液相色谱分析的窍门
液相色谱的原理以及操作要点
液相色谱的原理以及操作要点液相色谱（Liquid Chromatography，简称LC）是一种常用的分离和分析技术，它基于不同物质在流动相中的分配行为来实现分离。
本文将介绍液相色谱的原理，同时探讨液相色谱的操作要点。
一、液相色谱的原理液相色谱的原理主要基于两个关键概念：分配系数和吸附性质。
1. 分配系数分配系数（Distribution coefficient）是指样品在固定相和流动相之间的分配比例。
它是液相色谱中物质分离的基础。
分配系数的大小决定了物质在固定相上停留的时间，从而实现了不同成分的分离。
2. 吸附性质液相色谱还涉及到物质在固定相上的吸附行为。
当样品溶液通过固定相时，固定相表面上的吸附剂与样品物质发生相互作用，使得物质被吸附，从而发生分离。
二、液相色谱的操作要点为了有效地进行液相色谱实验，以下是一些操作要点需要注意：1. 样品制备样品制备是液相色谱分析的首要步骤。
样品应准备恰当，并考虑到溶解度、稳定性以及待分析物之间的相互干扰。
此外，样品需要经过适当的前处理（如过滤、稀释等）以达到分析要求。
2. 流动相选择流动相的选择对液相色谱分离效果起到至关重要的作用。
合适的流动相应能够与待分析物有良好的相容性，并且具有适当的溶解性和流动性。
常用的流动相包括水、有机溶剂和缓冲溶液。
3. 固定相选择固定相是液相色谱中的另一个关键部分。
不同的固定相具有不同的化学性质，因此会影响到分离的选择性和效果。
根据待分析物的特性，选择合适的固定相对于分离效果至关重要。
4. 色谱柱选择色谱柱是液相色谱系统中用于分离的核心组成部分。
不同的色谱柱具有不同的长度、直径和固定相材料，这些参数会影响到分离性能和分析时间。
根据待分析物的特性和分离要求，选择合适的色谱柱尤为重要。
5. 色谱条件优化为了获得最佳的分离效果，需要进行色谱条件的优化。
例如，可以调整流速、梯度程序和柱温等参数，以达到更好的分离和峰形。
6. 数据处理和解释液相色谱实验完成后，需要对得到的色谱图进行数据处理和解释。
高效液相色谱的分离和分析
高效液相色谱的分离和分析高效液相色谱（HPLC）是现代化学分析领域中最重要的分离技术之一。
它在食品、制药、生物技术、环境科学和研发等领域都有广泛的应用。
本文将从HPLC 的基本原理出发，介绍它的分离和分析方法，以及这种技术的优点和局限性。
一、HPLC的基本原理HPLC是基于分配系数的原理，它利用固定相和移动相之间的相互作用来分离化合物。
固定相是一种由颗粒状或均匀涂覆在支撑材料表面的成膜状材料，例如硅胶、碳等。
移动相是一种由溶剂混合物组成的流体，它会在固定相表面通过，与固定相相互作用。
利用HPLC进行分离的过程包括样品进样、移动相泵送、分离柱和检测器等四个步骤。
样品进入分离柱以后，会在固定相上被分离，所分离的成分将按照固定相的吸附能力和移动相的溶解能力来进行分离。
为了实现快速、高效的分离，通常我们会通过改变流速、操作温度和pH等参数来优化HPLC的分离效率。
二、HPLC的分离和分析方法在HPLC中，常用的分离方法主要包括反相色谱、离子交换色谱、凝胶过滤色谱、亲和层析和大小排除色谱等。
这些分离方法都具有不同的选择性和分离效率，因此它们可以用于分离许多复杂的混合物。
反相色谱是最常用的HPLC分离方法之一，它的固定相通常是极性低的碳氢化合物，而移动相则是一种极性高的溶剂体系，例如水-乙腈或水-甲醇混合物。
这种方法可以用于分离许多非极性化合物，例如蛋白质。
离子交换色谱则同时考虑样品的电荷，它利用固定相和移动相之间原子间相互作用而实现分离。
移动相是一个由缓冲溶液、盐和极性有机溶剂组成的混合物。
这种方法可以用于分离具有不同离子性质的化合物，例如金属离子和生物分子等。
凝胶过滤色谱则是一种根据分子尺寸实现分离的方法。
在实践中，它经常被用于生物分子的纯化和分离。
它的固定相通常是一种可逆性的凝胶，例如硅胶或者聚乙烯醇。
这种类型的柱子对大分子具有很好的分离效果，但是对小分子的分离效果相对较差。
亲和层析则是一种根据生物分子之间的相互作用实现分离的方法，例如抑制剂和受体之间的相互作用。
利用高压液相色谱仪进行分离实验的技巧
利用高压液相色谱仪进行分离实验的技巧高压液相色谱仪（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种常用的色谱分析仪器，通过将混合物分离成单个组分，可以对样品中的化学成分进行定性和定量分析。
在实验室的研究工作中，熟练掌握HPLC的操作技巧和分析方法是非常重要的。
本文将介绍一些利用HPLC进行分离实验的技巧。
首先是样品的准备工作。
在进行HPLC分析之前，样品的准备对于分离效果的优劣有着重要的影响。
一般来说，样品应当先进行适当的预处理，例如提取、净化或浓缩。
此外，在进行样品准备时还需要注意避免引入杂质和不溶物，以免影响分析的准确性。
其次是流动相的选择。
流动相是指在HPLC中用于溶解和输送样品的溶剂。
选择合适的流动相对于分离效果和分析时间都非常重要。
常用的流动相包括水、有机溶剂和缓冲溶液。
根据分析的目的和样品的性质，可以通过调整流动相的成分、浓度和pH值等参数来优化分离效果。
接下来是柱子的选择。
在HPLC中，柱子是起到分离和提取样品的重要组成部分。
根据试验需要，选择合适的柱子来进行分析是至关重要的。
常见的柱子类型包括反相柱、离子交换柱和手性柱等。
选择柱子时需要考虑样品的性质、分离选择性和分析时间等因素，以达到最佳的分离效果。
另外一个关键点是进样技巧。
进样是将样品引入HPLC系统的过程，其准确性和精确性对于分析结果具有重要影响。
通常情况下，采用自动进样器可以更好地控制进样体积和进样速度。
同时，在进行进样时还需注意避免气泡的产生，以免影响峰形和峰高。
此外，还需注意HPLC的操作条件。
操作条件包括流动相流速、柱温、检测器选择等参数。
这些操作条件直接影响分析的灵敏度和分离效果。
在进行实验之前，需要对不同的样品系统进行优化实验，以确定最佳的操作条件。
最后是数据处理和结果分析。
在HPLC实验中，通过检测器扫描样品溶液，可以获取吸光度随时间变化的数据。
根据峰的形状、面积和保留时间等参数，可以对样品中的组分进行定性和定量分析。
液相色谱注意事项及处理
液相色谱注意事项及处理液相色谱（HPLC）是现代化学分析中广泛应用的一种方法，它基于样品在流动相中的分离性质，通过分离和测定样品中的化合物。
以下是一些液相色谱操作中需要注意的事项以及常见的问题处理方法。
1.选择适当的柱子和固定相：-根据样品的性质、需要分离的化合物以及分离条件，选择适当的柱子和固定相。
柱子和固定相的选择对分离效果和分析结果至关重要。
2.准备好合适的流动相：-流动相的成分和性质直接影响分离效果。
需要注意流动相的溶剂纯度、特性以及配置方法。
合适的流动相可提高分离效果。
3.样品溶解及进样：-样品的溶解度及进样方法是分离的关键。
应根据样品特性选择适当的溶剂进行溶解，并确保进样量适中。
过高的样品浓度可能导致柱子堵塞或在检测器中引起峰形变。
4.良好的柱温控制：-柱温的控制对于提高分离效果和重现性至关重要。
柱子的工作温度应控制在恒定的范围内，以减小流动相的变化对结果的影响。
5.流速控制：-流速对分离时间、峰形和峰分离度有很大影响。
根据分析要求和实验条件选择合适的流速。
过高的流速可能导致峰形变差，而过低的流速可能导致分离不完全。
6.运行条件的优化：-运行条件的优化对提高方法的灵敏度和分离效果至关重要。
可以通过调整流动相的成分、柱温、流速等参数来优化方法。
试验不同条件，并选择最适合的条件。
7.检测器使用和校准：-液相色谱中常用的检测器包括紫外检测器、荧光检测器、电化学检测器等。
使用检测器时，注意校准和灵敏度调整。
8.数据分析和结果解释：-得到的色谱图需要进行数据分析和结果解释。
尽可能使用专业的数据分析软件进行峰面积的计算和样品的定量分析。
常见问题处理方法：1.噪声问题：-噪声问题可能由仪器本身的电子噪声或环境噪声引起。
可以尝试提高信号峰值，调整积分时间或使用峰值选定的方法来处理噪声。
2.色谱峰形变差：-色谱峰形变差可能是由于流动相成分变化、柱子老化或柱温不稳定引起的。
可以尝试更换柱子、重新配置流动相、调整柱温或优化运行条件来解决此问题。
关于液相色谱的定量分析
定量分析是在定性分析的基础上，需要纯物质作为标准样品。
液相色谱的定量是相对的定量方法，即：由已知的标准样品推算出被测样品的量。
液相色谱法定量的依据被测组分的量(W)与响应值(A)（峰高或峰面积）成正比,W=f×A。
定量校正因子(f)：是定量计算公式的比例常数，其物理意义时单位响应值（峰面积）所代表的被测组分的量。
由已知标准样品的量和其响应值可以求得定量校正因子。
测定未知组分的响应值，通过定量校正因子即可求得该组分的量。
定量分析常用术语：样品（sample）：含有带测物，供色谱分析的溶液。
分为标样和未知样。
标样（standard）：浓度已知的纯品。
未知样（unknow）：浓度待测的混合物。
样品量（sample weight）：待测样品的原始称样量。
稀释度（dilution）：未知样的稀释倍数。
组分（componance）：欲做定量分析的色谱峰，即含量未知的被测物。
组分的量（amount）：被测物质的含量（或浓度）。
积分（integerity）：由计算机对色谱峰进行的峰面积测量的计算过程。
校正曲线（calibration curve）：组分含量对响应值的线性曲线，由已知量的标准物建立，用于测定待测物的未知含量。
常用的定量方法1外标法标准曲线法，分为外标法和内标法。
外标法在液相色谱中用的最多。
内标法准确但是麻烦，在标准方法中用的最多。
用被测化合物的纯品作为标准样品，配制成一系列的已知浓度的标样。
注入色谱柱的到其响应值（峰面积）。
在一定范围内，标样的浓度与响应值之间存在较好的线性关系，即W=f×A，制成标准曲线。
在完全相同的实验条件下，注入未知样品，得到欲测组分的响应值。
根据已知的系数f，即可求出欲测组分的浓度。
外标法的优点：操作、计算简单，是一种常用的定量方法；无需各组分都被检出、洗脱；需要标样；标样及未知样品的测定条件要一致；进样体积要准确。
外标法缺点：实验条件要求高，如检测器的灵敏度，流速、流动相组成的不能发生变化；每次进样体积要有好的重复性。
高效液相色谱的使用方法
高效液相色谱的使用方法高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种用于分离、分析和测定混合物中组分的技术。
以下是高效液相色谱的使用方法：1. 样品制备：根据需要，样品可以通过溶解、浸提、纯化等方法进行前处理。
确保样品是均匀的，并且符合HPLC分析要求。
2. 选择合适的色谱柱：根据分析目标，选择合适的色谱柱，包括固定相（C18、C8、氨基、芳基等）和柱型（反相、离子交换、排除等）。
色谱柱质量对分离和分析结果至关重要。
3. 准备移动相：根据色谱柱要求和分析目标，选择合适的移动相。
移动相通常由溶剂和缓冲液组成，可以通过改变溶剂的组成和比例来调节色谱条件。
4. 设定色谱条件：根据需要，设定合适的色谱条件，包括流动相速度、柱温、检测波长等。
这些条件将直接影响分离的效果和分析的准确性。
5. 校准仪器：在开始分析之前，校准色谱仪和检测器，确保其准确性和稳定性。
校准通常包括检测器灵敏度、波长、流速等参数。
6. 注样和运行：将样品注入色谱柱，启动色谱仪，使移动相通过柱子，分离出样品中的各组分。
根据需要，通过改变运行时间、流速等参数，调节分离和分析的效果。
7. 数据分析：通过检测器检测样品中各组分的吸光度或荧光强度，并记录数据。
可以使用特定的色谱软件对数据进行处理和解析，以获得准确的分析结果。
8. 数据解释：根据分析结果，对样品中的各组分进行定量或定性的解释。
可以使用标准品进行定量分析，或者与已知数据进行比对，以确认各组分的身份和浓度。
9. 清洗和维护：在完成分析后，及时清洗色谱柱和仪器，以保持其性能和寿命。
根据需要，使用适当的溶剂进行清洗，并使仪器处于良好的工作状态。
总之，高效液相色谱的使用方法包括样品制备、色谱柱选择、移动相准备、色谱条件设定、校准仪器、注样和运行、数据分析、数据解释以及清洗和维护等步骤。
熟练掌握这些方法能够有效地进行高效液相色谱的分离和分析。
液相色谱分析方法开发的技巧
液相色谱分析方法开发的技巧你是否一直头疼于液相实验室或是方法开发问题出现的各种意外状况？或许本文总结的“应该避免做的七件事【DDT（Don't Do That）】”可以帮到你。
以下提到7个DDT并没有特别的先后顺序，但是如果都能避免的话，我相信可以让在实验室的日子少一些鸡飞狗跳，多一些岁月静好。
DDT #1：不要滴定含有有机溶剂的溶液配制缓冲液和并调节其pH有三种方法：正确的方法，简便的方法和错误的方法。
例如我们打算配1000 mL pH 4.0，浓度为20 mM的醋酸盐缓冲液。
正确的方法根据一些网站或者计算工具的计算结果称量好需要的醋酸和醋酸钠的量，然后使用容量瓶稀释到1000 mL。
或者也可以分别配好20mM的醋酸溶液和醋酸钠溶液，然后混合在一起直到测到的pH是4.0为止。
这两种方法都可以得到大约1000 mL pH 4.0 浓度20 mM的缓冲液。
简便的方法是先配好1000 mL 20mM的醋酸钠溶液，然后使用浓醋酸滴定到pH达到4.0。
这方法会配得比1000 mL稍微多的缓冲液，而且使用了高浓度的醋酸滴定，所以缓冲液浓度不再是20mM。
但是这有关系吗？如果使用反相柱的话，缓冲液的浓度影响并不大，所以得到的谱图基本不会有差别。
但是如果使用离子交换、HILIC、混合模式或是其他的离子作用模式，缓冲液的浓度就有影响了，这时使用上述两种不同方法配出来的缓冲液很可能得到不同的谱图。
所以在这些情况下不管使用哪一种方法配制的缓冲液，都要把配制具体方法记录下来，确保以后的分析人员在重复实验时可以得到相同的分析结果。
错误的方法是将缓冲液与有机溶剂（如甲醇或者乙腈）混合后再进行pH滴定。
要知道当把有机溶剂加入到水溶液中后，pH计会测出与加入有机溶剂前不同的数据，而且实验室的温度对滴定含有有机溶剂的缓冲液影响也大，我就有遇到使用这种方法配出的缓冲液，在夏天开发出来的方法，在冬天就没法重复，就是因为实验室温控不好而导致冬夏温差大，结果冬天和夏天利用这方法配制的缓冲液就有明显的差异。
高效液相色谱测定含量的方法
高效液相色谱测定含量的方法
高效液相色谱（High-Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种广泛用于测定化合物含量的分析技术。
以下是一般的HPLC测定含量的步骤和方法：
1.样品制备：根据分析的目的，准备含有目标化合物的样品。
样
品制备可能涉及提取、溶解、过滤等步骤。
2.标准曲线制备：准备一系列已知浓度的标准溶液，用于建立标
准曲线。
标准曲线上的点数通常越多越好，以提高测定的准确
性。
3.HPLC系统设置：设置HPLC系统，包括选择合适的色谱柱、
移动相（流动相）和检测器。
根据样品性质和目标分析物，选
择适当的柱和检测条件。
4.进样：将标准溶液和待测样品注入HPLC系统。
通常使用自动
进样器，以提高精度和重复性。
5.色谱条件优化：通过调整流速、温度等条件，优化色谱分离，
使目标化合物得到良好的分离和峰形。
6.数据采集和分析：使用检测器（如紫外-可见（UV-Vis）检测
器）记录样品在色谱柱中的吸收峰，并使用标准曲线计算目标
化合物的浓度。
7.质量控制：包括在分析中加入质量控制样品，以确保实验的准
确性和可靠性。
8.结果报告：报告目标化合物的浓度，通常以样品中目标化合物
的峰面积或峰高度与标准曲线的关系来表示。
需要注意的是，HPLC分析的方法会因分析的具体目的和分析物的性质而有所不同。
因此，在进行HPLC分析之前，建议参考相关的方法学文献、标准操作程序（SOP）或咨询有经验的分析师。
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过去了几十年，填料制备技术不断进步，硅胶仍然难以完全封尾。
3.2 峰形不佳的成因
A 以硅胶为填料的先天劣势
新填料技术1：三甲基硅烷末端封尾、三甲基硅烷二次封尾，已被普遍采用
3.2 峰形不佳的成因
A 以硅胶为填料的先天劣势
新填料技术2：高分子包被，月旭的Gemini等采用此技术。
3.2 峰形不佳的成因
离
二甲基苯氧乙酸的案例
色谱柱：Ultimate® XB－C18，5um，4.6×250mm； 波 长：280 nm； 磷酸盐缓冲溶液的配制：准确称取磷酸二氢钠7.8g溶于1000ml水中，搅拌均匀，使之 溶解，用磷酸将pH值调至2.50； 温 度：室温26℃； 流 速：1.0ml/min； 进样量：20ul；
3.2 峰形不佳的成因
3.2 峰形不佳的成因
C 色谱柱柱头污染、筛板堵塞、柱头塌陷
D 化合物的特性
3.2 峰形不佳的成因
互变异构（比例不稳定型） 互变异构（比例稳定型） 络合物前体构型
跛子构型
自体排斥/大分子构型
易解离构型
3.2 峰形不佳的成因
E 粒径不均填料、重金属超标填料、填料完全坍塌、硅胶崩解、C18链水解、C链倒伏
100mM高氯酸钠 pH 2.5 BDS柱
结束语
色谱分析会面临各种各样的难题：化合物的分离、 峰型的优化、系统污染、梯度干扰、基线波动及噪音升高、 压力波动等，数不胜数，目不暇接。
但只要我们多关注现象背后的本质，多积累问题解 决的案例，定能练就一双看透色谱分析疑难杂症的“慧眼”！
谢谢！肖策 20150411
有关物质检测时确定样品浓度会面临两难选择。浓度低则定量限 偏低，浓度高则峰型不佳。
B 后拖尾应对措施
3.3 拖尾峰形的改良办法
1. 先检查一下是否是样品过载
B 后拖尾应对措施
3.3 拖尾峰形的改良办法
1. 先检查一下是否是样品过载，若是则降低浓度
头孢尼西钠的案例
如果发现过载，需降低进样量（包括进样体积或浓度），但不管怎么样，减少进样量通常对改善峰形 总是有益的，一般而言，进样量越小，峰形越好。
A 后拖尾现象
3.3 拖尾峰形的改良办法
B 后拖尾应对措施
3.3 拖尾峰形的改良办法
1. 先检查一下是否是样品过载
样品过载，通常会引起峰形变差，导致前拖、后拖或平头峰，如 果出现平头峰、峰高超过2000mAU或峰很高的同时又前拖、后拖得很厉害 通常都认为是过载的，但这一点也并不绝对，如果一种化合物在某一波长 处有强吸收，即使出现了平头峰，样品也不一定过载，这与仪器和软件有 关，所以样品是否过载应该结合浓度、进样体积和峰形一起来判断。
B 后拖尾应对措施
3.3 拖尾峰形的改良办法Biblioteka 6. 往流动相中加入离子对试剂
米那普仑的案例
离子对试剂相当于一剂猛药。一般缓冲盐解决不了的峰型，考虑用此类试剂。
5mM庚烷磺酸钠 pH 2.5 BDS柱
pH 2.0 BDS柱
100mM磷酸二氢钾 pH 2.5 BDS柱，后来又添 加了三乙胺依然拖尾 严重。
A 以硅胶为填料的先天劣势
新填料技术4： Waters公司在上述工作的基础上制成了全多孔球形1.7μm的UPLC反相固定相，它保持
与传统HPLC固定相的孔径和孔体积，成为商品号为AQUITY UPLCTM新型固定相，
3.2 峰形不佳的成因
A 以硅胶为填料的先天劣势
几种硅胶为担体键合C18柱的比较
B 管路连接死体积
A 以硅胶为填料的先天劣势
新填料技术3： Waters公司1999年使用制备硅胶反相整体柱的原料四乙氧基硅烷 （ TEOS ） ， 利 用 “ 杂 交 颗 粒 技 术 ” 与 1/3 的 甲 基 三 乙 氧 基 硅 烷 （ MTEOS ） 进 行 杂 化 交 联，——XTerra。
3.2 峰形不佳的成因
B 后拖尾应对措施
3.3 拖尾峰形的改良办法
3. 使用缓冲盐，产生比酸碱更好的抑制效果
高乌甲素的案例
虽然加入了三乙胺， 但加入的量非常少， 200ml混合好后的溶液 中，只加入了75ul滴 用于调节pH的（因为 不调节pH，保留时间 太短，在4.2min出 峰），相对于2％的浓 度的量而言75ul是非 常少的，几乎起不到 屏蔽硅羟基的作用， 因此，上图中峰形改 善的原因，主要的应 归功于缓冲盐的加入。
色谱柱：Ultimate® XB－C18，5um，4.6×250mm； 波 长：272nm； 流动相：0.01mol/L磷酸二氢钾（磷酸调节pH3.5）：乙腈＝84：16； 温 度：室温17℃； 流 速：1.0ml/min； 进样量：20ul；
B 后拖尾应对措施
3.3 拖尾峰形的改良办法
2. 往流动相中加入酸或碱，抑制样品或硅胶的解
色谱分析的窍门：透过现象看本质
1 外部视角到内部视角 2 宏观视角到微观视角 3 透过现象看本质(应用于改良拖尾峰型)： 观察峰型→探究原理→解决问题
1 外部视角到内部视角(色谱分离剖面图)
1 外部视角到内部视角(色谱分离示意图)
1 外部视角到内部视角（色谱柱剖解图）
2 宏观视角到微观视角（固定相放大图）
2 宏观视角到微观视角（色谱分离原理图）
2 宏观视角到微观视角（色谱分离原理图）
3.0 形形色色的峰型
3.1 峰形不佳的危害
峰形对称性的优劣对峰面积和分离度有很大的影响，从而影响分析结果的 准确性，是色谱工作者不得不重视的问题，也是让大家最为头疼的问题之一。
3.2 峰形不佳的成因
A 以硅胶为填料的先天劣势
B 后拖尾应对措施
3.3 拖尾峰形的改良办法
4. 往流动相中加入三乙胺
头孢噻肟钠的案例
B 后拖尾应对措施
3.3 拖尾峰形的改良办法
5. 往流动相中加入四氢呋喃
阿莫西林胶囊的案例
往流动相中加入少量的四氢呋喃有时可以改善峰形、增大分离度，很多色谱工作者都知道 和使用，但其机理似乎少人提及。通常所加入的量在5％以内即可，需要的时候可以加入更大的 量。
因此要区分柱过载和检测器过载！
通常认为峰高在100mAU左右比较合适，不至于因过载影响峰形。 由于样品过载引起的峰形后拖不容易消除，也可能根本无法消除，继续采 用以下的峰形改善措施可能不会有什么作用，而且在过载的情况下无法看 清正常浓度时样品真实的分离状况和峰形，因此需要优先考虑是否过载， 否则继续往下调整峰形的努力将无任何意义。