TUNEL染色-冰冻切片-(TMR Red)
翻译好的罗氏公司Tunel试剂盒操作说明书
罗氏(Roche)公司Tunel试剂盒操作说明书(In situ cell death detection kit-POD法)一、原理：TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。
其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP 在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA 的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3‘-OH形成，很少能够被染色。
本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。
还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。
二、器材与试剂器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试剂：试剂盒含：1号（蓝盖）Enzyme Solution 酶溶液：TdT 10×、2号（紫盖）Label Solution标记液：荧光素标记的dUTP 1×、3号（棕瓶）Converter-POD:标记荧光素抗体的HRP；自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、DAB工作液（临用前配制，5 μl 20×DAB+1μL 30%H2O2+94 μl PBS）、Proteinase K工作液（10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl，pH 7.4-8）或细胞通透液（0.1% Triton X-100 溶于0.1% 柠檬酸钠，临用前配制）、苏木素或甲基绿、DNase 1（3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH 7.5， 10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等。
Tunel染色步骤
Tunel染色步骤染色是生物学实验中常用的一种技术手段，它可以标记和可视化细胞或组织中的特定分子或结构。
TUNEL（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling）染色技术是一种常用于检测细胞凋亡的方法。
以下是TUNEL染色的步骤：准备工作：1.去离子水：除去离子，避免离子干扰反应。
2. 去氧核酸酶（DNase）的酶标：新鲜制备，如购买的DNase酶标已开封或保存时间较长，需要用氧化热焓（将无水乙酸用过氧化氢气化后灭菌）处理一晚才可以使用。
步骤一：样本固定1.取细胞或组织样本，放入离子缺失的缓冲液中，使其完全被液体覆盖。
2. 加入4%的 paraformaldehyde（或其他细胞或组织固定液），室温下固定10-15分钟。
3.将样本漂洗3次，每次10分钟，使用冷PBS漂洗。
4.用细胞色素染色法染色检测固定细胞总蛋白质。
步骤二：处理样本1. 将细胞或组织样本渗透处理：将固定的细胞或组织置于PBS中含有0.5% Triton X-100（或0.1-0.2%的Bis-vinylsulfonyl] ethane等亲水试剂）的溶液中，室温下渗透30分钟。
2.将样本漂洗3次，每次10分钟，使用冷PBS漂洗。
3. 用DNase酶标法探测样本中DNA裂解。
步骤三：TUNEL反应1.取TUNEL反应液，根据实验需要，在冷冻时保持在冰上。
2.用比色皿将样本恢复到PBS中，将足量的TUNEL反应液加入标本中，使标本完全浸润，尽量避免气泡。
3.在37℃下孵育1-2小时。
步骤四：反应终止1.将标本移至冷藏，室温下用PBS漂洗3次，每次10分钟。
2.用缓冲液漂洗标本3次，每次10分钟。
步骤五：可视化与分析1.在镜下放置标本。
2.加入螢光抑制剂或DAPI等染料，使用荧光显微镜检测标本。
总结：TUNEL染色技术是一项用于检测细胞凋亡的重要方法。
它通过检测DNA的断裂末端来间接检测细胞凋亡。
整个TUNEL染色过程包括样本固定、样本处理、TUNEL反应、反应终止和可视化与分析等步骤。
TUNEL染色
TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法检测细胞凋亡实验原理和方法原理：细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。
然后大约30 ﹪的染色体DNA在Ca ²和Mg²依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180～200bp核小体DNA多聚体。
DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）。
由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3’-OH形成，很少能够被染色。
实验方法TUNEL检测对于贴壁细胞或细胞涂片a. PBS或HBSS洗涤一次。
b. 如果细胞贴得不牢，可以干燥样品使细胞贴得更牢。
c. 用4%多聚甲醛或碧云天生产的免疫染色固定液(P0098)固定细胞30-60分钟。
d. 用PBS或HBSS洗涤一次。
e. 加入含0.1% Triton X-100的PBS，冰浴孵育2分钟。
f. 转步骤5。
TUNEL检测对于悬浮细胞或细胞悬液a. 收集细胞(不超过200万细胞)，PBS或HBSS洗涤一次。
b. 用4%多聚甲醛固定细胞30-60分钟。
为防止细胞聚集成团，宜在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动的同时进行固定。
c. 用PBS或HBSS洗涤一次。
d. 用含0.1% Triton X-100的PBS重悬细胞，冰浴孵育2分钟。
e. 转步骤5。
TUNEL检测对于石蜡切片a. 二甲苯中脱蜡5-10分钟。
换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5-10分钟。
无水乙醇5分钟。
90%乙醇2分钟。
TUNEL染色
TUNEL染⾊相关疾病：产品名称：罗⽒(Roche)公司Tunel试剂盒英⽂名称：Tunel产品货号：11684817910产品规格：50T试剂级别：试剂级产品产地：USA产品商标：RocheIn situ cell death detection kit-POD法⼀、原理：TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是⽤来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。
其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP 在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作⽤下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3‘-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者⼜与HRP底物⼆氨基联苯胺（DAB）反应产⽣很强的颜⾊反应（呈深棕⾊），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因⽽在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞⼏乎没有DNA断裂，因⽽没有3?-OH形成，很少能够被染⾊。
本试剂盒适⽤于组织样本（⽯蜡包埋、冰冻和超薄切⽚）和细胞样本（细胞涂⽚）在单细胞⽔平上的凋亡原位检测。
还可应⽤于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双⾊法确定细胞死亡类型和分化阶段。
⼆、器材与试剂器材：光学显微镜及其成像系统、⼩型染⾊缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻⽚或封⼝膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试剂：试剂盒含TdT 10×、荧光素标记的dUTP 1×、标记荧光素抗体的HRP；⾃备试剂：PBS、双蒸⽔、⼆甲苯、梯度⼄醇（100、95、90、80、70%）、DAB⼯作液（临⽤前配制，5 µl 20×DAB+1µL 30%H2O2+94 µl PBS）、Proteinase K⼯作液（10-20µg/ml in 10 mM Tris/HCl，pH 7.4-8）或细胞通透液（0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate，临⽤前配制）、苏⽊素或甲基绿、DNase 1（3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH 7.5，10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等。
细胞tunel染色步骤
细胞tunel染色步骤细胞 Tunnel 染色步骤细胞Tunnel 染色是一种常用的细胞凋亡检测方法，通过染色分析可以定量评估细胞凋亡的程度。
本文将介绍细胞Tunnel 染色的步骤。
1. 固定细胞需要将待检测的细胞固定在载玻片上。
固定可使用4%的无水乙醇或4%的甲醛进行，固定时间一般为10-30分钟。
2. 透化细胞固定后的细胞需要进行透化处理，以便Tunnel 酶能够进入细胞内部。
透化可使用0.1%的Triton X-100进行，透化时间一般为5-10分钟。
3. 准备 TUNEL 反应液TUNEL 反应液是细胞Tunnel 染色的核心。
一般来说，TUNEL 反应液包含 Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) 酶和标记有荧光或酶的dUTP。
根据实验需求，可以选择不同的标记物，如荧光染料FITC、Rhodamine 或者酶标记物如辣根过氧化物酶（HRP）。
4. 进行 TUNEL 反应将TUNEL 反应液加到透化后的细胞上，尽量覆盖整个玻片表面。
然后，将玻片置于湿度高的环境中，如湿箱或湿化瓶中，温度为37°C。
反应时间一般为1-2小时。
5. 停止反应反应结束后，需要停止TUNEL 反应，以保证结果的准确性。
停止反应可使用缓冲液，如PBS缓冲液或甘氨酸缓冲液，反应时间一般为10分钟。
6. 染色在停止反应后，需要对细胞进行染色，以便观察和分析。
染色可使用荧光显微镜或透射电子显微镜进行观察。
如果使用荧光显微镜，可以直接观察细胞的荧光信号。
如果使用透射电子显微镜，需要进行金粒子染色，将金粒子标记的抗体与TUNEL 反应产物结合，形成可见的电子密度。
7. 细胞计数和分析对染色后的细胞进行计数和分析。
可以使用图像处理软件对细胞进行定量分析，评估细胞凋亡的程度。
可以通过测量染色阳性细胞的数量，计算细胞凋亡指数（Apoptosis Index）。
细胞Tunnel 染色是一种简单而有效的细胞凋亡检测方法，可以广泛应用于生物医学研究中。
tunel染色 作用
tunel染色作用Tunel染色的作用什么是Tunel染色？Tunel染色是一种常用的细胞和组织样本检测方法，用于检测细胞凋亡的发生与程度。
Tunel是”Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling”的缩写，即末端脱氧核苷酸转移酶-去氧尿嘧啶核苷酸末端标记法。
这种染色技术通过标记DNA断裂末端的dUTP来检测细胞凋亡。
Tunel染色的原理Tunel染色的原理基于细胞凋亡时DNA断裂的现象。
在细胞凋亡发生时，DNA会断裂并形成自由的断裂末端。
Tunel染色利用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）在这些断裂末端上加入标记的dUTP。
通过连接这些标记的dUTP，我们可以利用荧光或颜色物质的发射来显示细胞凋亡的发生和程度。
Tunel染色的应用Tunel染色在生物医学领域中具有广泛的应用。
以下是一些Tunel 染色的主要应用：•细胞凋亡研究：Tunel染色可以帮助科学家们研究各种生理和病理条件下细胞凋亡的发生机制、调控因子以及凋亡信号通路。
•药物研发：许多抗癌药物通过诱导细胞凋亡来抑制肿瘤生长。
Tunel染色可以评估药物对细胞的作用，并帮助科学家们筛选和优化药物候选物。
•疾病诊断：凋亡在许多疾病的发展中起着重要作用。
Tunel染色可以用于检测和诊断与细胞凋亡相关的疾病，如癌症、神经系统疾病和心血管疾病等。
Tunel染色的优点Tunel染色作为一种检测细胞凋亡的方法，具有以下几点优点：•高灵敏度：Tunel染色能够检测到细胞凋亡的微弱信号，可以提供准确的凋亡检测结果。
•易于操作：相比其他凋亡检测方法，Tunel染色的操作相对简单且迅速，可广泛应用于实验室和临床领域。
•可定量化：Tunel染色结果可以通过计算染色阳性细胞百分比或强度来量化细胞凋亡的程度，提供定量化的数据支持。
•多重应用：Tunel染色可以与其他染色方法相结合，如免疫组化染色、细胞形态学分析等，扩展其应用领域。
免疫荧光双染
免疫荧光双染在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。
双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。
冰冻切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤1、冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固定10min，待丙酮完全干后于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
2、修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用PBS 1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。
将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
3、破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
4、加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1 (TdT)和试剂2(dUTP)按2:29混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。
5、BSA封闭:将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。
6、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。
（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）7、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。
8、 DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。
去除PBS 后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。
9、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
TUNEL染色
相关疾病：•脱水产品名称：罗氏(Roche)公司Tunel试剂盒英文名称：Tunel产品货号：11684817910产品规格：50T试剂级别：试剂级产品产地：USA产品商标：RocheIn situ cell death detection kit-POD法一、原理：TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。
其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP 在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3‘-OH形成，很少能够被染色。
本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。
还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。
二、器材与试剂器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试剂：试剂盒含TdT 10×、荧光素标记的dUTP 1×、标记荧光素抗体的HRP；自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、DAB工作液（临用前配制，5 μl 20×DAB+1μL 30%H2O2+94 μl PBS）、Proteinase K工作液（10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl，pH 7.4-8）或细胞通透液（0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate，临用前配制）、苏木素或甲基绿、DNase 1（3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH 7.5，10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等。
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TUNEL染色（TMR Red）
一、实验原理：
细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。
然后大约30 ﹪的染色体DNA在Ca ²和Mg²依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180～200bp核小体DNA多聚体。
DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）。
二、相关试剂：
1、酶缓冲液：vial 1: Enzyme Solution
2、标记液：vial 2: Label Solution
3、固定液：4%多聚甲醛
4、清理液：PBS（pH 7.4）
5、透性处理液（Permeabilisation solution）：含0.1% TritonX–100的0.1% 柠檬酸钠的缓冲液，新鲜配制
三、其他设备：
1、湿盒
2、荧光倒置显微镜或激光共聚焦显微镜（confocal）
四、染色步骤：
1、标本预处理：
（1）用4%多聚甲醛固定组织20分钟（15-20℃）；
（2）PBS清洗30min；
（3）置于透性处理液（0.1% TritonX–100的0.1% 柠檬酸钠）中冰上孵育2min（2-8℃）2、TUNEL反应液：
（1）从标记液（vial 2: Label Solution）中吸出100ul用于2个阴性对照（50ul/个）；
（2）将50ul酶缓冲液（vial 1: Enzyme Solution）加入到剩余450ul的标记液中充分混合均匀，得到500ulTUNEL反应液（50ul/样本，检测10个样本）。
3、标记：
（1）PBS清洗3min，3次；
（2）吸干样品周围的液体；
（3）往组织切片上滴加TUNEL反应液（覆盖整个切片），阴性对照加标记液；
（4）湿盒中避光孵育60min，注意避光；
（5）PBS清洗3min，3次；
（6）抗荧光淬灭封片液封片，用荧光倒置显微镜或激光共聚焦显微镜（confocal）检测（激发波长520-560nm，最大540nm，绿光；检测波长570-620nm，最大580nm，红光。