生物化学实验报告记录：Westernblotting检测大肠杆菌重组蛋白
生物化学与分子生物学实验四-Western blot(七年制)
PAGE的聚合
需要催化剂——氧化还原系统作用，使Acr 单体带有游离基，从而与Bis进行聚合。 化学聚合：AP-TEMED系统 过硫酸胺（AP）作为催化剂，四甲基乙二胺 （TEMED）为加速剂。
AP在水溶液中能产生游离基SO42-，使丙烯酰胺单
体的双键打开，活化形成自由基丙烯酰胺，然后游
分子筛效应与电荷效应
进入分离胶后，Gly-成为快离子 分离胶只有电荷效应和分子筛效应，根据 各蛋白质所带电荷不同、分子大小不同而分
离
凝胶的筛分特性取决于它的孔径，而孔径又是灌胶时所用 丙烯酰胺和双丙烯酰胺绝对浓度的函数。用5～15%的丙烯 酰胺所灌制凝胶的线性分离范围如下表：
丙烯酰胺浓度（%）
*用吸瓶将加样孔内和玻璃板下面放密封条位置
的气泡全部排出
6.上样：
（1）marker 和样品均上20µl
（2）上样顺序：左→右：Marker--牛血清-牛血清白蛋白--g-球蛋白，
多余的上样槽不能空，加入等量上样缓冲液
100℃沸水，5min 蛋白变性
Sample
上样
Marker
Fermentas 预染
封闭
1. 取出两块膜，用滤纸将残留液体吸净后，将 两块膜的蛋白面相对放入封闭液（ 5%BSA 或 5%脱脂奶粉用TBST配制） 2. RT（室温），1-2hours （摇床）或 4℃过 夜
抗体孵育
1 把膜从冰箱中取出， RT ， 30min 。 注： 封闭液可回收 2. 膜放入杂交袋，加1:800倍稀释(根据抗体的 灵敏度而定）的抗体（ HRP 标记的羊抗人 IgG 抗体），排出气泡，密封袋口。 3. 蛋白面朝上，RT下孵育1h 4. 摇床上漂洗 TBST 10min×3（也可5min×6)
免疫印迹实验报告——wester-blot
Western blot实验报告摘要：目的：学习并掌握western blot分离蛋白及观察方法方法：western blot结果：见后文结论：western blot能很好地分离蛋白关键词：western blot、分离、小鼠组织、蛋白Western blot test reportAbstract: objective: Learn and master the western blot protein isolated and observation method Methods: western blot：,sds-page and electric transferResults: see belowKey words: Western blot、separate、mouse tissues、protein前言:免疫印迹又称Western印迹(Western blotting)，与DNA的Southern印迹技术相对应，两种技术均把电泳分离的组分从凝胶转移至一种固相载体(通常为NC膜)，然后用探针检测特异性组分。
不同的是，Western blotting所检测的是抗原类蛋白质成分，所用的探针是抗体，它与附着于固相载体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。
该技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异敏感等诸多优点，具有从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测，以及从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性。
该技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而无需对靶蛋白进行放射性标记。
目前，Western blotting广泛用于蛋白质研究、基础研究和临床医学的研究。
免疫印迹可分成两个步骤：蛋白质由凝胶转移至固相基质；特异性抗体检测。
蛋白质转移通常由电泳实现，现常用的方法有二：1 半干法：将凝胶和固相基质似三明治样夹在缓冲液湿润的滤纸中间，通电10-30分钟可完成转移；2 湿法：将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电45分钟或过夜课完成转移。
免疫印迹实验报告
免疫印迹实验报告一、实验目的免疫印迹（Western blotting）是一种广泛应用于分子生物学、生物化学和免疫学等领域的技术，用于检测和定量特定蛋白质在样品中的表达水平。
本次实验的目的是通过免疫印迹技术检测目标蛋白在不同样品中的表达情况，以验证实验假设并为进一步的研究提供数据支持。
二、实验原理免疫印迹实验基于抗原抗体特异性结合的原理。
首先，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）将蛋白质样品按照分子量大小分离。
然后，将分离后的蛋白质从凝胶转移到固相支持物（如硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜）上。
接着，膜与特异性抗体进行孵育，使抗体与目标蛋白结合。
最后，通过检测抗体的存在来确定目标蛋白的表达水平。
检测抗体的方法通常包括使用酶标记的二抗结合底物产生显色或发光信号，或者使用荧光标记的二抗通过荧光检测系统进行检测。
三、实验材料和设备1、材料细胞裂解液蛋白酶抑制剂蛋白标准品一抗（特异性针对目标蛋白）二抗（酶标记或荧光标记）化学发光底物（或荧光检测试剂）预染蛋白分子量标准硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜电泳缓冲液转膜缓冲液封闭液（如脱脂奶粉或牛血清白蛋白溶液）洗涤液（含吐温 20 的磷酸盐缓冲液）2、设备电泳仪和电泳槽转膜装置摇床冰箱酶标仪（或荧光检测仪器）四、实验步骤1、蛋白样品制备收集细胞或组织样本，加入适量的细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，在冰上裂解一定时间。
离心收集上清液，即为蛋白样品。
2、 SDSPAGE 电泳制备 SDSPAGE 凝胶，根据目标蛋白的分子量选择合适的分离胶浓度。
将蛋白样品与上样缓冲液混合，煮沸变性。
上样，进行电泳，直至溴酚蓝指示剂到达凝胶底部。
3、转膜电泳结束后，将凝胶浸泡在转膜缓冲液中平衡。
按照“三明治”结构组装转膜装置，依次为阴极、滤纸、凝胶、膜、滤纸、阳极。
在冰浴或冷室中进行转膜，根据蛋白分子量和转膜条件确定转膜时间。
4、封闭转膜结束后，将膜放入封闭液中，在摇床上孵育一定时间，以封闭非特异性结合位点。
免疫印迹实验报告——westerblot
免疫印迹实验报告——westerblotWestern blot实验报告摘要：目的：学习并掌握western blot分离蛋白及观察方法方法：western blot结果：见后文结论：western blot能很好地分离蛋白关键词：western blot、分离、小鼠组织、蛋白Western blot test reportAbstract: objective: Learn and master the western blot protein isolated and observation method Methods: western blot：,sds-page and electric transferResults: see belowKey words: Western blot、separate、mouse tissues、protein 前言:免疫印迹又称Western印迹(Western blotting)，与DNA的Southern印迹技术相对应，两种技术均把电泳分离的组分从凝胶转移至一种固相载体(通常为NC膜)，然后用探针检测特异性组分。
不同的是，Western blotting所检测的是抗原类蛋白质成分，所用的探针是抗体，它与附着于固相载体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。
该技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异敏感等诸多优点，具有从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测，以及从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性。
该技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而无需对靶蛋白进行放射性标记。
目前，Western blotting广泛用于蛋白质研究、基础研究和临床医学的研究。
免疫印迹可分成两个步骤：蛋白质由凝胶转移至固相基质；特异性抗体检测。
蛋白质转移通常由电泳实现，现常用的方法有二：1 半干法：将凝胶和固相基质似三明治样夹在缓冲液湿润的滤纸中间，通电10-30分钟可完成转移；2 湿法：将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电45分钟或过夜课完成转移。
重组蛋白实验报告
一、实验目的本实验旨在通过基因工程手段，构建表达重组蛋白的载体，并在宿主细胞中进行表达，随后对表达的重组蛋白进行纯化，以获得高纯度的目标蛋白。
二、实验材料1. 实验试剂：- pET-28a载体- 目的基因片段- restriction enzymes (EcoRI, BamHI)- T4 DNA连接酶- DNA聚合酶- 限制性内切酶缓冲液- DNA分子量标准- 质粒提取试剂盒- 诱导剂 (IPTG)- 细胞培养试剂（DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶等）- 纯化柱（Ni柱）2. 实验仪器：- PCR仪- 紫外分光光度计- 凝胶电泳仪- Western Blot系统- 离心机- 流式细胞仪三、实验方法1. 基因克隆：- 使用PCR技术扩增目的基因片段，并使用EcoRI和BamHI进行酶切。
- 将酶切后的目的基因片段与pET-28a载体连接，并转化大肠杆菌感受态细胞。
- 对转化后的细胞进行PCR检测，筛选出含有目的基因的阳性克隆。
2. 重组蛋白表达：- 将阳性克隆接种于含抗生素的培养基中，培养至对数生长期。
- 加入IPTG诱导剂，调节IPTG浓度至0.1 mM，诱导表达重组蛋白。
- 收集细胞裂解物，进行SDS-PAGE电泳分析重组蛋白的表达情况。
3. 重组蛋白纯化：- 使用Ni柱对细胞裂解物进行亲和纯化。
- 通过梯度洗脱，收集含有重组蛋白的洗脱液。
- 使用Western Blot检测纯化蛋白的纯度。
4. 重组蛋白活性检测：- 使用流式细胞仪检测重组蛋白的活性，以验证其功能。
四、实验结果1. 基因克隆：- 成功构建了含有目的基因的重组质粒，经PCR和酶切验证无误。
2. 重组蛋白表达：- 在IPTG诱导下，成功表达出重组蛋白，SDS-PAGE电泳结果显示目的蛋白条带清晰。
3. 重组蛋白纯化：- 使用Ni柱纯化后，重组蛋白的纯度达到90%以上。
4. 重组蛋白活性检测：- 通过流式细胞仪检测，重组蛋白具有良好的活性。
实验七蛋白质免疫印迹实验WesternBlotting
一 实验原理
电泳将蛋白质从凝胶转移到固体支持物 上是通过电转移仪器完成的。它是将固 体支持物面对阳极、凝胶面对阴极，二 者结合在一起，然后将外面二侧用 Whatman 3MM滤纸结合，形成“三明治” 结构，放入电转移仪器上，加入电泳缓 冲液，通上电源后，蛋白质即可从凝胶 上转移到固体支持物上。
一 实验原理
二试剂和 NaCl 8g,KCl 0.2g,Na2HPO4 1.44g,KH2PO4 0.24g 加双蒸水800ml,用HCl调pH到pH7.4,再加水到1000ml, 分装后，15磅20分钟灭菌。 4-氯萘酚显色液：用30mg 4-氯萘酚（简称4-CN）溶 于1ml无水乙醇中制成母液。将50μ14-CN对母液和 5μ130%的H2O2加入到5ml 0.05M/L Tris-Cl(pH7.6)中。 氨基黑染色液：0.1%氨基黑10-B、45%甲醇、10%冰 乙酸 氨基黑脱色液：90%甲醇、2%冰乙酸、8%水
二试剂和器材
2．器材 电转移仪器 恒温摇床 硝酸纤维素薄膜 Whatman 3MM滤纸 电泳仪 裁纸刀 φ25cm培养皿
玻璃棒
三 操作步骤
1蛋白质电转移 戴上手套，取下SDS-PAGE凝胶，小心剥离凝胶。裁剪与凝胶同样大的 硝酸纤维素薄膜和六层Whatman 3MM滤纸，在硝酸纤维素薄膜左下角 剪去一角作为标记。将硝酸纤维素薄膜漂浮于去离子水的表面，使水从 膜的下部浸透以去除其间气泡，将Whatman 3MM滤纸在电转移缓冲液 中浸湿，用蒸馏水淋洗石墨电极，先将三层浸湿的滤纸放在阳极上，在 滤纸表面滚动玻璃棒以除去其间的气泡，再将浸湿的硝酸纤维素薄膜小 心平铺在滤纸上，用玻璃棒小心去除气泡。随后将12%SDS-PAGE凝胶 舒展平铺在硝酸纤维素薄膜上，用玻璃棒小心去除气泡，再将三层浸湿 的滤纸平铺在凝胶上，沁心去除气泡，最后加上石墨电极板，接通电源 进行电转移，电流的大小由凝胶的大小决定，为0.65mA/平方厘米。电 转移2小时后，停止通电，卸掉电转移装置，取下凝胶进行考马斯亮兰 染色，以检测电转移是否完全。小心取下硝酸纤维素薄膜，放在一张干 滤纸上，吸干30-60分钟后，开始进显色反应。
08实验八WesternBlot鉴定目的蛋白质资料
12%分离胶
试剂名称
ddH2O 30% Acr-Bis（29:1） 1.5 mol/L Tris-HCl（pH8.8）
10% SDS TEMED（加速剂） 10% AP（催化剂，最后加）
总体积
加液量
2.5 mL 3.0 mL 2.0 mL 75 uL 10 uL 75 uL 7.5 mL
5%浓缩胶
100 mmol/L Tris-HCl，pH7.5 10 mL
DAB储存液（40 mg/mL） 200 uL
NiCl溶液（80 mg/mL）
50 uL
30% H2O2
30 uL
Western Blotting 试剂
6.一抗（兔抗GST） 按1:1000稀释，15 mL TTBS中加入15 uL抗体。
压调到130 V，溴酚蓝接近胶底部时，停止电泳。 8. 拆开玻璃板，切去多余的凝胶。（不要染色）
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
预未已第 第第 第 染纯纯一 一二 二
化化组 组组 组 号 号号 号 管 管管 管 纯 纯纯 纯 化 化化 化
3
2
3
2
30 uL
30 uL
Байду номын сангаас
Marker 5 uL
30 uL
9 d 14 d 19 d
24 d
Marker
250 KD 95 72
55
36 28
实验材料和试剂
SDS-PAGE试剂
1. 30%丙烯酰胺:29 g丙烯酰胺，1.0 g N,N-亚甲基双 丙烯酰胺，溶于60 mL水中，加热溶解，补水至 100 mL。过滤，4℃保存。
2. 10% AP（过硫酸铵）:1.0 g AP，加10 mL水（现 用现配后失效）。
实验九_Western_Blot鉴定目的蛋白(14)
12%分离胶
2.5 mL 3.0 mL 2.0 mL 75 uL 10 uL 75 uL 7.5 mL
5%浓缩胶
试剂名称 ddH2O 30% Acr-Bis （29:1） 1M Tris-HCl（pH6.8） 10%SDS TEMED（加速剂） 10%AP（催化剂，最后加） 总体积 5% 1.7 mL 0.43mL 0.31mL 25 uL 10 uL 25 uL 2.5 mL
8、80V电泳20min，等蛋白进入分离胶后，将电压调节到120V，电 泳2h。
9、溴酚蓝接近胶底部时，关闭电源。电泳结束
10、撬开玻璃板，根据预染Marker和溴酚蓝的位 置切去浓缩胶和多余的分离胶，（不要染色）
Western blotting 转膜
（操作过程带手套）
1、用尺量出胶的长度和宽度 2、用裁纸刀裁出12张与胶大小一样的滤纸和1张同样大 小硝酸纤维素膜（NC膜）。 3、加10 mL转膜缓冲液到培养皿中，将凝胶、NC膜、 滤纸浸泡约5 min。 4、将凝胶、NC膜、滤纸按照图示安装好。 5、20V电转移20-30分钟
一抗和二抗溶液必须回收！！
杂交
5、取出NC膜，放在一个干净的容器内，加入10 mL封闭 液，平缓摇动30min。（封闭膜上非特异结合位点） 6、回收封闭液，用10mL TTBS洗膜5 min，重复3次。 （洗去过量的奶粉） 7、加入一抗溶液（10mL），摇动30 min。（与抗原结合） 8、回收一抗溶液，10mL TTBS洗膜5 min，重复3次。 （一抗可以重复使用） 9．加入二抗溶液（10mL），摇动30 min。（与一抗结合） 10、回收二抗溶液，10mL TTBS洗膜5 min，重复3次。 （二抗可重复使用）
※水封的目的是为了使分离胶上沿平直，并排除气泡。 ※凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。 ※样梳需一次平稳插入。梳口处不得有气泡，梳底需水平。
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生物化学实验报告记录：Westernblotting检测大肠杆菌重组蛋白————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期：实验三 Western blotting检测大肠杆菌重组蛋白一、实验目的利用Western Blotting技术，定性（或定量）检测苦荞黄酮醇合酶基因（Flavon ol synthase gene, FtFLS）在大肠杆菌表达宿主菌Escherichia coli BL(DE3)中的诱导表达。
二、实验原理黄酮醇合酶（FLS，EC 1.14.11.23）属于2-ODD家族，催化黄酮醇合成支路中最后一步氧化反应，也是直接合成黄酮醇的反应。
FLS可以使二氢黄酮醇在C3链中C2和C3之间氧化形成双键，从而生成黄酮醇：a Dihydroflavonol + 2-oxoglutarate + O2 a Flavonol + succinate + CO2 + H2O。
本实验采用PCR的方法，在苦荞黄酮醇合酶基因（FtFLS）ORF起始密码子前引入KpnІ酶切位点，去掉终止密码并引入Bam H І酶切位点。
克隆引入酶切位点后的FtFLS到表达载体pET-30b(+)质粒中，其表达产物分别在N-末端和C-末端各含有6 ×His标签。
重组质粒（pET-30b(+)-FtFLS）经鉴定后转化表达宿主菌E. coli BL21(DE3)并使用IPTG进行诱导表达。
收集诱导0 h、2 h、4 h、6 h和8 h的产物，经SDS-PAGE后用于考马斯亮蓝R-250染色或Western blotting分析。
Western blotting的标准流程如下：蛋白质首先通过SDS-PAGE胺凝胶电泳分离，通过电泳转移到固相支持物上（硝酸纤维素膜、PVDF膜和尼龙膜）；将膜上未反应的位点封闭起来，以抑制抗体的非特异性吸附，固定的蛋白质即可与特异性的多克隆或单克隆抗体相互作用并通过放射、生色或化学发光的方法进行定位。
本实验采用小鼠抗聚组氨酸单克隆抗体（Anti-His tag IgG，一抗）与重组FtF LS蛋白的N-末端和C-末端6 ×His发生抗原-抗体特异反应，再利用辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG（peroxidase-Goat Anti- Mouse IgG，二抗）与一抗发生特异结合，最后使用DAB进行显色。
DAB即：二氨基联苯胺（3, 3'-diaminobenzidine），是过氧化物酶（Peroxidase）的生色底物。
DAB在过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色变化和积累，形成浅棕色不溶性产物。
该方法常用于检测过氧化物酶的活性，它灵敏度高，特异性好，在免疫组化，原位杂交，Western blotting等膜显色中应用广泛。
三、操作步骤3.1 样品的制备原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测大肠杆菌重组蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。
材料与试剂：重组pET-30b(+)-FtFLS质粒、表达宿主菌E. coli BL21(DE3)、LB固体培养基（Kan 50μg/mL）、LB 液体培养基（10mL、50mL）、Kan（50 mg/mL）、IPTG（24 mg/mL）、PBS缓冲液、5 X SDS上样缓冲液。
仪器与设备：恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、酒精灯、消毒酒精（75%）、棉球、接种环、台式离心机、冰盘、Tip（10 μL、200 μL、1 mL）、微量加样器（10 μL、200 μL、1 mL）、离心管（1.5 mL、10 mL）。
操作步骤：①含重组质粒pET-30b(+)-FtFLS的表达宿主菌E. coli BL21(DE3)划线于LB 固体培养基（Kan抗性），37℃培养16 h。
②挑选单菌落，接种至10 mL LB培养基（按0.1%加入Kan，10 μL）于37 ℃过夜培养，即为种子液。
③按2 %的接种量（1 mL）将种子液接种到50 mL LB Kan培养基中（按0.1%加入Kan，50 μL），于37 ℃培养OD600至0.5（约2.5 h）。
④加入IPTG至终浓度为1 mmol/L（100 μL），置于25℃连续诱导表达8 h，分别取诱导前0 h，诱导后2 h、4 h、6 h和8 h的培养液5 mL于10 mL离心管中，置于冰水混合物上备用。
⑤诱导完毕后，各样品于8000 rpm（12000 rpm易爆管）离心5 min收集沉淀，用等体积PBS（5 mL）重悬漂洗细胞2次，收集菌体。
⑥各管分别加入400 μL PBS重悬细胞，加入100 μL 5 X SDS上样缓冲液，置于沸水浴中10 min（注意防止爆管）。
注意事项：①重组蛋白的诱导表达应进行正确的无菌操作并加入适宜浓度的抗生素，避免可能的污染。
②在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性。
③选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键。
尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子。
④制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰。
⑤样品建议分装成合适的量（比如分装出20ul检测蛋白质定量用），然后保存与-20°或-80℃中长期保存，但要注意不要反复冻融，因为会使蛋白的抗原特性发生改变。
3.2 SDS-PAGESDS-PAGE（SDS变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳）的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异。
因为SDS-PAGE上样缓冲液含有SDS和巯基乙醇（2-ME）或二巯基赤藓醇（DTT），其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键、分子内氢键、破坏蛋白质的高级结构、形成SDS-蛋白质复合物。
该复合物形成榛状结构，平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子，使其带有大量的负电荷（蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖），从而消除了不同分子之间原有的电荷差别。
材料与试剂：①分离胶缓冲液（1.5 mol/L Tris-HCl，0.4% SDS，pH 8.8）。
②浓缩胶缓冲液（0.5 mol/L Tris-HCl，0.4% SDS，pH 6.8）。
③30%丙烯酰胺/N, N'-亚甲基双丙烯酰胺（Arc/Bis）：29.2 g Acr，0.8 g Bis，定容至100 mL。
④10%过硫酸铵（W/V），需新鲜配制。
⑤ 2 X 上样缓冲液（pH 8.0）：含0.5 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）2 mL，甘油2 mL，20% SDS 2 mL（W/V），0.1%溴酚蓝0.5 mL，2-β-巯基乙醇（2-ME）1.0 mL，定容至10 mL。
⑥电极缓冲液（pH 8.3）：3.03 g Tris，14.41 g Gly，1.0 g SDS，调整pH后定容至1000 mL。
⑦染色液：45%甲醇，10%乙酸，0.25%考马斯亮蓝R-250。
⑧脱色液：10%（V/V）乙酸，5%（V/V）乙醇。
⑨封底胶：1g琼脂糖溶于100 mL电极缓冲液。
⑩预染标准分子量蛋白质Marker。
仪器与设备：垂直板电泳槽及其附件，电炉，电泳仪，微量加样器（10 μL），Tip（10 μL）。
操作步骤：①电泳槽的安装：将成套的两块玻璃板正确放入硅胶条中，夹在电泳槽里，按对角线顺序旋紧螺丝（注意分辨上下槽）。
用1%的琼脂糖封底（封于下槽底部），待琼脂糖凝固后即可制胶。
②制胶：选择合适的胶浓度，按下表配制分离胶，灌入两玻璃板之间，加至距短玻璃板顶端3 cm处，立即覆盖5 mm左右水层，静置等待聚合，当分离胶与水层之间的界面重新出现时表明胶已聚合。
小心倒掉分离胶上水层，配制浓缩胶后加入玻璃板中，插入梳子并及时补充由于浓缩胶聚合产生的空隙（该过程避免气泡的产生）。
本实验选用12.5%的SDS-PAGE胶对重组FtFLS进行分离。
试剂分离胶浓缩胶浓度7.5% 10% 12.5% 15% 30% 4% 分离胶缓冲液mL 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 -浓缩胶缓冲液mL - - - - - 1.25Acr/Bis mL 4.0 5.3 6.7 8.0 10.7 0.75H2O mL 8.0 6.7 5.3 4.0 1.3 3.010% AP mL 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.15TEMED mL 0.008 0.008 0.008 0.008 0.008 0.005③点样：分别在上下电泳槽中倒入电极缓冲液，上槽淹没短玻璃板，下槽淹没电极即可。
此时，小心拔出梳子，用微量加样器调整点样孔之间的浓缩胶（此步骤应检查电泳槽是否漏液）。
使用微量进样器分别在样品槽内分别加入预染的标准分子量蛋白质、诱导前0 h，诱导2 h、4 h、6 h和8 h后处理好的样品18 μL（上样总体积一般不超过15 μL，加样孔的最大限度可加20 μL样品）。
④电泳：接通电源，调节电压至100 V，恒压电泳；待指示剂进入分离胶后，调节电压至200 V恒压电泳。
待指示剂在分离胶中迁移5-6 cm左右时，停止电泳。
剥胶：小心剥胶，将浓缩胶（浓缩胶影响操作）和分离胶上不用的部分切去（便于识别），见图3和图4.⑤染色：凝胶经蒸馏水漂洗1次后加入染色液，电炉加热处理10-20 min染色。
⑥脱色：使用蒸馏水漂洗取出染色液，加入脱色液，电炉加热脱色至出现清晰的蛋白条带。
注意事项：①上样总体积一般不超过15μL，胶孔的最大限度可加20μL样品。
②微量加样器应贴壁吸取样品，避免吸进气泡；将微量加样器Tip头插至加样孔中缓慢加入样品，避免样品溢出。
③电泳设备应注意检查正负极、是否短路或接触不良、是否漏液、电流电压大小（电流强度会随电泳的进行有所降低）。
④电极缓冲液和AP应新鲜配制，上下槽缓冲液不可混用（电泳完毕分别收集）。
3.3 转膜与杂交杂交膜的选择是决定Western blotting成败的重要环节。
应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。
用于Western blot 的膜主要有两种：硝酸纤维素膜（NC）和聚偏氟乙烯（PVD F）膜。
NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。
根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的NC膜。
因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。
通常用0.45 μm和0.2 μm两种规格的NC膜。
大于20 kDa的蛋白可用0.45 μm 的膜，小于20 kDa的蛋白用0.2 μm的膜。