氨基酸的测定
8第六章 氨基酸定量测定
1.原理： 强离子交换树脂－二乙烯苯树脂： 交联度大，8-12％。 树脂的结构紧密，孔隙度小，适用于分子较小的氨 基酸的分离。选用Na型的树脂。
吸附：一般在pH2.2溶解样品，由于pH比较低，氨 基酸的H＋解离被抑制，氨基酸带正电荷，可以与阳 离子交换树脂发生交换。
样品 液
分离 柱
M
Na+
pK1
COOCH2(CH2)4+NH3
+NH 3
pK2 9.0
COO CH2(CH2)4+NH3 NNH2 NH2
赖氨酸的等当电＝（ pK1＋pK2）/ 2 = 9.75
洗脱：当pH2.2，3.3，4.9等缓冲液相继流经树脂时， 随着pH逐渐升高，氨基酸失去正电荷，与树脂结合 减弱，从树脂上脱落下来。由于氨基酸的氨基不同， 因此与柱子的结合能力不同。 酸性氨基酸带的正电荷少，等电点比较低，碱性氨 基酸带的正电荷多，被置换下来的pH比较高。
吹数分钟(或置于70～80℃烘
箱中烘干)即可观察到紫红色
的氨基酸斑点，脯氨酸例外，
为黄色斑点。
用铅笔圈出氨基酸斑点，量出溶剂前沿的距离及 各斑点中心与起点之间的距离，并计算各氨基酸 的Rf值。
原点到层析点中心的距离
Rf＝ 原点到溶剂前沿的距离
标准氨基酸薄层层析色谱
氨基酸的性质与Rf之间的关系
层析的分离是基于氨基酸的非极性性质。 物质的极性越小（即非极性越大）,在有机溶剂中分 配就越多，迁移率Rf就越大；
混合样
加样
洗脱剂
分离结果
影响电离的基团：氨基、羧基、胍基、咪唑基、酚基。
洗脱顺序： 酸性氨基酸，中性氨基酸，芳香族氨基 酸，碱性氨基酸 日立832型氨基酸分析仪的洗脱顺序： 天门冬，苏，丝，谷，脯，甘，丙，半胱，缬，蛋， 异亮，亮，酪，苯丙，赖，氨，组，精
氨基酸含量测定
茚三酮比色测定氨基酸含量一、实验原理氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝紫色或黄色化合物（除脯氨酸外均有此反应），可用吸光光度法测定。
生成的蓝紫色或黄色化合物颜色深浅与氨基酸含量成正比，其最大吸收波长分别为570nm或350nm，故据此可以测定样品中氨基酸含量。
二、实验试剂（1）1.2%茚三酮溶液：称取茚三酮1g于盛有35mL热水的烧杯中使其溶解，加入40mg氯化亚锡（SnCl2▪H2O），搅拌过滤（作防腐剂）。
滤液置冷暗处过夜，加水至50mL，摇匀备用。
（2）pH 8.04磷酸缓冲液：Ⅰ、准确称取磷酸二氢钾（KH2PO4）4.5350g于烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转入500mL容量瓶中，用水稀释至标线，摇匀备用。
Ⅱ、准确称取磷酸氢二钠（Na2HPO4）11.9380g于烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转入500mL容量瓶中，用水稀释到标线，摇匀备用。
Ⅲ、取上述配好的磷酸二氢钾溶液10.0mL与190mL磷酸氢二钠溶液混合均匀即为pH8.04的磷酸缓冲溶液。
（3）氨基酸标准溶液：准确称取干燥的氨基酸（如异亮氨酸）0.2000g于烧杯中，先用少量水溶解后，定量转入100mL容量瓶中，用水稀释到标线，摇匀，准确吸取此液10.0mL于100mL容量瓶中，加水到标线，摇匀，此为200μg/mL 氨基酸标准溶液。
三、实验方法及步骤（1）标准曲线绘制准确吸取200μg/mL的氨基酸标准溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL （相当于0、100、200、300、400、500、600μg 氨基酸），分别置于25mL 容量瓶或比色管中，各加水补充至容积为 4.0mL，然后加入茚三酮溶液（20g/L）和磷酸盐缓冲溶液（pH为8.04）各1mL，混合均匀，于90℃水浴上加热至显色恒定为止（该加热过程至少需要25分钟），取出迅速冷至室温，加水至标线，摇匀。
静置15min后，若生成蓝紫色化合物，在570nm波长下，以试剂空白为参比液测定其余各溶液的吸光度A ；若生成的化合物呈黄色，则在350nm 波长下，以试剂空白为参比液测定其余各溶液的吸光度A 。
氨基酸测定方法
氨基酸测定方法一、引言氨基酸是构成蛋白质的基本单位，因此对于蛋白质的研究和分析，氨基酸的测定是非常重要的。
目前，常用的氨基酸测定方法主要有色氨酸法、二硫化物法、硫酸铜法、乙醇胺法、二甲基乙二胺法等。
本文将从样品处理、试剂配制、实验步骤和数据处理等方面详细介绍氨基酸测定方法。
二、样品处理1. 样品收集：选择适当的组织或液体样品进行采集，如血清、尿液等。
2. 样品预处理：根据不同样品特点进行预处理，如尿液中可加入少量硝酸使其变为无色透明状态。
3. 样品保存：在低温条件下保存样品以避免其蛋白质降解。
三、试剂配制1. 氢氧化钠溶液：取固体氢氧化钠加入去离子水中搅拌至完全溶解。
2. 硫代乙酰胺溶液：取固体硫代乙酰胺加入去离子水中搅拌至完全溶解。
3. 氨基酸标准溶液：将各种氨基酸按照一定比例加入去离子水中，调节pH值至7.0左右。
4. 还原剂：取固体羟肟酸钠加入去离子水中搅拌至完全溶解。
四、实验步骤1. 样品处理：取适量的样品加入硫代乙酰胺溶液中，混合均匀后放置于60℃恒温水浴中反应20分钟。
2. 加入还原剂：将还原剂加入反应体系中，混合均匀后再次放置于60℃恒温水浴中反应20分钟。
3. 加入氢氧化钠溶液：将氢氧化钠溶液加入反应体系中，混合均匀后放置于60℃恒温水浴中反应30分钟。
4. 加入试剂：取适量的氨基酸标准溶液和待测样品分别加入反应体系中，混合均匀后放置于室温下静置10分钟。
5. 测定吸光度：使用分光光度计在570nm波长下测定反应体系的吸光度值。
五、数据处理1. 绘制标准曲线：将不同浓度的氨基酸标准溶液分别测定吸光度值，绘制标准曲线。
2. 计算待测样品中氨基酸含量：根据待测样品的吸光度值和标准曲线计算其中氨基酸含量。
3. 数据统计分析：对实验数据进行统计分析，如平均值、方差等。
六、注意事项1. 实验过程中要注意卫生和安全，避免试剂进入眼睛和口腔。
2. 样品处理时要避免过度稀释或过度浓缩，以保证实验结果的准确性。
氨基酸的测定实验报告
一、实验目的1. 了解氨基酸的基本性质和分类。
2. 掌握氨基酸的测定方法，包括茚三酮比色法和纸层析法。
3. 通过实验，学会运用化学分析方法测定氨基酸的含量。
二、实验原理氨基酸是构成蛋白质的基本单位，具有酸碱两性。
在酸性条件下，氨基酸可以与茚三酮反应生成紫色产物，通过比色法测定氨基酸含量。
纸层析法是一种分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，通过分析氨基酸在层析纸上的迁移距离，可以判断氨基酸的种类。
三、实验材料与仪器1. 试剂：茚三酮、氨基酸标准品、盐酸、无水乙醇等。
2. 仪器：分光光度计、电子天平、移液器、层析缸、层析滤纸等。
四、实验步骤1. 茚三酮比色法测定氨基酸含量（1）配制标准溶液：准确称取一定量的氨基酸标准品，用无水乙醇溶解，配制成一定浓度的标准溶液。
（2）样品处理：准确称取一定量的待测样品，用盐酸溶解，配制成一定浓度的样品溶液。
（3）反应：将标准溶液和样品溶液分别加入反应管中，加入等量的茚三酮，置于沸水浴中加热5分钟。
（4）比色：用分光光度计在570nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。
（5）计算：根据样品溶液的吸光度，从标准曲线上查得氨基酸含量。
2. 纸层析法分离氨基酸（1）点样：将标准氨基酸和待测样品分别点在层析滤纸的原点处。
（2）层析：将点样的滤纸放入层析缸中，加入适量层析溶剂，使溶剂前沿距离滤纸底部约2cm。
（3）观察：待溶剂前沿到达滤纸底部后，取出滤纸，晾干，观察氨基酸在滤纸上的迁移距离。
（4）分析：根据氨基酸在滤纸上的迁移距离，判断氨基酸的种类。
五、实验结果与分析1. 茚三酮比色法测定氨基酸含量通过实验，得到了标准曲线，根据样品溶液的吸光度，从标准曲线上查得氨基酸含量。
2. 纸层析法分离氨基酸通过实验，得到了标准氨基酸和待测样品在层析滤纸上的迁移距离，分析了氨基酸的种类。
六、实验总结1. 本实验成功掌握了氨基酸的测定方法，包括茚三酮比色法和纸层析法。
2. 通过实验，加深了对氨基酸性质和分类的认识。
氨基酸测定
茚三酮显色法测定氨基酸的含量一．原理：凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、氨基酸的溶液与水合茚三酮共热时，能产生紫色化合物，可用比色法进行测定。
氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤。
第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛、茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮与另一个茚三酮分子和NH3缩合生成有色物质。
二．仪器：721型分光光度计台天平减压蒸馏器干燥容量瓶移液枪烧杯试管架试管水浴锅。
三．药品：（1）标准氨基酸溶液：配制成0.3 mmol/L 溶液（2）pH5.4，2mol/L 醋酸缓冲液：量取86mL 2mol/L 醋酸钠溶液，加入14mL 2mol/L 乙酸混合而成。
用pH 检查校正。
（3）茚三酮显色液：称取170mg 茚三酮和30mg 还原茚三酮，用20mL 乙二醇甲醚溶解（4）60％乙醇。
（5）样品液：每毫升含0.5～50μg 氨基酸。
茚三酮若变为微红色，则需按下法重结晶：称取5g 茚三酮溶于15～25mL 热蒸馏水中，加入0.25g 活性炭，轻轻搅拌。
加热30min 后趁热过滤，滤液放入冰箱过夜。
次日析出黄白色结晶，抽滤，用1mL 冷水洗涤结晶，置干燥器干燥后，装入棕色玻璃瓶保存。
还原型茚三酮按下法制备：称取0.5g 茚三酮，用12.5mL 沸蒸馏水溶解，得黄色溶液。
将0.5g 维生素C 用25mL 温蒸馏水溶解，一边搅拌一边将维生素C 溶液滴加到茚三酮溶液中，不断出现沉淀。
滴定后继续搅拌15min，然后在冰箱内冷却到4℃，过滤、沉淀用冷水洗涤3 次，置五氧化二磷真空干燥器中干燥保存，备用。
乙二醇甲醚若放置太久，需用下法除去过氧化物：在500mL 乙二醇甲醚中加入5g 硫酸亚铁，振荡1～2h，过滤除去硫酸亚铁，再经蒸馏，收集沸点为121～125℃的馏分，为无色透明的乙二醇甲醚。
四、操作步骤1．标准曲线的制作分别取0.3mmol/L 的标准氨基酸溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL 于试管中，用水补足至1mL。
测定氨基酸的方法以及试剂
一采用氨基酸自动分析仪测定氨基酸1.氨基酸测定原理：食物蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后，与茚三酮溶液产生颜色反应，再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。
2.测定氨基酸所用仪器:真空泵;恒温干燥箱;水解管：耐压螺盖玻璃管或硬质玻璃管，体积20～30mL。
用去离子水冲洗干净并烘干;真空干燥器(温度可调节);氨基酸自动分析仪。
3.测定氨基酸所用试剂及其配制方法:3.1试剂：全部试剂除注明外均为分析纯，实验用水为去离子水。
浓盐酸(优级纯);苯酚(须重蒸馏); 混合氨基酸标准液(仪器制造公司出售)：0.00250mol/L; 不同pH值柠檬酸钠缓冲液；氢氧化锂(LiOH·H2O)；冰乙酸(优级纯)；二甲基亚砜(C2H6OS)；水合茚三酮(C9H4O3·H2O)；还原茚三酮(C18H10O6·2H2O);NaOH；高纯氮气（纯度99.99%）；冷冻剂：市售食盐与冰按1∶3混合。
3.2试剂配制方法：3.2.1. 6mol/L盐酸∶浓盐酸(3.1)与水1∶1混合而成。
3.2.2. pH2.2的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠(Na3C6H5O7·2H2O)和16.5mL浓盐酸加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至2.2。
pH3.3的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和12mL浓盐酸加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至3.3。
pH4.0的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和9mL浓盐酸加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至4.0。
pH6.4的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和46.8g氯化钠(优级纯)加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至6.4。
3.2.3. 茚三酮溶液pH5.2的乙酸锂溶液：称取氢氧化锂(LiOH·H2O)168g，加入冰乙酸(优级纯)279mL，加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至5.2。
氨基酸的定量测定
6、三硝基苯磺酸法
原理： 三硝基苯磺酸（TNBS）是定量测定氨基酸的重要试剂之一。 TNBS 在偏碱性的条件下与氨基酸反应，先形成中间络合物。 中间络合物在光谱上有2个吸收值相近的高峰，分别位于355nm 和420nm 附近。然而溶液一旦酸化，中间络合物转化成三硝基苯 -氨 基酸（TNP-氨基酸），420nm 处的吸收值显著下降，而350nm 附近 的吸收峰则移至340nm 处。 利用 TNBS 与氨基酸反应的这一特性，可在420nm 处（偏碱性 溶液中）或在340nm（偏酸性溶液中）对氨基酸进行定量测定。在 340nm 处，各氨基酸的吸收度大致相近，而在420nm 处的吸光度因 2 氨基酸种类而异；在加入适量 SO3 时，吸收值升高。 本法允许的测定范围是 0.05～0.4μmol 氨基酸。
1、甲醛滴定法
计算结果：
氨基酸态氮含量=
(V2 V1 ) c 0.014 100 % m
式中：c——氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L V1——用中性红作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液体积，mL V2——用百里酚酞作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液体积， mL m——测定用样品溶液相当于样品的质量，g 1 0.014—— N2毫摩尔质量，g/mmol
100%
式中：VHClO ——所消耗的高氯酸标准溶液的体积 cHClO ——所消耗的高氯酸标准溶液的浓度 M——被测氨基酸的摩尔质量 m——被测氨基酸的质量
4
4、非水溶液滴定法
②回滴法（适用于不易溶解于冰醋酸而能溶解于高氯酸的氨基酸）：精确称取氨 基酸样品30~40mg 左右，溶解于5mL高氯酸标准溶液中，加2滴甲基紫指示剂，剩 余的酸以醋酸钠溶液滴定，颜色变化由黄，经过绿、蓝至初次出现不褪的紫色为 终点。 氨基酸含量=
氨基酸测定
氨基酸测定
氨基酸测定介绍：
氨基酸是构成蛋白质的基本单位。
组成人体蛋白质的氨基酸有21种，除了脯氨基酸为亚氨基酸外，其他氨基酸均为α氨基酸。
组成蛋白质分子的氨基酸都是L-氨基酸，但近年内证实了它们可以异构为D-氨基酸，具体机制还未研究。
氨基酸测定正常值：
氨基酸测定临床意义：
见表2。
氨基酸测定注意事项：
(1)临床上测定血清或血浆的氨基酸，要避免食物消化吸收的影响,应在清晨空腹采血。
(2)标本溶血时不宜采用，以免由于红细胞中的氨基酸进入血血浆导致假性增高。
氨基酸测定检查过程：
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仪器
酸度计磁力搅拌器烧杯（250mL）微量滴定管
试剂
pH=6.18标准缓冲溶液
20%中性甲醛溶液
0.05mol/L左右的NaOH标准溶液
3、测定操作
①样品处理
吸取样品液于100mL容量瓶中,加水定容。吸取定容液20.00mL于250mL烧杯中,加水60mL，放入磁力转子，开动磁力搅拌器使转速适当。用标准缓冲液校正好酸度计，然后将电极清洗干净，再插入到上述样品液中，用NaOH标准溶液滴定至酸度计指示pH8.2,记下消耗的NaOH溶液体积。
2、操作：
用中性红作指示剂，先测定其它游离酸的含量
再用百里酚酞作指示剂测定氨基酸和游离酸的总含量。
3、方法适用范围
浅色样品
4、计算
（五）电位滴定法
1、原理
根据氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，将酸度计的玻璃电极及甘汞电极（或复合电极）插入被测液中构成电池，用碱液滴定，根据酸度计指示的pH值判断和控制滴定终点。
V2---空白滴定在加入甲醛后滴定至pH9.2所用NaOH标准溶液的体积mL
C --- NaOH标准溶液的浓度mol/L
m ---吸取的酱油的质量g
0.014 ---氮的毫摩尔质量g/m mol
举例讲解：同时复习检验评价报告的写法。
现抽取南宁酱油厂生产的塑料袋装铁鸟牌酱油1袋（规格500mL）（生产日期20050520），要求测定氨基酸态氮含量。
操作说明：第一次滴定是除去其它游离酸，所消耗的NaOH溶液体积不用于计算。
第二步滴定才是测定氨基酸，用消耗的NaOH溶液体积进行计算。
4、结果计算
（V1- V2）× C × 0.014
氨基酸态氮% = ———————————— × 100
m × 20/100
V1---酱油稀释液在加入甲醛后滴定至pH9.2所用NaOH标准溶液的体积mL
一、氨基酸态氮的测定
氨基酸态氮：与测定蛋白质相比，氨基酸中的氮可以直接测定。氨基酸中的氮含量称为氨基酸态氮。
（一）氨基酸分析仪法
1原理
基于各种氨基酸的酸碱性、极性和分子大小不同，对阳离子交换树酯的吸附力也不同，在一定的pH和离子强度，从树酯上将这些氨基酸洗脱下来的难易也不同，因此可以控制条件，用不同pH和离子强度的缓冲溶液将逐个分开洗脱下来，然后显色，由分光光度计进行定量比色，测定各个氨基酸的含量。
2样品处理
用酸水解和碱水解方法
酸水解法：用盐酸水解食品中蛋白质，使它转变成氨基酸（允许测出16种氨基酸，其中色氨酸完全被破坏，甘氨酸部分被破坏）。
碱水解法：用NaOH水解样品，测色氨酸
（二）柱前衍生高效液相色谱法
（三）ＯＰＡ柱后衍生－高效液相色谱法
（四）双指示剂甲醛滴定法
1、原理
加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，用强碱滴定。
氨基酸的测定
一、氨基酸态氮的测定
（1）氨基酸分析仪法
（二）柱前衍生高效液相色谱法
（三）ＯＰＡ柱后衍生－高效液相色谱法
（四）双指示剂甲醛滴定法
课堂教学安排
教学
过程
主要教学内容及步骤
（教师活动、学生活动及活动形式与目的请加以说明）
导入新课
讲授新课
小结
作业布置
蛋白质组成单位是氨基酸，氨基酸同样由。碳、氢、氧、氮等元素组成，但是蛋白质性质与氨基酸性质有些不同。
主题序号
13
授课班级
173烹饪营养
授课形式
新授
教学主题
氨基酸的测定
教学目的
掌握氨基酸常用测定的方法和原理；培养学生科学素养和严谨的态度和工作作风
教学重点
氨基酸测定方法和原理
教学难点
氨基酸测定方法和原理
更新、补充、删节内容
无
使用教具
多媒体、黑板、粉笔
课外作业
1、简述氨基酸电位法测定原理。
教学反思
授课主要内容或板书设计
标准偏差S＝√[（0.48%－0.50%）2＋（0.49%－0.50%）2＋（0.50%－0.50%）2＋（0.52%－0.50%）2]÷（4－1）
＝17%
相对标准偏差Cr＝S/X×100%＝0.017%/0.52%×100%=3%
小结
本节课学习了几种氨基酸测定原理的几种方法，尤其是自动电位滴定法。
在上述滴定至pH8.2的溶液中加入10.00mL的中性甲醛溶液，再用NaOH标准溶液滴定至pH9.2,消耗的NaOH溶液体积为9.12mL。
吸取80mL蒸馏水于250mL的烧杯中，用NaOH标准溶液滴定至pH8.2,然后加入10.00mL中性甲醛溶液，再用NaOH标准溶液滴定至pH9.2,加入甲醛后消耗的NaOH溶液体积为1.36mL。
酱油的质量m＝d420×V＝1.128×5.00＝5.64g
酱油稀释液在加入甲醛后滴定至pH9.2所用NaOH标准溶液的体积V1＝9.12mL
空白滴定在加入甲醛后滴定至pH9.2所用NaOH标准溶液的体积V2＝1.36mL
NaOH标准溶液的浓度C＝0.0498mol/L
根据电位滴定法，计算氨基酸态氮含量
（V1- V2）× C × 0.014
氨基酸态氮% = ———————————— × 100
m × 20/100
（9.12-1.36）×0.0498 × 0.014
＝――――――――――――――× 100
5.64× 20/100
＝0.48
3、先进行数据处理
从大到小排列测定结果数据：0.36%，0.48%，0.49%, ,0.50%,0.52%
作业布置
简述氨基酸电位滴定法原理。
1、请问在测定过程中为什么要加入中性甲醛？
2、计算该次氨基酸态氮含量测定结果。
3、该检验员按同样的方法另作了4次测定，结果分别为0.49%,0.36%,0.50%,0.52%，请你写一份完整的检验评价报告。
解：1、加入中性甲醛是为了固定氨基酸中的氨基，使羧基显示出酸性，才能进行氨基酸测定。
2、依据题意，酱油的相对密度d420=1.128,取样体积V＝5.00 mL
可以看出0.36%与其它各次结果偏离太远，应为测定可疑值。
X2－X10.48%－0.36%
Q＝＝＝0.86＞0.64
Xn – X10.52%－0.36%
∵Q0.90＝0.64∴0.36%测定结果值应舍去，应用其它四次测定值计算。
测定结果平均值X＝（0.48%+0.49% +0.50%+0.52%）/4 = 0.50%（0.4975%）
②氨基酸的滴定
在上述滴定至pH8.2的溶液中加入10.00mL的中性甲醛溶液，再用NaOH标准溶液滴定至pH9.2,记下消耗的NaOH溶液体积。
③空白滴定
吸取80mL蒸馏水于250mL的烧杯中，用NaOH标准溶液滴定至pH8.2,然后加入10.00mL中性甲醛溶液，再用NaOH标准溶液滴定至pH9.2,记下加入甲醛后消耗的NaOH溶液体积。
某检验员按密度瓶法测定了该酱油的相对密度为1.128，然后吸取酱油5.00mL于100mL容量瓶中,加水定容。
吸取定容液20.00mL于250mL烧杯中,加水60mL，放入磁力转子，开动磁力搅拌器使转速适当。用pH6.18的标准缓冲液校正好酸度计，然后将电极清洗干净，再插入到上述酱油液中，用0.0498 mol/LNaOH标准溶液滴定至酸度计指示pH8.2,消耗的NaOH溶液体积为2.21mL。