奈立膦酸钠原料药有关物质方法学研究
阿仑膦酸钠有关物质分析方法
阿仑膦酸钠有关物质分析方法有关物质照高效液相色谱法（中国药典2020年版四部通则0512）测定。
氯甲酸-9-芴甲酯溶液称取氯甲酸-9-芴甲酯200mg，置50ml量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，制成每1ml中约含4mg的溶液，该溶液应临用新制。
（注：测试溶液在加入氯甲酸-9-芴甲酯溶液后，应避免阳光直射，进样小瓶应使用棕色瓶）。
柠檬酸钠溶液称取二水柠檬酸钠29.4g，置1L量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，混匀。
硼酸钠溶液称取硼酸钠19.1g，置1L量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，混匀。
空白溶液精密量取5.0ml柠檬酸钠溶液，置于预先加有5.0ml硼酸钠溶液的具螺口塞子的50ml聚丙烯离心管中，精密加入乙腈5.0ml，氯甲酸-9-芴甲酯溶液5.0ml，振摇45秒后，在室温下静置30分钟，再加入二氯甲烷20ml，剧烈振摇60秒，离心5-10分钟，取上层清液，即得。
4-氨基丁酸溶液称取4-氨基丁酸约15mg，置于100ml量瓶中，加柠檬酸钠溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，取该溶液10ml置于50ml量瓶中，加柠檬酸钠溶液稀释至刻度，摇匀。
精密量取5.0ml，置于预先加有5.0ml硼酸钠溶液的具螺口塞子的50ml聚丙烯离心管中，精密加入乙腈5.0ml，氯甲酸-9-芴甲酯溶液5.0ml，振摇45秒后，在室温下静置30分钟，再加入二氯甲烷20ml，剧烈振摇60秒，离心5-10分钟，取上层清液，即得。
供试品溶液取本品60mg，精密称定，置于50ml量瓶中，用柠檬酸钠溶液溶解并稀释至刻度，摇匀。
精密量取5.0ml，置于预先加有5.0ml硼酸钠溶液的具螺口塞子的50ml聚丙烯离心管中，精密加入乙腈5.0ml，氯甲酸-9-芴甲酯溶液5.0ml，振摇45秒后，在室温下静置30分钟，再加入二氯甲烷20ml，剧烈振摇60秒，离心5-10分钟，取上层清液，即得。
对照溶液精密量取供试品溶液1ml，置于100ml量瓶中，用柠檬酸钠溶液稀释至刻度，摇匀。
利塞膦酸钠的合成研究
利塞膦酸钠的合成研究张秀立;张宇佳;王璐璐;方夏琴;陈少华;相莉;刘盟盟;郑稳生【摘要】目的合成新型抗骨质疏松药利塞膦酸钠.方法以烟酸为原料,经酯化、缩合、Willgerodt反应和水解等步骤得到关键中间体3-吡啶乙酸盐酸盐,3-吡啶乙酸盐酸盐与亚磷酸反应后得到利塞膦酸钠.结果在合成过程中,通过探讨Willgerodt 反应的时间和反应条件以及产率,优化合成路线,提高总反应收率.结论此合成路线使利塞膦酸钠的合成方法能较好地适用于工业化生产.【期刊名称】《药学实践杂志》【年(卷),期】2013(031)006【总页数】3页(P448-450)【关键词】利塞膦酸钠;抗骨质疏松药;化学合成【作者】张秀立;张宇佳;王璐璐;方夏琴;陈少华;相莉;刘盟盟;郑稳生【作者单位】中国医学科学院药物研究所,药物传输技术及新型制剂北京市重点实验室,北京100050;中国医学科学院药物研究所,药物传输技术及新型制剂北京市重点实验室,北京100050;中国医学科学院药物研究所,药物传输技术及新型制剂北京市重点实验室,北京100050;中国医学科学院药物研究所,药物传输技术及新型制剂北京市重点实验室,北京100050;中国医学科学院药物研究所,药物传输技术及新型制剂北京市重点实验室,北京100050;中国医学科学院药物研究所,药物传输技术及新型制剂北京市重点实验室,北京100050;中国医学科学院药物研究所,药物传输技术及新型制剂北京市重点实验室,北京100050;中国医学科学院药物研究所,药物传输技术及新型制剂北京市重点实验室,北京100050【正文语种】中文【中图分类】R914.5随着社会老龄化程度的加剧，骨质疏松症患者数量在逐年增多。
目前，骨质疏松症已跃居世界常见多发病第7位，我国目前有8 400万人患有不同程度的骨质疏松症，尤其是绝经期后的妇女发病率更高。
利塞膦酸钠(risedronate sodium)，化学名为2-(3-吡啶基)-1-羟基乙烷-1，1-双膦酸酸单钠盐，是一种吡啶二膦酸盐类骨吸收抑制剂，主要通过降低血清中的钙浓度来保护骨的吸收从而抑制骨的转化，最终增强骨的骨质坚固能力。
一种测定伊班膦酸钠注射液有关物质的分析方法
成骨不全治疗研究进展
１ ． ２ 生 长激 素
质发育不全 、 听力下降及皮肤异常 。９ ０ ％的 ０ Ｉ 是编
码 Ｉ 型 胶原 的基 因 Ｃ Ｏ Ｌ １ Ａ １或 Ｃ Ｏ Ｌ Ｉ Ａ ２发 生 突变 而
引起的常染色体显性遗传疾病 ， 其余成骨不全则主
要 是 由 于 调 节 Ｉ型 胶 原 基 因 转 录 或 翻 译 的 基 因
膦 酸治疗 ， 结 果发 现 ２组 患者 腰 椎 Ｂ ＭＤ显 著升 高 ，
病 。是一组 以骨骼脆性增加及胶原代谢紊乱为特征 的全身性结缔组 织疾病。其病变不仅限于骨骼 ， 还
常常 累及 其他结 缔组 织如 眼 、 耳、 皮肤 、 牙齿等， 其特 点是 骨脆 性增 加 、 骨 关节 进 行 性 畸 形 、 蓝巩膜、 牙本
【 Ｄ Ｏ Ｉ 】ｄ ｏ ｉ ： １ ０ ． ３ ９ ６ ９ ／ ｊ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ６ ７ ２ － ２ ９ ５ ７ ． ２ ０ １ ３ ． ０ ３ ． ０ １ ３
成 骨不 全 （ ｏ ｓ ｔ ｅ ｏ ｇ ｅ ｎ ｅ ｓ ｉ ｓ ｉ ｍ ｐ ｅ ｒ ｆ ｅ ｅ ｔ ａ ， Ｏ Ｉ ） 又 称脆 骨
特点。
生长激素能刺激成骨细胞 ， 增加 Ｉ 型胶原 的合
成 以及 促进 长 骨 的 生 长 ， 因而 被 证 实 对 Ｏ Ｉ患 者 有 效 。Ｍ ａ ｒ ｉ ｎ ｉ 等 对 Ⅲ／ Ⅳ型 ０ Ｉ 患 者给 予生 长 激 素治 疗， 结 果发 现 Ⅳ型 Ｏ Ｉ 患者 生 长 率 显 著增 加 ， 且 生 长 率 与治疗 年 限呈线 形 增 长 ； 患 者 骨组 织 形 态 和脊 椎 双 能 ｘ线 骨 密 度 仪 检 查 也 显 著 改 善 。与 双膦 酸盐
【CN109799298A】一种吡仑帕奈原料药中有关物质的检测方法【专利】
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910127042.4(22)申请日 2019.02.20(71)申请人 南京海纳医药科技股份有限公司地址 210009 江苏省南京市鼓楼区新模范马路5号15层申请人 南京海纳制药有限公司(72)发明人 朱峰妍 杨雨菲 辛妮 王华娟 (74)专利代理机构 南京思拓知识产权代理事务所(普通合伙) 32288代理人 吕鹏涛(51)Int.Cl.G01N 30/02(2006.01)G01N 30/34(2006.01)G01N 30/74(2006.01)G01N 30/06(2006.01)G01N 30/04(2006.01)G01N 30/86(2006.01)(54)发明名称一种吡仑帕奈原料药中有关物质的检测方法(57)摘要本发明涉及一种吡仑帕奈原料药中有关物质的检测方法，属于药物分析技术领域。
本发明的检测方法，采用高效液相色谱和/或气相色谱法对吡仑帕奈及有关物质进行定性或定量检测。
本发明的检测方法，吡仑帕奈及有关物质线性关系良好，准确度和精密度均良好，专属性强，稳定性高。
本检测方法的重现性好，能满足吡仑帕奈原料药有关物质的检测要求，可用于吡仑帕奈原料药的质量控制。
权利要求书2页 说明书26页 附图8页CN 109799298 A 2019.05.24C N 109799298A1.一种吡仑帕奈原料药中有关物质的检测方法，其特征在于，所述检测方法采用高效液相色谱和/或气相色谱法对吡仑帕奈及有关物质进行定性或定量检测，其高效液相色谱条件包括：采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述流动相A为磷酸二氢钾水溶液，所述流动相B为乙腈；其气相色谱条件包括：采用Agilent DB-624毛细管色谱柱。
2.根据权利要求1所述的吡仑帕奈原料药中有关物质的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱过程中流动相A和流动相B的初始比例为15～25:85～75或80:20；在0-25分钟内，流动相A和流动相B的体积比由初始比例匀速渐变至40:60；在25-40分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持40:60不变。
离子抑制色谱法测定伊班膦酸钠原料药中的有关物质
ＡＢＳ ＴＲＡＣＴ ＯＢＪ ＥＣＴＩ ＶＥ：Ｔ ｏ ａ ｄ ｏ ｐ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ｕ ｐ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｃ ｈ ｒ ｏ ｍａ ｔ ｏ ｇ ｒ ａ ｐ ｈ ｙ ｔ ｏ ｄ ｅ ｔ ｅ ｒ ｍｉ ｎ ｅ ｒ ｅ ｌ ａ ｔ ｅ ｄ ｓ ｕ ｂ ｓ ｔ ａ ｎ ｃ ｅ ｉ ｎ ｉ ｂ ａ ｎ ｄ ｒ ｏ ｎ ａ ｔ ｅ ｓ ｏ ｄ ｉ ｕ ｍ ｒ ａ ｗ
离 子抑制色谱 法测定伊班膦酸钠原料药 中的有关物质
李 欣 ， 陈 红 ， 张 亿（ 成 都市 食品 药品 检 验 研究 院， 成 都 ６ １ ０ ０ ４ ５ ）
中图分类 号 Ｒ９ ２ ７ 文献标 志码 Ａ 文章编号 １ ０ ０ １ — ０ ４ ０ ８ （ ２ ０ １ ７ ） ３ ０ ． ４ ２ ８ ８ ． ０ ４
识别 评 价重 庆市 售青 蒿饮 片 质量 的 一致 性 ［ Ｊ ］ ． 中国 药
１ ０ ４ ． ０ ８ ％（ Ｒ Ｓ Ｄ＝０ ． ９ ％， ｎ ＝９ ） 。结论 ： 该方法 简便 、 准确 、 灵敏 ， 适 用于测定伊 班膦 酸钠原料 药中的有 关物质 。 关键词 离子抑制 色谱 法； 伊班膦酸钠 ； 有 关物质 ； 亚磷 酸盐 ； 杂质 Ｉ； 磷酸盐
Ｄｅ ｔ ｅ ｒ ｍｉ ｎａｔ ｉ ｏ ｎ ｏｆ Ｒｅ ｌ ａ ｔ ｅ ｄ Ｓｕｂ ｓ ｔ ａ ｎｃ ｅ ｓ ｉ ｎ Ｉ ｂａ ｎｄｒ ｏｎａ ｔ ｅ Ｓ ｏｄ ｉ ｕ ｍ Ｒａ ｗ Ｍ ａｔ ｅ ｒ ｉ ａ ｌ ｓ ｂｙ Ｉ ｏｎ Ｓｕｐ ｐｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ Ｃｈ ｒ ｏ ｍａ － ｔ ｏ ｇｒ ａ ｐｈｙ
Ｒ Ｓ Ｄ＜４ ． ０ ％； 加 样 回收率 分别 为 １ ０ １ ． ４ ９ ％ ～１ ０ ３ ． ５ ７ ％（ Ｒ Ｓ Ｄ＝０ ． ７ ％， ＝ ９ ） 、 １ ０ ０ ． ０ ０ ％～１ ０ ４ ． ８ ５ ％（ Ｒ Ｓ Ｄ＝ １ ． ８ ％， ｎ ＝９ ） 、 １ ０ １ ． ３ ５ ％ ～
药物制剂中药物与辅料相互作用的研究
药物制剂中药物与辅料相互作用的研究发布时间：2021-07-07T15:50:28.193Z 来源：《医师在线》2021年3期作者：马亚新[导读]马亚新（杭州中美华东制药江东有限公司；浙江杭州310000）摘要：在药物制剂中，药物与辅料之间的相互作用对药物的溶解度，稳定性和生物利用度具有不同的影响。
因此，在药物开发中研究药物与辅料之间的相互作用是必不可少的。
因此，本文从相关研究方法入手，分析了各种制剂中药物与辅料之间的相互作用，为药物制剂研究中的处方筛选和制剂设计提供了研究思路。
关键词：药物制剂；药物；辅料；相互作用药物制剂由活性药物成分和辅料组成，合适的辅料对药物的最终质量非常重要。
当设计药物制剂时，辅料的筛选不仅应考虑剂型因素和辅料本身的功能，还应考虑药物与辅料之间的相互作用。
近年来，随着研究的不断深入，除了在通用制剂相容性研究中发现药物与赋形剂之间的新相互作用外，研究人员还关注辅料剂与辅料之间的相互作用[1]。
辅料与药物之间或药物与载体之间相互作用的优缺点增加了药物的溶解度和生物利用度，减少了药物的副作用，但同时可能产生负面影响，并导致降解或离解，从而会降低临床疗效并增加安全风险。
因此，在药物制剂开发过程中进行充分可靠的相互作用研究，不仅可以为制剂筛选和制剂设计提供依据，而且可以为药物升级提供研究思路。
一、药物制剂中的研究方法（一）热分析法热分析方法包括DSC方法，DTA方法和TG分析方法。
该方法不需要长时间的样品制备，并且可以在短时间内筛查许多辅料。
其中，DSC方法被广泛使用，因为它可以根据特征性熔解峰的移动来判断药物与赋形剂之间的相容性问题。
但是，热分析方法通常将样品暴露在与实际生产条件不符的高温条件下，另外由于大多数有机物质具有相对相似的热解性质，因此在加热过程中会发生相同或相似的热过程，导致样品的热分布峰重叠，从而难以区分它们。
最近的研究表明，FA方法可以重新处理通过DSC和TG方法获得的数据，但是很难区分和使用它来提供清晰的兼容性信息。
植物药物的生物活性成分研究
植物药物的生物活性成分研究植物药物一直以来在人类的生活中扮演着重要的角色。
众所周知，植物药物中的生物活性成分是药效产生的关键因素。
近年来，对植物药物的生物活性成分进行研究的工作越来越受到关注。
本文将探讨植物药物中的生物活性成分的研究进展，并介绍一些常见的研究方法和应用场景。
一、传统研究方法在过去的几十年里，研究人员使用传统的方法对植物药物中的生物活性成分进行研究。
这些方法包括化学分离、结构鉴定和生物活性筛选等。
其中，化学分离是最常用的方法之一。
研究人员通过提取植物药材中的化学成分，使用色谱等技术将复杂的混合物分离为单一的化合物。
随后，使用质谱、核磁共振等技术对这些化合物的结构进行鉴定。
最后，通过生物活性筛选，确定其中具有药理活性的成分。
二、现代研究方法随着科技的进步，现代研究方法在植物药物的生物活性成分研究中扮演着重要的角色。
其中，基于高通量筛选技术的方法是比较常见的一种。
这些方法可以快速地筛选出成百上千个化合物并测试它们对特定疾病或生物过程的影响。
此外，生物技术的应用也为植物药物的研究提供了新的途径。
例如，基因工程技术可以用来改良植物以提高其药用成分的含量。
三、应用场景植物药物的生物活性成分在许多领域都有广泛的应用。
首先，它们在药物研发领域中起到至关重要的作用。
许多药物的原料都来自于植物药物中的生物活性成分。
其次，植物药物的生物活性成分也被广泛应用于保健品的开发。
越来越多的人开始关注天然的健康产品，植物药物中的生物活性成分成为了一种热门的选择。
此外，植物药物的生物活性成分还在农业领域发挥着重要的作用。
例如，一些具有杀菌活性的植物药物成分可以被用于保护作物免受病害的侵害。
总结植物药物的生物活性成分的研究具有重要的意义。
传统和现代的研究方法都为此提供了有力的支持。
这些研究方法的不断改进将进一步推动植物药物的发展和应用。
在未来，我们可以期待更多的生物活性成分被发掘，并应用于医药、保健品和农业等领域，为人类的生活贡献更多的益处。
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奈立膦酸钠原料药有关物质方法学研究摘要：目的本文采用了薄层色谱法，容量法以及高效液相色谱法对奈立膦酸钠的原料药中的有关物质进行了测定。
方法采用薄层色谱法对奈立膦酸钠的起始原料6-氨基己酸以及磷酸盐杂质的含量进行测定，采用容量法对亚磷酸盐杂质进行研究，原料药中的未知杂质则通过高效液相色谱法进行测定。
结果本实验设计的薄层色谱法检测6-氨基己酸以及磷酸盐含量能够准确分离奈立膦酸钠和杂质，专属性很好，原料药样品中未检出6-氨基己酸以及磷酸盐杂质。
容量法检测原料药的亚磷酸盐含量结果显示，该方法专属性、线性、精密度和准确度均满足要求。
未知杂质通过高效液相色谱法进行检测，报告显示未有未知杂质检出。
关键词：奈立膦酸钠有关物质薄层色谱法容量法Methodology study of related substances of Sodium Niledronate active pharmaceutical ingredientAbstract：Objective The purpose of this study was to determine the related substances in the drug substance of Nasirisodium phosphate with thin layer chromatography, volume method and high performance liquid chromatography. Methods The contents of 6-aminocaproic acid and phosphate were determined bythin-layer chromatography. The impurity of phosphite was determined by volume method. The unknown impurities in the drug substance were determined by high performance liquid chromatography. Results The determination methods of 6-aminocaproic acid and the phosphate substances were proved feasible, and no 6-aminocaproic acid and phosphate impurities were detected in the active pharmaceutical ingredient samples. The results of the determination of the subphosphate content of the active pharmaceutical ingredient by the capacity method show that the method is specific, linear, precise and accurate. The unknown impurities are detected by high performance liquid chromatography and the result shows that no unknown impurities are detected.Keywords：Sodium Niledronate；related substances；thin layer chromatography; volumetry?0 前言奈立膦酸钠（Neridronate Sodium）化学名为6-氨基-1-羟基亚己基-1,1-二膦酸一钠盐，结构式见图一，是一种抑制甲羟戊酸生物合成途径的关键酶（FPP合成酶），能够干扰破骨细胞的骨吸收和成活所必要的一系列细胞功能，[1-4]具有抑制破骨细胞活性，减少骨量流失的作用[5-7]。
奈立膦酸钠是由意大利Abiogen Pharma S.P.A.开发一种含氮的双膦酸盐，剂型为注射液，规格为1）2ml：25mg，2）8ml：100mg（按奈立膦酸计），商品名为NERIXIA [8-9]，以复杂性区域疼痛综合征Ⅰ（CRPS-Ⅰ）和成骨不全症（OI）为适应症于2002年在意大利上市[10]，但是各国的药典都没有收载奈立膦酸钠的原料药和制剂的质量标准。
本实验基于对奈立膦酸钠的工艺研究，对其原料药中可能出现的杂质进行监测，包括起始原料6-氨基己酸、磷酸盐、亚磷酸盐以及未知杂质。
本文中简要阐述了6-氨基己酸的薄层色谱检测法，磷酸盐的薄层色谱检测法，亚磷酸盐的容量检测法以及检测未知杂质的HPLC法，并对各个检测方法进行方法学验证，期望能为后续的奈立膦酸钠原料药及制剂的杂质检测提供依据。
图1.奈立膦酸钠结构式Fig1. Chemical structure of Neridronate Sodium1 仪器与试药Perkin Elmer 200系列高效液相色谱仪，Perkin Elmer Totalchrom工作站，恒温干燥箱，薄层涂板（20*20cm，0.1mm，无荧光指示剂纤维素）奈立膦酸钠对照品（），奈立膦酸钠原料药（批号78821,78819），甲醇，乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯。
2 方法与结果2.1 6-氨基己酸精密称取12.5mg的6-氨基己酸，置于100mL量瓶中，然后用水稀释至刻度作为对照品母液，随后从母液中取出1ml到10ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为6-氨基己酸对照品溶液。
精密称取50mg供试品，在10mL量瓶中溶解，用水稀释至刻度，作为供试品溶液。
精密称取50mg奈立膦酸钠，取1mL的对照品母液，转移至10mL量瓶中，用水定容到刻度作为混合溶液。
2.1.1薄层色谱条件通过TLC法进行检测，采用的试验条件见下表。
表1. TLC法试验条件分别将上述的溶液于板上点样：40μL溶液对照品溶液，40μL供试品溶液，40μL混合溶液；展开之后，薄层板置于空气中晾干，喷以含0.2%茚三酮的乙醇溶液，置于100℃中干燥5分钟。
6-氨基己酸的对应斑点为紫色，其Rf值约为0.81；奈立膦酸钠的对应斑点为粉红色，其Rf值约为0.38。
在供试品溶液色谱图中的6-氨基己酸的对应斑点不得比其在对照品溶液色谱图中更深。
混合溶液色谱图显示的6-氨基己酸和奈立膦酸钠的斑点应显示清晰分离。
2.1.2方法验证2.1.2.1专属性实验分别按2.1项下供试品溶液配制方法制备不同批次的奈立膦酸钠的水溶液（批号78821,78819）作为供试品溶液，分别将40μL的溶液6-氨基己酸对照品、78821批奈立膦酸钠水溶液、78819批奈立膦酸钠水溶液和混合溶液分别点在薄层板上，保温45℃。
让溶剂展开大约15cm，干燥薄层板。
对照品溶液和混合溶液点样两次。
向薄层板喷以显色剂，并在100℃的通风烘箱中干燥5分钟。
实验结果见图2。
奈立膦酸钠对照品和样品的Rf值在0.35左右，6-氨基己酸的Rf值在0.72左右，结果显示TLC法能够突出杂质，并能准确分离奈立膦酸钠和杂质，不存在对检测的干扰。
样品中未出现可检测到的6-氨基己酸。
图2. 6-氨基己酸TLC检测方法专属性图谱Fig2. Specificity chromatograms in the TLC detected 6-aminocaproic acid2.1.2.2 检测限用从40μL到5μL逐渐减量的对照品溶液，同时加40μL供试品溶液点样，喷以显色剂，并在100℃的通风烘箱中干燥5分钟。
结果显示，TLC法显示6-氨基己酸的检测限为120ng。
2.2 磷酸盐精密称取50mg奈立膦酸钠原料药及对照品，置于10mL量瓶中，然后用水稀释至刻度，分别作为奈立膦酸钠供试品和对照品溶液。
精密移取0.23mL 85%磷酸至100mL量瓶中，用水稀释至刻度。
吸取0.5mL此溶液置于100mL量瓶中，用水稀释至刻度，作为磷酸盐对照溶液。
2.2.1 薄层色谱条件通过TLC法进行检测，采用的试验条件见下表。
表2 TLC法试验条件(2) 含1g抗坏血酸的100mL水分别取上述溶液进行点板：40μL的奈立膦酸钠溶液；40μL奈立膦酸钠对照品溶液和12μL 磷酸盐对照品溶液；12μL的磷酸盐对照品溶液。
展开之后，干燥薄层板，喷以显色剂（1），100℃加热5分钟。
冷却到室温后喷以显色剂（2）。
出现蓝色斑点，其强度随时间增长。
反应6小时后，观察薄层板发现，磷酸盐和奈立膦酸钠对照品的对应斑点应清晰分离。
在奈立膦酸钠溶液色谱图中的磷酸盐的对应斑点不得比其在磷酸盐对照品的色谱图中的更大更深。
2.2.2 方法学验证2.2.2.1 专属性分别取40μL的奈立膦酸钠溶液；40μL奈立膦酸钠对照品溶液（WS）和12μL 磷酸盐对照品溶液；12μL的磷酸盐对照品溶液点三个点。
薄层板保温45℃。
让溶液展开大约15cm，在空气中正确干燥薄层板。
喷以显色剂（1），并立即将薄层板置于100℃的通风烘箱中干燥5分钟，然后冷却，再喷以显色剂（2）。
磷酸盐检查的TLC法的专属性验证结果见图3，奈立膦酸钠对照品和样品的Rf值约为0.53，磷酸盐的Rf 约为0.75。
结果显示TLC法能够突出杂质，并能准确分离奈立膦酸钠和杂质，不存在对检测的干扰，并且样品中未出现可检测到的磷酸盐。
图3. 磷酸盐TLC检测方法专属性图谱Fig3. Specificity chromatograms in the TLC detected phosphate2.2.2.2 检测限用从12μL到1.5μL逐渐减量的磷酸盐对照溶液同时加40μL供试品溶液点样。
喷以显色剂（1），并立即在100℃的通风烘箱中干燥5分钟（避免薄层板触碰到烘箱壁），然后冷却，再喷以显色剂（2）。
由结果可知，TLC法显示磷酸盐的检测限为50ng。
2. 3 亚磷酸盐准确称取3.5g奈立膦酸钠供试品，置于250mL具塞量瓶中，加70mL水。
在搅拌的条件下加入20mL缓冲液（准确称量6.9g磷酸二氢钠，溶解在500mL水中，加入400mL 0.1N氢氧化钠配制）；加入25%氢氧化钠，检查pH（使用玻璃电极）至pH达7.3±0.2。
向得到的溶液中加入20mL 0.1N I2溶液，停止搅拌，避光静置3小时。
用6N乙酸调节pH至4.5±0.2。
用0.1N硫代硫酸钠滴定至呈微黄色。
然后加入2mL淀粉溶液，继续滴定至蓝色消失。
进行空白滴定，从而进行校正。
使用下面的公式计算亚磷酸盐的含量：其中：Vb = 表示空白滴定消耗的0.1N硫代硫酸钠溶液容积(mL)Vc = 表示样品滴定消耗的0.1N硫代硫酸钠溶液容积(mL)W = 表示样品的重量，单位用g表示。