高效液相色谱分析技术—方法开发(陈桂良)
高效液相色谱分析技术—方法开发陈桂良共70页文档
6、纪律是自由的第一条件。——黑格 尔 7、纪律是集体的面貌，集体的声音， 集体的 动作， 集体的 表情， 集体的 信念。 ——马 卡连柯
8、我们现在必须完全保持党的纪律， 否则一 切都会 陷入污 泥中。 ——马 克思 9、学校没有纪律便如磨坊没有水。— —夸美 纽斯
10、一个人应该：活泼而守纪律，天 真而不 幼稚， 勇敢而 鲁莽， 倔强而 有原则 ，热情 而不冲 动，乐 观而不 盲目。 ——马 克思
1、最灵繁的人也看不见自己的背脊。——非洲 2、最困难的事情就是认识自己。——希腊 3、有勇气承担命运这才是英雄好汉。——黑塞 4、与肝胆人共事，无字句处读书。——周恩来 5、阅读使人充实，会谈
高效液相色谱分析技术—应用陈桂良
空白试验
• 空白试验是指在与供试品鉴别试 验完全相同的条件下，除不加供 试品外，其它试剂均同样加入而 进行的试验。
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对照试验 • 用已知含某类成分的中草药
或纯品做阳性对照 ，以排除 假阴性的出现
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杂质分析指导原则
• USP对法定标准中的杂质定义较 详细；
• BP对杂质的确定和测定方法说明 比较具体；
• 质量标准中杂质检查项目的确定主 要供新药的药学研究和质量标准建 立参考；
• 新药中发现的表观含量在0.1%及以 上的杂质和降解产物，以及毒性杂 质，应进行定性或确定结构，即至 少要确定化学类别。仿制药品和变 更工艺或原辅料产生的新杂质，也 应这样进行研究。
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检测对象
• 质量标准中的杂质不包括掺入的 或污染的外来物质，不包括变更 生产工艺或变更原辅料而产生的 新杂质。
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• 取本品与盐酸去甲万古霉素标准 品，分别加水制成每1ml中约含 5mg的溶液，照去甲万古霉素含 量项下的方法试验，供试品与标 准品主峰的保留时间应一致。 （盐酸去甲万古霉素）
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• 在含量测定项下记录的色谱 图中，供试品峰的保留时间 应与对照品峰的保留时间一 致。（醋酸氟氢可的松软膏）
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• ICH对新药和新制剂中的杂质也 有文本介绍。
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杂质定义
• 任何影响药品纯度的物质均称为杂质。 药品质量标准中的杂质系指在按照经 国家有关药品监督管理部门依法审查 批准的规定工艺和规定原辅料生产的 药品中，由其生产工艺或原辅料带入 的杂质，或经稳定性试验确证的在贮 存过程中产生的降解产物。
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制剂中的有ห้องสมุดไป่ตู้杂质
• 常用液相或气相色谱法，有的辅 料在色谱上会误为杂质，所以在 报告中应有用辅料的色谱图，加 主成分和不加主成分的，还有空 白溶液的色谱图。
高效液相色谱法测定葡萄酒的有机酸及乙酸
高效液相色谱法测定葡萄酒的有机酸及乙酸
葡萄酒可谓是文化旅游的典藏，推行数百年的历史沉淀出的极致余韵。
用高效液相色谱法检测出葡萄酒中有机酸及乙酸的表现，无疑对研究深厚的质感做出了一定的贡献。
高效液相色谱法是一种以不断调整液体相态中溶剂体系的特定比例为原理，在一段时间内依次分离混样中各色谱组分成分，并以浓度色谱图的形式显示的技术。
采用此高效液相色谱法在葡萄酒中检测有机酸及乙酸，利用多种滤膜对样品进行过滤，再将其加入带有多种电解质的溶剂体系中，利用色谱仪检测多种有机酸及乙酸等混样组分，并呈现出色谱浓度图，利用质谱处理软件可进行准确的定性及定量处理数据，从而检测出葡萄酒中有机酸及乙酸的基本性质及含量。
使用高效液相色谱法检测葡萄酒中有机酸及乙酸，可大大提升检测葡萄酒的精度。
此方法可检测出葡萄酒中多种有机酸及乙酸的准确性及稳定性，使检测的准确性得到保证。
此外，高效液体色谱法也具有检测快速、选择性强、定性定量准确可靠、重复性好等优势。
使用此法检测葡萄酒的有机酸及乙酸可以极大的提升葡萄酒的口感及质量，从而使消费者获得更高品质的葡萄酒。
从上述内容可以得出结论，使用高效液相色谱法检测葡萄酒中有机酸及乙酸，可以提高葡萄酒的品质，同时也可提高消费者对葡萄酒的爱好和了解。
而采用此检测方法，可以使检测精度达到最高水准，从而保证了葡萄酒的品质及质量。
高效液相色谱分析技术—方法认证和注意事项(陈桂良)
对照品溶液的制备
• 取醋酸可的松对照品适量，精密称定，加甲 醇溶解并稀释制成每1ml中约含醋酸可的松 0.5mg的溶液，摇匀，作为贮备溶液A。另取 盐酸四环素对照品适量，精密称定，加少量 水溶解后，加甲醇稀释制成每1ml中约含盐酸 四环素0.5mg的溶液，摇匀，作为贮备溶液B。 精密量取上述两贮备溶液各5ml置25ml量瓶中， 混匀，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照 品溶液。
定量限
• 定量限系指样品中被测物能被定量 测定的最低量，其测定结果应具一 定准确度和精密度。杂质和降解产 物用定量测定方法研究时，应确定 定量限。常用信噪比法确定定量限。 一般以信噪比为10∶1时相应的浓度 或注入仪器的量进行确定。
线性
• 指在设计的范围内，测试结果与试样 中被测物浓度直接呈正比关系的程度。 应在规定的范围内测定线性关系。可 用一贮备液经精密稀释，或分别精密 称样，制备一系列供试样品的方法进 行测定，至少制备5份供试样品。函 数作图，或用最小二乘法进行线性回 归。响应信号也可经数学转换，再进 行线性回归计算。
色谱峰完整性
• 分析峰完整性和纯度，可以用其 他分析技术证明，如UV方法等也 可用二极管阵列检测器扫描检定， 取峰顶点、中点和底部三处光谱 叠加时应完全重叠。
线性与范围
• 至少用5个标准液为一组，浓度范围 从50～150%，响应与标准浓度（或 进样量）成线性关系，线性回归分 析其相关数应大于0.999。
• 用于溶出度测定的方法及药物释 放度测定的方法，只有精密度和 耐用性有所要求，其余项目可不 作要求。
• 用于生物样品中药物测定的方法， 对精密度、准确度、检测限、选 择性、可测线形范围、定量限、 对生物样品的耐用性以及与参比 方法测得结果的相关程度的比较 等指标应有所要求。
一种用高效液相色谱法测定醋酸赖氨酸中有关物质的方法
一种用高效液相色谱法测定醋酸赖氨酸中有关物质的方法高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，简称HPLC）是一种广泛应用于实验室和工业领域的分析技术。
它是一种以溶液为介质的液相色谱分离技术，其分离原理是依据样品组分在固定相和流动相之间的相互作用力差异将其分离。
醋酸赖氨酸是一种常见的氨基酸，它在生物体内起着重要的生理功能。
为了更好地研究和分析醋酸赖氨酸中的有关物质，可以使用HPLC技术进行测定。
测定醋酸赖氨酸中有关物质的方法如下：1.仪器准备：HPLC仪器由溶液输送系统、样品进样系统、色谱柱和检测器等部分组成。
根据具体实验需要，选择合适的柱和检测器。
2.样品准备：将醋酸赖氨酸样品溶解在适当的溶剂中，如水或有机溶剂。
可以根据实验需要进行前处理步骤，如提取、稀释等。
3.色谱柱选择：根据有关物质的性质和分离需求，选择合适的色谱柱。
一般而言，可以选择反相柱来分离醋酸赖氨酸和有关物质。
4.流动相选择：根据具体实验要求，选择适当的流动相。
一般而言，可以选择水和有机溶剂的混合物作为流动相，通过改变混合物组成和流速来实现分离。
5.进样和检测：使用自动进样器或手动装置将样品进样到色谱柱中。
分析时，设置适当的检测器，并选择合适的检测波长。
6.方法优化和验证：根据实验需要，优化测定方法的参数，如流速、柱温等。
进行方法验证，包括线性范围、灵敏度、精密度和准确度等指标的确定。
7.数据分析：根据检测器所得到的色谱图，通过峰面积或峰高等参数进行定量分析。
可以使用专业的色谱数据处理软件进行数据处理和分析。
HPLC技术可以有效地测定醋酸赖氨酸中有关物质的含量和纯度。
其优点包括灵敏度高、分离效果好、选择性强、操作简便等。
同时，HPLC仪器和试剂的供应也非常便捷，能够满足实验室和工业领域的需求。
总之，通过使用HPLC技术测定醋酸赖氨酸中的有关物质，可以实现准确、快速和可靠的定量分析。
在具体实验中，需要根据具体要求选择合适的方法和参数，并进行合理的方法验证和数据分析。
高效液相色谱分析法概述
高效液相色谱分析技术及其新的发展与应用余建军(陕西科技大学生命科学与工程学院，西安710021)1 高效液相色谱法概述高效液相色谱法（high performanc，liquid chromatography，HPLC）是在经典液相色谱法基础上发展起来的一种新型分离、分析技术。
经典液相色谱法由于使用粗颗粒的固定相，填充不均匀，依靠重力使流动相流动，因此分析速度慢，分离效率低。
新型高效的固定相、高压输液泵、梯度洗脱技术以及各种高灵敏度的检测器相继发明，高效液相色谱法迅速发展起来[1]。
高效液相色谱法与经典液相色谱法比较，具有下列主要特点：（1）高效由于使用了细颗粒、高效率的固定相和均匀填充技术，高效液相色谱法分离效率极高，柱效一般可达每米104理论塔板。
近几年来出现的微型填充柱（内径lmm）和毛细管液相色谱柱（内径0.05umm），理论塔板数超过每米105，能实现高效的分离。
（2）高速由于使用高压泵输送流动相，采用梯度洗脱装置，用检测器在柱后直接检测洗脱组分等，HPLC完成一次分离分析一般只需几分钟到几十分钟，比经典液相色谱快得多。
（3）高灵敏度紫外、荧光、电化学、质谱等高灵敏度检测器的使用，使HPLC 的最小检测量可达10-9～10-11g（4）高度自动化计算机的应用，使HPLC 不仅能自动处理数据、绘图和打印分析结果，而且还可以自动控制色谱条件，使色谱系统自始至终都在最佳状态下工作，成为全自动化的仪器。
（5）应用范围广（与气相色谱法相比）HPLC 可用于高沸点、相对分子质量大、热稳定性差的有机化合物及各种离子的分离分析。
如氨基酸、蛋白质、生物碱、核酸、甾体、维生素、抗生素等。
（6）流动相可选择范围广它可用多种溶剂作流动相，通过改变流动相组成来改善分离效果，因此对于性质和结构类似的物质分离的可能性比气相色谱法更大。
（7）馏分容易收集更有利于制备2 色谱法分类高效液相色谱法按固定相不同可分为液-液色谱法和液-固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液-液色谱）和吸附色谱法（液-固色谱）等[2]。
2005版中国药典附录-高效液相色谱法 (2)
2005版中国药典附录-高效液相色谱法高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。
注入进样阀的供试品，由流动相带入柱内，各成分在柱内被分离，并依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号。
采用微柱液相色谱系统可以减少溶剂的消耗并达到快速分离之目的。
高效液相色谱法的主要分离机制有吸附、分配、离子交换和排阻作用。
1．对仪器的一般要求所用的仪器为高效液相色谱仪。
仪器应定期检定并符合有关规定。
（1）色谱柱最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。
反相色谱系统使用非极性填充剂，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶（如氰基硅烷键合相和氨基硅烷键合相等）也有使用。
正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。
离子交换填充剂用于离子交换色谱；凝胶或高分子微球等填充剂用于分子排阻色谱等；手性键合填充剂用于对映异构体的拆分分析。
填充剂的性能（如载体的形状、粒径、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、含碳量和键合类型等因素）以及色谱柱的填充，将直接影响待测物的保留行为和分离效果。
孔径在150?以下的填料适合于分析分子量小于2000的化合物，分子量大于2000的化合物则应选择孔径在300?以上的填料。
以硅胶为载体的键合固定相填充剂适用pH2～8的流动相。
当pH大于8时，可使载体硅胶溶解；当pH小于2时，与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。
当色谱系统中需使用pH大于8的流动相时，应选用耐碱的填充剂，如采用高纯硅胶为载体并具有高表面覆盖度的键合硅胶、包覆聚合物填充剂、有机-无机杂化填充剂或非硅胶填充剂等；当需使用pH小于2的流动相时，应选用耐酸的填充剂，如具有大体积侧链能产生空间位阻保护作用的二异丙基或二异丁基取代十八烷基硅烷键合硅胶、有机-无机杂化填充剂等。
（2）检测器最常用的检测器为紫外吸收检测器，其他常见的检测器有二极管阵列检测器（DAD）、荧光检测器、示差折光检测器、蒸发光散射检测器、电化学检测器和质谱检测器等。
液相色谱方法开发案例
液相色谱方法开发案例
《液相色谱方法开发案例》
液相色谱方法是一种用于分离、鉴定和定量化化合物的强大工具。
在许多不同的领域，包括制药、食品安全和环境监测等领域，液相色谱方法都被广泛应用。
在这篇文章中，我们将介绍一种液相色谱方法开发的案例，展示了这种方法在实际应用中的重要性和有效性。
在这个案例中，一个制药公司正在开发一种新的药物，需要一个用于分离和鉴定化合物的高效液相色谱方法。
开始时，研究人员使用了传统的柱层析方法，但发现分离效果不佳，并且耗时耗力。
于是，研究人员决定尝试使用液相色谱方法进行开发。
他们首先选择了适当的色谱柱、移动相和检测器，并进行了一系列的试验。
经过不断的优化，他们最终建立了一种高效的液相色谱方法，能够快速、准确地分离目标化合物。
该方法的开发成功为该公司节约了大量的时间和资源。
与传统的柱层析方法相比，液相色谱方法可以更快速地完成分离过程，并且具有更高的分辨率和灵敏度。
这使得制药公司能够更快地推进新药物的研发进程，并且更准确地监测药物的质量。
在这个案例中，液相色谱方法的成功应用证明了它在药物研发领域的重要性。
不仅如此，液相色谱方法的开发也为其他领域提供了宝贵的经验和启示。
通过不断地优化和改进，液相色谱方法可以为各种行业提供高效、准确的分析手段，促进科学研究和工业发展的进步。
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Luna™ C8(2) & C5
• 减少疏水性化合物的保留时间 •减少分析的时间
Synergi™ Max-RP
• 疏水性和 C18柱类似 – 为一支C12柱 •提供比C18柱更尖的柱峰,尤其是分析碱性化合 物
Synergi™ Max-RP
Basic Drugs at Neutral pH
C18 phases
10.000
疏水性的比较
8.000
C8 phase
6.000
300Å C18 phase
4.000
k butylbenzene
2.000
0.000
Synergi Hydro-RP
Luna C18(2)
Synergi Luna C8(2) Luna C5 Luna Phe- Jupiter C18 Synergi
80
60
40
20
0
1
2
3
极性选择性
1+2
4
5
1+2
4
5
1 2
HO
min
O CH3 H HH
Estrone
min
HO
OH CH3 H HH
Estradiol
4
5
min
Synergi™
Synergi Max-RP - C12 Synergi Hydro-RP - C18 Synergi Fusion-RP – C18 Synergi Polar-RP – Phenyl
建立高效液相色谱分析方法的 一般步骤
• 通常在确定被分析的样品以后，要建立一种高 效液相色谱分析方法必须解决以下问题：
• ①根据被分析样品的特性选择适用于样品分 析的一种高效液相色谱分析方法。
• ②选择一根适用的色谱柱，确定柱的规格 （柱内径及柱长）和选用固定相（粒径及孔 径）。
• ③选择适当的或优化的分离操作条件，确定 流动相的组成、流速及洗脱方式。
Luna™ 5m C18(2) YMC-Pack™ 5m Pro C18 Synergi™ 4m Polar-RP® (Ether-linked Phenyl)
150x4.6mm
Mobile phase: 75:25 Methanol:water
Flow rate: 1 mL/min
Components: 1. Estrone 2. Estradiol
高效液相色谱分析技术— 方法开发
上海市食品药品检验所 陈桂良
方法开发
方法开发过程是指为分析样品选择合适的方法条 件。这建立在预先了解样品的性质、功能团的 p见K光a或谱p性Kb质值、、氧溶化质还分原子行的为极、性浓和度大范小围、、紫溶外解可度 以及其它方面的基础之上。根据这些知识，就可 以选择合适的色谱模式、相应色谱柱、流动相组 分、流速、检测器选择、梯度或等度洗脱条件和 其它条件。经初步试验，一旦方法建立，就可以 进行优化工作。优化是非常必要的，可以使所用 组分在尽可能短的时间内，或者在低检测限下实 现最佳分离，优化后的条件可以达到检测要求或 定量要求。
Max-RP
Hex
Polar-RP
Prodigy Phenyl
Jupiter C4
Luna Cyano
Luna Amino
极性选择性的考虑
首先考虑
• 固定相的极性封尾,封端基团
• 分析物的极性官能基之间的作用
极性选择性
如何增加极性的选择性
• 极性基团封端 • 极性基团镶嵌 • 苯基
极性选择性
Columns:
• ④由获得的色谱图进行定性分析和定量分析。
分析物
• 理化性质 • 混合分析物的主要差异 • 分子结构和特性
● 方法开发前要确定的基本问题
1、分析物的物理、化学性质
样品基质----决定前处理方法 溶解性----决定正、反相方法 酸碱性----确定色谱柱类型、流动相组成 pKa----确定流动相的pH值 化学结构、特征官能团、Etc.
App ID 1125
Luna™ C18(2)
Ginseng Root
Column: Luna 5 µm C18 / ODS (2) Dimensions:150 x 4.6 mm ID Elution Type:Gradient Eluent A: Acetonitrile/water (15:85) Eluent B: Acetonitrile/water (80:20) Flow Rate:1.5 mL/min Temperature:25 °C Detection: UV-Vis Abs. – Variable Wave. @ 205 nm
HO
OH CH3 H
HH HO
Estradiol
O CH3 H HH
Estrone
mAU
175 Luna™ C18(2)
150
Байду номын сангаас
125
100
75
50
25
0
1
2
3
mAU
200 YMC-Pack™ Pro C18
175
150
125
100
75
50
25
0 mAU
1
2
3
100 Synergi™ Polar-RP®
•永远不会坏
•理想分离度
决定峰分离度的三个要素
• 峰保留时间 • 选择性(出峰的顺序) • 柱效
固定相的选择
• 疏水性的选择 • 极性的选择 • 苯基的选择
固定相疏水性考虑的要素
• 键合相的种类 (C18, C8, Phenyl, etc) • 表面积 • 键合相的键合率
色谱柱选择表
• 颗粒直径及形状(球型及不规则型) • 柱长及柱内径 • 表面积及孔径 • 碳负荷及键合类型
Silica Advantage
Balancing Efficiency & Backpressure
5µ 4µ 3µ
higher efficiencies
如何得到最理想的分析结果
流动相,被分析物,和固定相三者之间的作用影响峰 保留时间和峰分离性.峰保留时间短一般峰型较好, 但分离可能不理想.所以为了调节最理想的分析结果 ,可以改变下列的一项或数项条件:
流动相 固定相 pH 温度
如何选择适当的色谱柱 理想的柱子
•可以适用于分析所有的化合物
● 方法开发前要确定的基本问题
2、混合分析物的主要差异
疏水性差异----用疏水性选择性强的色谱柱 极性差异----用具有极性选择性的色谱柱 芳香性差异----用芳香选择性色谱柱 混合差异----用多种选择型色谱柱 分子量差异----GPC、GFC
● 方法开发前要确定的基本问题
3、分子结构决定选用何种分析方法 HPLC-UV HPLC-IR HPLC-MS HPLC-ELSD Etc.