注固定后，相同的固定剂再固定
2-4h（ 4℃冰箱）
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减少冰晶的形成
? 公认：未经固定的组织切片冰晶较多 ? 固定后的组织切片仍然会有一定的冰晶，
盖，降低防卷板温度
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贴片中常见问题及处理
? 载玻片粘不上切片
– 准备的载玻片温度过低 – 将载玻片置于常温即可
? 贴片时切片易碎
– 排除固定不充分等因素外 – 贴片时应注意动作轻、稳、准 – 根据切片大小，选用笔尖软硬适中、大小合适
的毛笔
根本的解决方法：多观察，多练习，熟能生巧
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贴片方式及标记
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一、冰冻切片的优缺点
? 优点：
– 简便，快速，用时短
? 可以不需要对组织固定、脱水、透 明、包埋
? 组织变化不大
? 能很好保存脂肪，类脂
? 能够比较完好地保存各种抗原活性 及酶类
? 对有机溶剂或热的温度耐受能力较 差的细胞膜表面抗原 和水解酶 保存 较好。
? 缺点：
– 不容易做连续切片 – 组织不能过大-不容易冻结
依据科学研究的需要选择方法
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1. 动物取材：一定要注意“平行性”
横向
纵 向
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1 Control 2 Control 3 Control
1 sham 2 sham 3 sham
1 I/R
1 I/R+treatment
2 I/R
2 I/R+treatment
3 I/R
3 I/R+treatment
4 Control 5 Control 6 Control
或者组织冻结不均
– 不容易制作较薄的切片
– 冻结过程中容易产生水的结 晶而影响细胞的形态结构及 抗原物质的定位
– 组织结构不如石蜡切片清晰， 但是满足科研的要求
针对其缺点要注意操作条件优化，避免错误
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二、切片制作过程中几个关键步骤
? 1. 动物取材 ? 2. 组织固定 ? 3. 切片制作 ? 4. 切片染色
环境条件对染色影响）
? 发表、修改文章图的一致性
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举例：不同实验时间和条件下同种一染 色方法结果差异
A
B
C
Masson staining
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2. 标本固定应充分
? 固定的标准
– 切片冰晶少，细胞挤压变形小，切片完整，染色清晰
? 一般较多采用 组织固定后再行切片 ? 浸入法和灌注法
– 浸入法：活检、手术标本，不能进行灌注的组织固定 – 灌注法：动物实验研究
? 选择不同的冷冻度 ? 根据不同的组织而定
– 未经固定的脑组织、肝组织： -10- -15℃左右 – 甲状腺、脾、肾、肌肉等组织： -15～20℃ – 含脂肪组织，-25℃左右 – 含大量的脂肪 -30℃
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保持切片的完整性
? 切片破碎不全、有缺损的常见原因
– 固定不完全 – 温度设置不当 – 组织块过冷、过硬 ，则切片就容易破碎 – 组织块冷冻不够，硬度和韧度达不到，切片也同
冰冻切片制作与染色过程中 常见的问题
夏春梅 cmxia@
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问题思考
? 组织是否 足够新鲜？1w以内？ ? 灌注固定液、洗液 PH值、离子浓度 是否合适？ ? 一抗是选择途径，滴度 如何确定的？ ? 是否阅读过 DATASHEET ? 保存，有效期， reactivity,
Cross-Reactivity ？ ? 对该蛋白表达和分布 有无预期的估计和了解 ? ? 是否设了 阳性和阴性对照 ？ ? 是否排除了 自发荧光？ ? 是不是判读正确？
? 好的切片制作和染色成功的关键
– 细节决定成败
? 固定、漂洗溶液PH值，成分；切片厚度、手感；抗体效价、 特异性；切片孵育时间，湿度、温度；
? 切片判读正确-反映真实的科学现象
? 知识结构背景
? 组织学结构的熟悉 …… ? 认识病理改变：炎细胞侵润、坏死、水肿、蛋白变性、纤维化、增
生、凋亡 …… ? 审美观、拍照角度、视野、曝光时间、对比度 ……
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– 常规HE染色 – 特殊染色
? 如：Masson(Thichrome staining)，油红O，尼氏染色， 台盼蓝（肥大细胞）染色
– 免疫染色 (immunol staining)
? 免疫荧光(immunol fluorescence) ? 免疫组化(immunol histochemistry)
为防止冰晶的形成 ? 采取如下方法
– 速冻法：将组织置入低温环境，使组织骤然降 温
– 利用高渗溶液吸收组织水分子 ：将组织置于 20% —30%的蔗糖溶液中，置 4摄氏度冰箱足够 时间（多长时间 ? 判定？）
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3. 切片：组织新鲜非陈旧标本 是成 败首要因素
? 低温恒冷箱冰冻切片法 ? 组织快速冷冻到一定的硬度(机器要预冷)
4 sham 5 sham 6 sham
4 I/R
4 I/R+treatment
5 I/R
5 I/R+treatment
6 I/R
6 I/R+treatment
横向“block”
? 预实验时早发现趋势而不被误导，减少无效率的工作量
? 减少不同组间baseline 的影响，便于不同批次实验组间比较（背景，抗体效价，