大肠杆菌的检测(最新知识点)
大肠菌群计数检验重点
第一法 大 肠菌群 MPN 计 数法
第二法 大 肠菌群平 板计数法
一．3、5、7小组： 使用第一法（附带做第二法中，两个平板接 种），以自来水为样品。
二．4、6小组： 使用第二法（附带做第一法中，3个试管初发酵 试验），以污水为样品。
第一法：检样稀释与初发酵试验
1
MPN：表示食品 中大肠菌群数是以 每100ML或克检 样内大肠菌群最大 可能数。一般采用 9管法.
3. 证实试验
○ 从VRBA 平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于 BGLB 肉汤管内，36 ℃±1 ℃培养24 h～48 h，观察产气情况。凡 BGLB 肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。
原理
溴甲酚紫，中性时呈蓝紫色，酸性时呈黄色，如果颜色不变 （呈蓝紫色），说明无产酸的大肠菌群；如果颜色变黄色，说 明可能出现能分解乳糖产酸的大肠菌群。
第一法 复发酵试验
用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中， 36℃±1℃培养48h±2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。
1. 第二法 平板菌落数的选择与证实试验
2. 平板菌落数的选择
○ 选取菌落数在15CFU～150CFU 之间的平板，分别计数平板上出现 的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色 的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm 或更大。
第二法：检样稀释与平板计数
检样稀释：同ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ。 平板计数：
1. 每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1mL稀释样品，另外一个平皿加1mL生理盐水作空白对照。 2. 及时将15—20mLVRBA（结晶紫中性红胆盐琼脂）倾注每个平皿中。 3. 待琼脂凝固后，再加3—4mLVRBA覆盖表层。翻转平板培养。
大肠杆菌的检测及原理
大肠杆菌的检测及原理1.检测原理：大肠菌群是一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。
食品中的大肠菌群数系以100ml(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。
2.仪器设备与器具：2.1 恒温培养箱：36±1℃。
2.2 1000ml三角烧瓶、1ml、10ml移液管。
2.3 接种针。
2.4 显微镜。
2.5 超净工作台。
2.6 玻片、酒精灯、洗耳球、试管架。
2.7 天平：感量0.01g。
2.8 灭菌釜。
2.9 培养皿（直径为90mm）、试管，经121℃、30分钟灭菌。
2.10试管夹、酒精灯、秒表、载玻片3.培养基及试剂：3.1 乳糖胆盐发酵管：按照制造厂家使用说明进行配制，灭菌。
3.2 伊红美兰琼脂平板：按照制造厂家使用说明进行配制，灭菌。
3.3 乳糖发酵管：按照制造厂家使用说明进行配制，灭菌。
3.4 革兰氏染色液。
3.4.1 结晶紫染色液：结晶紫1g95%乙醇20ml1%草酸铵水溶液80ml将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。
3.4.2 革兰氏碘液：碘1g碘化钾2g蒸馏水300ml将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300 ml。
3.4.3 沙黄复染液：沙黄0.25g95%乙醇10ml蒸馏水90ml将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。
3.5 生理盐水。
4.检验程序：检样稀释↓乳糖胆盐发酵管，36±1℃，24±2hr ↓不产气产气↓大肠菌群阴性伊红美兰琼脂平板，36±1℃，24±2hr报告↓ ↓革兰氏染色乳糖发酵管，36±1℃，24±2hr ↓ ↓ ↓G+ G-，无芽孢杆菌产气不产气大肠菌群阴性大肠菌群阴性报告大肠菌群阳性报告5.测定方法：5.1 检样稀释：5.1.1 以无菌操作将检样25ml(或25g)放于含有225ml灭菌生理盐水的灭菌塑料烧杯中，经充分振摇成1：10均匀稀释液。
微生物学理论指导：大肠杆菌的卫生细菌学检查
⼤肠杆菌不断随粪便排出体外，污染周围环境和⽔源、⾷品等。
取样检查时，样品中⼤肠杆菌越多，表⽰样品被粪便污染越严重，也表明样品中存在肠道致病菌的可能性越⼤。
故应对饮⽔、⾷品、饮料进⾏卫⽣细菌学检查。
1.细菌总数：检测每毫升或每克样品中所含细菌数，采⽤倾注培养计算。
我国规定的卫⽣标准是每毫升饮⽔中细菌总数不得超过100个。
2.⼤肠菌数指数：指每⽴升中⼤肠菌群数，采⽤乳糖发酵法检测。
我国的卫⽣标准是每1000ml饮⽔中不得超过3个⼤肠菌群；瓶装汽⽔、果汁等每100ml⼤肠菌群不得超过5个。
大肠杆菌检测课件
感性高，特异性强。 PPT学习交流
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讨论与展望
近年来，世界各国针对水环境和食品中大肠杆菌的 快速检测技术展开了大量研究，在已知的检测方法中均 有自己的优势与不足。随着科学和生物生化技术的发展， 食品中大肠杆菌的检测计数也将趋于提高精度与速度， 不断改进与完善才能切实解决食品安全问题，为人品生 活提供保障。
将冷却至45℃±0.5℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）
倾注于平皿内，混匀并凝固后加入3~4mL的VRBA-MUG
覆盖平板表层，36±1℃下培养18~24h，之后在紫外灯下
计数。该方法是将样本做一定比例的稀释，其中的微生物
被稀释后分散成单个细胞，然后在一定的条件下进行培养
一直到生长成能用肉眼观察的菌落，最后通过样本数量和
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检测原理
PCR检测技术是在1971年首先被Kleppe等提出， 1985年才作为一种检测方法获得认可。PCR检测技术是 一种聚合酶链反应，其采用变性—退火—延伸三个步骤 使DNA基因能够在体外实现解旋解链，类似于一种体外 增加、复制形式。史云等建立了用于肉及肉制品中大肠 杆菌的两重PCR检测方法，但该方法需要较长的时间的 样品纯化处理，且对操作人员的专业知识的要求也较高。
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检测原理
免疫磁珠技术是一种大肠杆菌的分离技术。其原理是 以磁珠为抗体载体，磁珠和大肠杆菌结合，通过磁力来实 现力学移动进而将大肠杆菌进行分离。与其他的细菌分离 方法相比，免疫磁珠技术在很大程度上提高了样本中病原 性副溶血性弧菌的检测效率。免疫磁珠技术可以快速地在 不同菌种的样本中处理不同的微生物，该方法可以大幅度 地提升检测效率。
大肠杆菌检验方法
大肠杆菌检验方法
大肠杆菌(Escherichia coli)是一种革兰氏阴性的厌氧菌，常常被用作指示性微生物来评估食品和水源的卫生质量。
以下是常见的大肠杆菌检验方法：
1. 培养基方法：将样品接种在包含大肠杆菌生长所需营养物质的培养基上，如大肠杆菌选择性琼脂培养基(MacConkey琼脂培养基)和EC培养基等。
大肠杆菌能够利用琼脂中的乳糖发酵产生酸，导致培养基呈现红色或粉红色。
此外，EC 培养基还包含了可以检测大肠杆菌β-葡萄糖苷酶的亚甲基红试剂，如果大肠杆菌存在，则培养基呈现金属光泽。
2. 确认方法：对落有培养基上的鲜艳深色菌落进行进一步确认。
典型的确认方法包括革兰染色、目测观察形态特征、氧化发酵试验和测试产气杆菌酶试验。
3. PCR检测方法：利用聚合酶链反应(PCR)技术，从样品中扩增大肠杆菌特异性基因片段（如16S rRNA基因），然后通过凝胶电泳检测扩增产物。
4. 快速方法：如免疫层析试纸法和光学组织测定法。
免疫层析试纸法利用抗大肠杆菌抗体与大肠杆菌特异性抗原结合生成可视化结果。
光学组织测定法利用大肠杆菌的β-葡萄糖苷酶水解比色底物产生颜色变化。
这些方法都可用于检测大肠杆菌在食品和水源中的存在及其数量。
在进行检验时，应严格遵守相关的操作规程和实验室操作规范，以确保结果的准确性和可靠性。
大肠杆菌菌落总数检测步骤
大肠杆菌及菌落总数检测方法为了对鸡精产品的微生物指标进行有效的控制，对微生物的检测就显的十分重要。
下面是鸡精产品的大肠杆菌及菌落总数实验检测方法。
一、大肠杆菌：1）培养基准备（以3.5g乳糖胆盐发酵琼脂为例）双料试管配制A、用量杯量取加热的100ML蒸馏水（实验前需对蒸馏水进行高压灭菌处理，处理方法详见注一）。
B、用0.1g称量天平秤取7g乳糖。
C、将A、B混合均匀，并用10ml吸管各取10ml混合液分别注入三根装有小导管的试管中（此三根为双料试管，即双倍原料）。
单料试管配制A、用量杯量取加热的100ML蒸馏水（实验前需对蒸馏水进行高压灭菌处理，处理方法详见注一）。
B、用0.1g称量天平秤取3.5g乳糖。
C、将A、B混合均匀，并用10ml吸管各取10ml混合液分别注入六根装有小导管的试管中（此六根为单料试管，即单倍原料）。
2）将配制好的试管放入灭菌锅进行115℃进行灭菌10min。
3）将灭菌过后的试管放置在无菌室，常温保存一周。
4）若要对生产的样品检测其大肠杆菌，其步骤如下：A、量取灭菌后的蒸馏水225ml加温后及25g样品混合均匀。
（样品需要在无菌室中，有封盖的塑料杯中进行混合）B、取三个玻璃培养皿，分别标上-1、-2、-3标记。
C、取两根新试管取9ml蒸馏水分别标为a、b。
D、用吸管吸取1ml样品液体，注入-1培养皿中，并盖上盖子。
E、用吸管吸取1ml样品液体，注入a试管中，记为-2培养基液。
F、用吸管吸取1ml a试管中的液体，注入到b试管中，记为-3培养基液。
G、用1ml吸管取样品液体分别注入3根单料试管中，用10ml吸管取样品液体分别注入双料试管中H、用1ml吸管取-2培养试管液体，分别注入到单料试管中。
I、装好液体的试管，用试管塞封好，放到36℃±1℃的恒温培养箱中24小时培养。
J、24小时培养后，取出并用肉眼观察试管的颜色及冒气泡情况，若有其中的任意状况，说明有大肠杆菌，需要通过美兰做进一步的检测。
大肠杆菌的检测方法
大肠杆菌的检测方法大肠杆菌（Escherichia coli，简称E. coli）是一种常见的细菌，它存在于人和动物的肠道中，同时也是一种重要的指示性微生物，可以用来评估环境和水源的卫生状况。
对大肠杆菌的检测具有重要的意义，可以帮助预防细菌感染和传播，保障公共卫生安全。
现在，我将详细介绍大肠杆菌的检测方法。
大肠杆菌的检测方法主要分为传统培养法和分子生物学方法两大类。
传统培养法是最常用的大肠杆菌检测方法之一。
其基本原理是将样品在含有大肠杆菌生长所需的培养基上孵育，然后观察培养基上是否有典型的大肠杆菌形态和生长特征。
具体步骤如下：1. 准备样品：样品可以是水、食品、环境表面等。
2. 分装样品：将样品分装到培养基培养皿或试管中。
3. 孵育培养：将分装好的样品在适当的温度和时间条件下进行培养，通常是在37摄氏度下孵育24小时，有时也需要采用其他不同的条件。
4. 观察结果：在培养基上观察是否有大肠杆菌形态和生长特征的典型菌落，如红色菌落、金属光泽等。
5. 进一步确认：对观察到的典型菌落进行进一步的生化和生理测试，如大肠杆菌产气试验、甲烷气生成试验等，以确认是否为大肠杆菌。
传统培养法有着较长的检测时间和较低的检测灵敏度，但由于其成本较低且操作简单，仍然是大肠杆菌检测的常用方法。
另一种常用的大肠杆菌检测方法是分子生物学方法。
相对于传统培养法，分子生物学方法具有更高的检测灵敏度和特异性，且检测速度更快。
以下是一些常用的分子生物学方法：1. PCR扩增法：该方法利用特异性引物和酶的作用，通过对大肠杆菌特定基因（如16S rRNA基因）进行扩增，可以检测到极少量的大肠杆菌DNA。
2. 实时荧光PCR法：该方法是PCR扩增法的改进，可以同时进行扩增和检测，通过实时监测荧光信号的产生来判断样品中是否存在大肠杆菌。
3. 基因芯片技术：这种技术利用微阵列芯片，含有大肠杆菌的特异性探针，可同时检测多个基因和多个大肠杆菌菌株。
大肠杆菌的测定(精)
水中总大肠杆菌的测定来源:加入时间:2010-3-30 12:15:511 原理总大肠杆菌群可用多管发酵法或滤膜法检测。
多管发酵法的原理是根据大肠菌群细菌能发酵乳糖,产酸产气以及具备革兰氏染色阴性,无芽孢,呈杆状等有关特性,通过三个步骤进行检验,求得水样中的总大肠菌群数,实验结果以最可能数(most probable number,简称 MPN 表示。
2仪器2.1 高压蒸汽灭菌器。
2.2 恒温培养箱,冰箱。
2.3 生物显微镜,载玻片。
2.4 酒精灯,镍铬丝接种棒。
2.5 培养皿 (直径 100mm ,试管(5×150mm,小倒管,吸管 (1, 5, 10ml ,烧杯 (200, 500, 2000ml , 锥形瓶 (500, 1000ml ,采样瓶。
3 培养基及染色剂的制备3.1 乳糖蛋白胨培养液:将 10g 蛋白胨、 3g 牛肉浸膏、 3g 乳糖和 5g 氯化钠加热溶于 1000mL 蒸馏水中,调节 pH 为 7.2-7.4, 再加入 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1mL ,充分混匀,分装于试管(内有倒管中,于 121℃高压灭菌器中灭菌 15min ,贮存于冷暗处备用。
3.2 三倍浓缩蛋白胨溶液:按上述乳糖蛋白胨培养液的制备方法制备。
除蒸馏水外,各组分用量增加至三倍。
3.3 品红亚硫酸钠培养基3.3.1 贮备培养基的制备于 2000mL 烧杯中,先将 20-30g 琼脂加到 900mL 蒸馏水中,加热溶解,然后加入3.5g 磷酸氢二钾及 10g 蛋白胨,混匀,使其溶解,再用蒸馏水补充到 1000mL 调节溶液pH 至 7.2-7.4。
趁热用脱脂棉或绒布过滤,再加 10g 乳糖,混匀,定量分装于 250或500mL 锥形瓶内,置于高压灭菌器中,在 121℃灭菌 15min , 贮存与冷暗处备用。
3.3.2 平皿培养基的制备将上法制备的贮备培养基加热融化。
根据锥形瓶内培养基的容量,用灭菌吸管按 1:50比例吸取 5%碱性品红乙醇溶液,置于灭菌空试管中;再按 1:200比例称取无水亚硫酸钠,置于另一灭菌空试管内,加灭菌水少许使其溶解,再置于沸水浴中煮沸10min (灭菌。
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大肠杆菌的检测
食品微生物检验技术课程综
述
大肠杆菌的检测（MPN计数法）
院系：食品科学与药学学院
班级：食科11４
姓名: 张花
学号：１140３１431
组长：张军玲
成员：张花
赵晶郁
朱娟娟
大肠杆菌Peｔrifilｍ测试片计数法
摘要
食品检测是反映食品加工、贮藏、运输、等环节的卫生与安全状况的重要手段，而大肠菌群检测则是食品检测的重要指标均之一。
根据定义大肠菌群是在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和碱性厌氧的革兰氏阴性芽胞杆菌.其主要检测意义在于反映食品卫生状况并推测其在肠道致
病菌的可能性。
Pｅtriｆilｍ大肠菌群测试片是由美国3M生产的一种预先制备好的VRＢ平板培养基系统,并添加了TTＣ作为菌落指示剂便于菌落判读，而上层薄膜可以起到对大肠菌群发酵产生的气体截留的作用.该方法目前已被多数权威机构认可,并在国内很多实验室开展运用。
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关键词大肠杆菌Ｐetrｉfｉｌm测试法
1设备和材料
1.1恒温培养箱:36±1℃。
1.2冰箱２~5℃。
1．3恒温水浴箱：44。
5±0。
２℃。
1．４天平：感量0．１g.
１．5均质器
1。
6振荡器。
１．7无菌吸管：lｍL(具0。
01 mＬ刻度）、10ｍＬ(具0.1mＬ刻度）或微量移液器及吸头。
1.8无菌锥形瓶：容量500mL.
1.9 玻璃珠：直径约５mm.
1.1０pH计或pH比色管或精密pH试纸
1。
１1试管架。
2。
培养基和试剂
2．1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（ LＳＴ）肉汤。
２。
２EＣ肉汤。
２．3蛋白胨水。
2．4缓冲葡萄糖蛋白胨水(MP-ＶP实验用）。
2.5磷酸盐缓冲液.
2。
6无菌生理盐水:称取8．５ｇ氯化钠溶于１000ml 蒸馏水中,121℃高压灭菌15mｉn。
2.71mol／L氢氧化钠(NaＯH ）：称取40g 氢氧化钠溶于100０ml蒸馏水中。
2．81mｏl／L 盐酸（HCI ) :移取浓盐酸90ml,用蒸馏水稀释至1０0０mｌ。
3检验程序
4.样品稀释
４。
１固体和半固体样品：以无菌操作将检样２５mＬ样品，置盛有２25ｍL磷酸盐缓冲液的无菌均质杯内或其他稀释液的灭菌锥形瓶内（瓶内予置适当数量的玻璃珠，经充分振摇或研磨做成１：10的均匀稀释液.固体检样最好用均质器，以８ 00０—10 ０00 r／min的速度处理1~２min，做成1：10的样品均匀稀释液)。
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4.2液体样品:以无菌吸管吸取样品2５ｍl置盛有２25mＬ磷酸盐缓冲液的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的玻璃珠）中，充分振摇，制成1：1０的样品匀液.
4.3样品匀液的pH值应在6。
５~７.5之间,必要时分别用１moｌ/Ｌ氢氧化钠（NａOH )或1ｍo ｌ／L 盐酸（HCI )调节.
４．４用1mL灭菌吸管吸取1:1０稀释液1ｍL,沿管壁缓缓注入含有9mL磷酸盐缓冲液的无菌试管内,振摇试管混匀，做成1:1０0的稀释液.
4。
5根据对样品污染状况的估计，按上条操作依次做1０倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL灭菌吸管。
从制备样品匀液至样品接种完毕,全程不得超过15min.
5检验
5.１接种和培养
选取２～3个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度接种两张测试片。
将测试片置于平坦实验台面上，揭开上层膜,用吸管吸取样品匀液1mｌ垂直地价在测试片的中央,将上层膜缓慢盖下，避免气泡产生和上层膜直接落下,将压板放置在上层膜中央处，轻轻地压下，是样品匀液覆盖与圆形的培养膜表面，切勿扭转压板。
拿起压板，静置至少1mｉn意识培养基凝固。
将测试片的透明面朝上放于36℃的培养箱内，地跌层数不超过2０片，肉、家禽和水产品,培养时间为２4±２h；其他食品培养时间为４８±2h....感谢聆听...
5.1判读
可肉眼观察计数,或用菌落计数器、放大镜、Ｐetｒｉfilm自动判读仪计数。
蓝色有气泡的菌落确认为大肠杆菌,不论蓝色的深浅，部分蓝色的带气泡菌落也判定为大肠杆菌。
圆形培养膜边缘及边缘以外的菌落不计数。
当测试片出现大量气泡、不明显的小菌落,培养区成蓝色时，需要进一步稀释样品匀液,重新检验。
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６大肠杆菌测试片技术的报告
选择菌落数在1５～1５０之间的稀释度,两张
测试片菌落平均乘以稀释倍数，即为每克(或毫升)样品中大肠杆菌数，以CＦU／g(CＦU/mｌ）表示.
如果所有稀释度测试片上的菌落数都小于15，计数最低稀释度测试片上的平均菌落数乘以稀释倍数报告;如果所有稀释度测试片上均无菌落生长,以“小于1乘以最低稀释倍数”报告；如果所有稀释度的菌落数都大于150，计数最高稀释度测试片上的平均菌落数乘以稀释倍数报告。
技术菌落数大于150个的测试片，可计数一个或两个具有代表性的方格内的菌落数，换算成单个方格内的菌落数以后乘以20，即为测试片上估算的菌落数（圆形生长面积为20c㎡）。
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参考文献
〖1〗中华人民共和国国家标准ＧB/T-4789.３8-2010.
〖2〗食品微生物检验/周建新主编。
北京化工工业出版社，2011．6
〖3〗...谢阅...
〖4〗
〖5〗。