高效液相色谱分析技术—方法开发(陈桂良)
高效液相色谱法测定荔枝中有机酸的含量
１ 实验 部 分
１１仪器和试 剂 ．
Ｌ １ －Ｔ 高效 液相色谱 仪（ 元泵 、二极管 阵列检测器 Ｃ ０Ａ 二 Ｓ Ｄ— ０ （ Ｐ Ｍ２ Ａ）日本 岛津制作所） ；电子分析天平（ 日本 岛津 制作 所 Ａ ２ ） ｔｒ Ｈ计（ Ｙ１０ ；Ｓａ ｐ 奥立龙 ４ｓ ｒ；超声波脱气机（ ｔ ） ａ 天津 市恒奥科技 发展有 限公司 ＤＦ －０ ） 多功能食物搅拌机（ 山 Ｔ １０ ； 佛 市顺德 区任 发电器实业有限公 司 Ｂ ３ ３Ａ 。 Ｂ ３ 一 ） 标 准储 备 液 ： 取 酒 石 酸 （—ａ ａｉ ａｉ 美 国 ９ 称 ＬＴ ｒ ｒ ｃ ｔ ｃ ｄ ９％） 、柠 檬 酸 （ ｉｉ ｃｄ 美 国 ９ ． ％） ０ ００ ， 称 取 苹 果 酸 Ｃｔｃ ｉ ｒ ａ ９９ 各 ． ０ ｇ ５ （ — ｌ ｃｄ美 国 ９ ．％）丁二 酸 （ｕｃｎｃ ｃ 德 国 ９ ．％） Ｄ Ｍａ ｃ ｉ ｉａ ９３ 用去离子水溶解 ， ２ ｇ 定容至 ５ ０ ｍＬ， 此溶液酒石酸 、 苹果酸、 柠檬酸、 丁二酸的浓度分别为 １． ｍｇｍＬ ５ ／ 、 ０ ／ 、． ｍｇｍＬ ０ ０
荔枝的品质主要取决于其含糖量和有机酸含量 ， 本方法探 讨 了 用 高效 液 相 色 谱 法 测 定 荔枝 中有 机 酸 ， 性 、重 复性 和 回 线 收率，结果满意 。
称取去皮去核 的荔枝匀浆样约 １ （ ． ｇ精确至少数点后 四 ０ 位） ，加去离子水溶解 ，超声提取 １ ｎ ０ｍｉ，定容至 ５ ，混 ０ｍＬ 匀 ，放置 ３ ｎ ０ｍｉ，取 上清液经 ０４ ｍ 滤膜过滤 。 ．５ｐ
１ ０８
Ⅵ Ｖ ｇ ｃ ｅ ｃ ｍ ｗ．ｄ ｈ ｍ．ｏ
２ｌ ０ ０年 第 ７ 期 第３ ７卷 总第 ２ ７期 ０
高效液相色谱法测定荔枝 中有机 酸的含量
高效液相色谱法测定阿司匹林肠溶片中阿司匹林的含量-药学论文-基础医学论文-医学论文
高效液相色谱法测定阿司匹林肠溶片中阿司匹林的含量-药学论文-基础医学论文-医学论文——文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印——阿司匹林肠溶片为非甾体类抗炎药，临床可用于抗血栓，也可用于治疗不稳定性心绞痛，是《国家基本药物目录》列入的品种。
本文采用高效液相色谱法测定阿司匹林肠溶片中阿司匹林的含量，该方法简单，快速，重现性好，回收率高，可用于该制剂的质量控制。
1 仪器与试药1.1 仪器：大连依利特P230 型高效液相色谱仪；UV230+紫外可见检测器；手动进样器；超声仪（型号KQ5200E，功率200W，频率40KHz）；电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司，0.0001g）。
1.2 试药：阿司匹林对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100113）；阿司匹林肠溶片（亚宝药业太原制药有限公司，批号：131210；石家庄康力药业有限公司，批号：121037；神威药业集团有限公司，批号：1306072），甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果2.1 色谱条件：色谱柱为Hypersil ODS2 柱（250mm4.6mm，5m）；流动相：甲醇∶0.5%乙酸溶液（37∶63）；流速：0.8mlmin-1；柱温：25∶；检测波长：267nm；理论板数按阿司匹林计不得少于3000。
2.2 溶液的制备：对照品溶液的制备：精密称取一定量阿司匹林对照品，置100ml 量瓶中，加1%醋酸甲醇溶解并定容制成100gml-1的对照品溶液。
供试品溶液的制备：取供试品（石家庄康力药业有限公司，批号：121037）约0.03g，精密称定，置100ml 量瓶中，用1%冰醋酸甲醇溶液溶解并定容，过滤，取续滤液，作为供试品溶液。
阴性样品溶液的制备：按处方比例取辅料制成空白制剂，按供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液。
2.3 专属性实验：在2.1色谱条件下，分别吸取供试品溶液、对照品溶液、阴性样品溶液各10L，注入液相色谱仪，记录色谱图。
高效液相色谱分析技术-原理(陈桂良)
流动相
不同极性 不同极性 有机溶剂 有机溶剂 和水 吸附与解 吸 溶解与挥 发
不同pH值 有机溶剂 的缓冲溶 或一定pH 液 值的缓冲 溶液 可逆性的 离子交换 多孔凝胶 的渗透或 过滤
分离原理
色谱柱和色谱模式
• • • • • 3.1正相色谱（normal phase chromatography） 3.2 反相色谱（reverse phase chromatography） 3.3离子对色谱（ion-pair chromatography） 3.4 离子交换和离子色谱（ion-exchange and ion chromatography） 3.5 疏 水 作 用 色 谱 （ hydrophobic interaction chromatography） 3.6 亲和色谱（affinity chromatography） 3.7 排阻色谱（Size Exclusion Chromatography， SEC） 3.8凝胶渗透色谱（GPC）
其他
• 理论板数、相邻峰的分离度、多次进样 的相对标准偏差百分数以及拖尾因子 （色谱峰形偏离对称高斯峰的程度）作 为系统适用性参数。
系统适应性试验
• N=5.54*(tR/W1/2)2 =5.54*(1.065*60*tR/A/H)2 • R=2(t2-t1)/(W1+W2) (>1.5) • T=T/2d (Ch.P 0.95~1.05; USP <2.5) • RSD<2.0% • K=(t-tm)/tm
薄层色谱法（TLC） 平板色谱法 纸色谱法
高效毛细管电泳法（HPCE）
色谱学发展历史
1906年，Tweet发现色谱分离现象。 1941年，Martin和Synge发明了利用物质 在两种不相混溶的溶剂中因分配系数的不 同而达到分离的“分配色谱法”，1952年 获Nobel奖。同时提出以气体为流动相。
药物检验中超高效液相色谱法的应用策略
药物检验中超高效液相色谱法的应用策略发布时间：2021-09-01T09:41:22.473Z 来源：《健康世界》2021年11期作者：张春侠高继军[导读] 超高效液相色谱分析法是一种高速有效的分析分离技术张春侠高继军普洛药业股份有限公司浙江省东阳市 322118摘要：超高效液相色谱分析法是一种高速有效的分析分离技术，常用于对药物及食品的检测和检验。
超高效液相色谱法为研究高通量和分离复杂混合物的工作提供了更为有效的方法，在检测微量药物及药剂样品方面更为突出，在药品质量检验、药品成分识别、药物分子的代谢组合等方面应用较为广泛。
鉴于此，文章重点就药物检验中超高效液相色谱法的应用策略进行研究分析，以供参考和借鉴。
关键字：药物检验；超高效液相色谱技术；应用策略引言随着社会的发展与生活水平的提高，人们对食品以及药物质量的要求也不断提高，各种分离分析技术也层出不穷。
超高效液相色谱法具有样品组分容易吸收、样品处理方法简单、检测自动化、适用范围广、药物成分分离效率高、检测灵敏度高以及分离速度快等诸多优点，为监测药品及食品的质量安全提供了更为有效的平台。
1超高效液相色谱技术原理分析所谓超高效液相色谱技术，实质上是融合了超高压系及小颗粒填料色谱柱的新型检测技术。
在使用该项技术时，主要影响色谱柱性能的因素是固定相颗粒度，随着颗粒度参数的不断缩小，色谱柱性能逐渐趋于良好。
因此，在实际运用该项技术进行药物检验中，可以通过降低固定相颗粒度的方式，达到提升检测和分析灵敏度的实质性目的。
与此同时，也可以有效的减少药品分析的时间。
然而当前对于药物检验和分析质量要求不断提升，这对于超高效液相色谱的分离速度和效率提出了更高的要求，需要加强技术的创新和升级，具体如下：第一，对自动进样体积进行改进。
在整个超高效液相色谱技术体系当中，进样环节十分关键，会影响到检验结果的准确性。
通常尽可能的对进样死体积进行缩小，一方面可以缓解极端高压力波所产生的干扰，另一方面还可以加快进样的速度，达到提升检验和分析效率目的；第二，提高输液泵效率。
高效液相色谱分析技术—方法开发陈桂良共70页文档
71、既然我已经踏上这条道路，那么任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。——康德 72、家庭成为快乐的种子在外也不致成为障碍物但在旅行之际却是夜间的伴侣。——西塞罗 73、坚持意志伟大的事业需要始终不渝的精神。——伏尔泰 74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。——屈原 75、内外相应，言行相称。——韩非
高效液相色谱分析技术—方法开发陈桂良
31、园日涉以成趣，门虽设而常关。 32、鼓腹无所思。朝起暮归眠。 33、倾壶绝余沥，窥灶不见烟。
34、春秋满四泽，夏云多奇峰，秋月 扬明辉 ，冬岭 秀孤松 。 35、丈夫志四海，我愿不知老。
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反相高效液相色谱法测定果汁中11种有机酸条件的优化
l646
分析化学
第 32 卷
将流动相分别配成 0 、 0. 03 、 0. 06 、 0. 09 、 0. l2 、 0. l5 、 0. l8 和 0. 2l mOi / L 的 K2 HPO4 溶液 （ 用 H3 PO4 调 pH 值为 2. 65 ） ， 对标准溶液中的各有机酸进行分离。结果表明： 当流动相中不含有磷酸盐时， 各有机 酸分离效果不好； 逐步增加流动相中磷酸盐的浓度， 有机酸均能得到分离， 且不影响分离效果。由于高 浓度的盐会对泵和柱子的寿命产生影响， 所以本实验选用 0. 0l mOi / L 的 K2 HPO4 作为流动相。 3. 3 流动相 pH 值的选择 的 0. 0l mOi / L 的 K2 HPO4 溶液作流动相， 测定各有机酸的保留时间， 以不同 pH 值 （ 用 H3 PO4 调节） 结果显示流动相 pH 值对有机酸的分离影响很大 （ 见图 l ） 。当 pH 值为 2. 0 时， 琥珀酸和富马酸完全不 能分开； 逐步提高 pH 值， ll 种有机酸逐渐得到分离， 但柠 檬酸和富马酸、 酒石酸和奎宁酸的分离度却逐渐减小； 当 pH 值为 3. 0 时， 柠檬酸和富马酸、 酒石酸和奎宁酸不能有 效分离； 当 pH 值为 3. 2 时， 部分有机酸的出峰顺序发生变 化。由于 pH 值小于 2. 5 的溶液会影响色谱柱的寿命， 经 综合考虑， 最后选择 pH 值为 2. 6 磷酸盐缓冲溶液。 3. 4 流动相中甲醇含量的选择 在流动 相 中 加 入 少 量 甲 醇， 能 有 效 的 改 善 峰 形。以 溶液作流动相， 对不同的 0. 0l mOi / L 的 K2 HPO（ 4 pH 2. 6 ） 甲醇含量 （0、 l% 、 2% 、 3% 、 4% 、 5% ） 对色谱分离的影响进 行了比较， 结果表明， 随着流动相中甲醇含量的增加， 有机 酸的疏水端基与固定相的相互作用减弱， 保留时间下降， 3% 的甲醇-缓冲溶液 （ ! " !） 分离度和峰形较好。 3. 5 其它条件选择 溶液作流动相比较了 以 3% CH3 OH-K2 HPO（ 4 pH 2. 6 ） 柱温、 流 速 对 保 留 时 间 的 影 响。 结 果 发 现： 流 速 l. 0
高效液相色谱法测定大败毒胶囊中橙皮苷的含量
高效液相色谱法测定大败毒胶囊中橙皮苷的含量摘要】目的建立大败毒胶囊中橙皮苷含量的高效液相色谱法。
方法采用Agela Venusil MP C18色谱柱（250mm×4.6mm,5μm），以甲醇-醋酸溶液（每1000mL水中含冰醋酸25mL）（35:65）为流动相，流速为 1.0mL/min，检测波长为284nm，柱温30℃。
结果橙皮苷进样量在0.0352～1.1264μg（r=0.9999）范围内与峰面积积分值具有良好线性关系，平均加样回收率为98.18%,RSD为0.99%（n=9）。
结论该法简便、灵敏、准确可靠，可用于该药的含量测定。
【关键词】高效液相色谱法大败毒胶囊橙皮苷含量【中图分类号】R927.2 【文献标识码】B 【文章编号】2095-1752（2013）32-0343-02大败毒胶囊为《卫生部药品标准中药成方制剂》第十二册收载的品 [1]，由大黄、蒲公英、赤芍、陈皮、黄柏等17味中药组成，具有清血败毒、消肿止痛等功效。
用于治疗脏腑毒热、血液不清引起的梅毒、血淋、白浊、尿道刺痛、大便秘结、疥疮等症。
原标准中无含量测定方法，方中陈皮为主要药味之,其有效成分为橙皮苷，为能有效地控制该药品质量，本试验采用HPLC法测定橙皮苷的含量，效果较好。
1 仪器与试药DIONEX UltiMate 3000 pump，DIONEX UltiMate 3000 Diode Array Detector液相色谱仪；橙皮苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号为110721-200613，供含量测定用，含量100%）；大败毒胶囊（批号121003、130301、130603，内蒙古通辽制药股份有限公司生产）；水为纯化水；甲醇为色谱纯；其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果2.1 色谱条件色谱柱：Agela Venusil MP C18柱（250mm×4.6mm,5μm）；流动相：甲醇-醋酸溶液（每1000mL水中含冰醋酸25mL）（35:65）；检测波长：284nm；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量10μL。
高效液相色谱分析技术—方法认证和注意事项(陈桂良)
定量限
• 定量限系指样品中被测物能被定量 测定的最低量，其测定结果应具一 定准确度和精密度。杂质和降解产 物用定量测定方法研究时，应确定 定量限。常用信噪比法确定定量限。 一般以信噪比为10∶1时相应的浓度 或注入仪器的量进行确定。
线性
• 指在设计的范围内，测试结果与试样 中被测物浓度直接呈正比关系的程度。 应在规定的范围内测定线性关系。可 用一贮备液经精密稀释，或分别精密 称样，制备一系列供试样品的方法进 行测定，至少制备5份供试样品。函 数作图，或用最小二乘法进行线性回 归。响应信号也可经数学转换，再进 行线性回归计算。
• 在相同条件下，由一个分析人员测 定所得结果的精密度称为重复性； 在同一个实验室，不同时间由不同 分析人员用不同设备测定结果的精 密度，称为中间精密度；在不同实 验室由不同分析人员测定结果的精 密度，称为重现性。 • 含量测定和杂质定量测定应考虑方 法的精密度。
重复性
• 在规定范围内，至少用9次测定结果 进行评价，如制备3个不同浓度的样 品，各测定3次，或把被测物浓度当 作100%，用至少测定6次的结果进行 评价。
需验证的分析项目
• 鉴别试验，杂质定量或限度检查， 原料药或制剂中有效成分含量测定， 以及制剂中其他成分(如降解产物、 防腐剂等)的测定。药品溶出度、释 放度等功能检查中，其溶出量等测 试方法也应作必要验证。
典型的验证参数(Characteristics)
• • • • • 准确性(Accuracy) 精密度(Precision) 重复性(Repeatablity) 中间精密度(Intermediate Precision) 专属性(Specificity)
专属性
• 专属性系指在其他成分(如杂质、降 解产物、辅料等)可能存在下，采用 的方法能准确测定出被测物的特性。 鉴别反应、杂质检查、含量测定方 法，均应考察其专属性。如方法不 够专属，应采用多个方法予以补充。
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疏水性的比较
8.000
C8 phase
6.000
300Å C18 phase
4.000
k butylbenzene
2.000
0.000
Synergi Hydro-RP
Luna C18(2)
Synergi Luna C8(2) Luna C5 Luna Phe- Jupiter C18 Synergi
Columns:
Mobile phase: Flow rate: Components:
苯基的影响
Luna™ 5m C18(2) 150x4.6mm Luna™5m Phenyl-Hexyl 150x4.6mm Synergi™ 4m Polar-RP150x4.6mm
50:50 Acetonitrile:20mM Potassium phosphate pH 2.5
Luna™ C8(2) & C5
• 减少疏水性化合物的保留时间 •减少分析的时间
Synergi™ Max-RP
• 疏水性和 C18柱类似 – 为一支C12柱 •提供比C18柱更尖的柱峰,尤其是分析碱性化合 物
Synergi™ Max-RP
Basic Drugs at Neutral pH
C18 phases
• ④由获得的色谱图进行定性分析和定量分析。
分析物
• 理化性质 • 混合分析物的主要差异 • 分子结构和特性
● 方法开发前要确定的基本问题
1、分析物的物理、化学性质
样品基质----决定前处理方法 溶解性----决定正、反相方法 酸碱性----确定色谱柱类型、流动相组成 pKa----确定流动相的pH值 化学结构、特征官能团、Etc.
Synergi™
Flow Rate (mL/min)
Synergi™ Max-RP
与C18柱性能类似的C12柱
Synergi™ Polar-RP®
• 保留极性和苯基化合物 • 100% 水溶液稳定 • 增加极性的选择性
Synergi™ Hydro-RP
• 疏水性非常强 • 极性封端100%水溶性稳定 • 增进极性的选择性
•永远不会坏
•理想分离度
决定峰分离度的三个要素
• 峰保留时间 • 选择性(出峰的顺序) • 柱效
固定相的选择
• 疏水性的选择 • 极性的选择 • 苯基的选择
固定相疏水性考虑的要素
• 键合相的种类 (C18, C8, Phenyl, etc) • 表面积 • 键合相的键合率
色谱柱选择表
• 颗粒直径及形状(球型及不规则型) • 柱长及柱内径 • 表面积及孔径 • 碳负荷及键合类型
Synergi Hydro-RP VS. Luna® C18(2)
Synergi™ Hydro-RP
Synergi Hydro-RP
Synergi Max-RP
Mobile Phase:
Gradient: Flow rate: Sample:
A: 20mM KH2PO4, pH 4.6 B: Acetonitrile A/B (95:5) to A/B (65:35) in 15 min 1.5 mL/min 1. Morphine 2. Hydromorphone 3. Codeine 4. Nalorphine 5. Oxycodone
Synergi™ Hydro-RP
Synergi™ Fusion-RP
• 增加极性的选择性同时减少疏水性的分析时间 • 在水溶液中100%稳定
mAU 500
VWD1 A, Wavelength=210 nm (S:\HPCHEM\1\DATA\SW1003\TEST0034.D)
400
300 极性增大
80
60
40
20
0
1
2
3
极性选择性
1+2
4
5
1+2
4
5
1 2
HO
min
O CH3 H HH
Estrone
min
HO
OH CH3 H HH
Estradiol
4
5
min
Synergi™
Synergi Max-RP - C12 Synergi Hydro-RP - C18 Synergi Fusion-RP – C18 Synergi Polar-RP – Phenyl
App ID 1125
Luna™ C18(2)
Ginseng Root
Column: Luna 5 µm C18 / ODS (2) Dimensions:150 x 4.6 mm ID Elution Type:Gradient Eluent A: Acetonitrile/water (15:85) Eluent B: Acetonitrile/water (80:20) Flow Rate:1.5 mL/min Temperature:25 °C Detection: UV-Vis Abs. – Variable Wave. @ 205 nm
● 方法开发前要确定的基本问题
2、混合分析物的主要差异
疏水性差异----用疏水性选择性强的色谱柱 极性差异----用具有极性选择性的色谱柱 芳香性差异----用芳香选择性色谱柱 混合差异----用多种选择型色谱柱 分子量差异----GPC、GFC
● 方法开发前要确定的基本问题
3、分子结构决定选用何种分析方法 HPLC-UV HPLC-IR HPLC-MS HPLC-ELSD Etc.
8
VW D1 A, W av elength=230 nm (F: \PHEN1575\HPCHEM\2\DATA\SW 0503\ CARLO087.D)
m AU
80
60
40
20
0
0
2
4
6
8
VW D1 A, W av elength=230 nm (F: \PHEN1575\HPCHEM\2\DATA\SW 0503\ CARLO088.D)
1.0 mL/min
Acidic, aromatic compounds 1. Indoprofen 2. Ethyl paraben 3. Naproxen 4. Diflunisal 5. Indomethacin 6. Ibuprofen
苯基的影响
mAU
140 120 100
80 60 40 20
200
100
0 0
mAU
2
4
6
VWD1 A, Wavelength=210 nm (S:\HPCHEM\1\DATA\SW1003\FUSI0046.D)
350
300
250
200
150
100
50
0
0
2
4
6
Running Conditions
Synergi Fusion-RP 4 80Å
疏水性减少
8
Luna™ 5m C18(2) YMC-Pack™ 5m Pro C18 Synergi™ 4m Polar-RP® (Ether-linked Phenyl)
150x4.6mm
Mobile phase: 75:25 Methanol:water
Flow rate: 1 mL/min
Components: 1. Estrone 2. Estradiol
10
12
一般的 C18柱
14
min
8
10
12
14
min
Mobile phase: 75:25 20mM Potassium phosphate pH 2.5: Acetonitrile Flow rate: 1.5 ml/min Temperature: Ambient Detection: 210nm Injection: 1. Maleic acid
App ID 14436
Luna™ Phenyl-Hexyl
Green Tea(绿茶)
Column: Luna™ 5u Phenyl-Hexyl Dimensions: 250x 4.6mm Mobile Phase A:0.2% Acetic acid in Water/Acetonitrile (91:9) B:Water/Acetonitrile (20:80) Gradient: 100%A to t=25min, (68:32) t=25min t t=35min, hold 100%B for 10 min. Flow Rate: 1ml/min Temperature: 350C
如何得到最理想的分析结果
流动相,被分析物,和固定相三者之间的作用影响峰 保留时间和峰分离性.峰保留时间短一般峰型较好, 但分离可能不理想.所以为了调节最理想的分析结果 ,可以改变下列的一项或数项条件:
流动相 固定相 温度
如何选择适当的色谱柱 理想的柱子
•可以适用于分析所有的化合物
Silica Advantage
Balancing Efficiency & Backpressure
5µ 4µ 3µ
higher efficiencies
lower backpressures
Plate Height (H) Pressure Drop (Bar)
Linear Velocity (mm/sec)
HO
OH CH3 H
HH HO
Estradiol
O CH3 H HH
Estrone
mAU
175 Luna™ C18(2)
150
125
100
75
50
25