氨基酸测定
氨基酸含量测定和标准曲线制作(茚三酮法)
茚三酮比色法测定游离氨基酸含量原理：茚三酮与氨基酸的反应分两步进行，首先是氨基酸被氧化，产生二氧化碳､氨和醛，而水合茚三酮被还原成还原性茚三酮；第二步是所生成的还原性茚三酮与另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成成为蓝紫色化合物，该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比｡磷酸缓冲液（pH.8.04）：称磷酸二氢钾4.5350 g，定容500 ml。
称NAH2PO4·12H2O11.9380 g分别溶解定容500 ml。
取磷酸二氢钾10 ml与磷酸氢二钠190ml混合即为pH8.04的缓冲液2％茚三酮溶液：称取水合茚三酮 2 g，加水溶解后定容至 100 mL。
储成于棕色瓶中，避光保存。
0.25%抗坏血酸溶液：称取抗坏血酸 0.1 g，加水溶解后定容至 100 mL，现配现用，或者密封，冻存于-20 o C。
茚三酮反应液：取50 ml 2% 茚三酮，加入5 ml 0.25%的Vc，使用蒸馏水稀释到100 ml，密封储存在棕色瓶中。
亮氨酸标准液:称取 100 mg 亮氨酸（纯度不低于 99%）溶于 100 mL 水中，作为母液，此时亮氨酸的浓度为1 mg/mL。
茚三酮标准曲线制作溶液中氨基酸的浓度如果低于20 μg/ml，茚三酮显色反应将不能发生，故先配制不同浓度的氨基酸标准液，取十支试管，标号为1，2，3……10，按照下表配制1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1000 μg/ml亮氨酸超纯水 ml 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9 8.9 8.8 8.7 8.6 8.5 亮氨酸 终浓度μg/ml 405060708090100110120130140150使用螺旋盖（内垫）试管分别取上述浓度的氨基酸标准液1ml，空白对照使用1ml 超纯水替代氨基酸标准液，然后向各个试管中加入0.5 ml 的茚三酮反应液和0.5 ml 的磷酸缓冲液，盖好盖子悬紧，置于沸水浴中煮沸15 min，分别加入3 ml 的超纯水，斡旋混匀，测定吸光度，绘制标准曲线取一支中等程度显色的试管进行紫外和可见波段的全波长扫描，结果如下图所示3004005006007008000.00.10.20.30.40.50.60.7吸光度波长（nm ）403 nm565 nm选择565 nm 作为其最大吸收波长，测定各管的吸光度，弃去吸光度大于1的值 茚三酮终浓度（μg/mL） 565 nm 的吸光度 20 0.037 25 0.114 30 0.226 35 0.347 40 0.412 45 0.538 500.62155 0.692 60 0.754 65 0.834 700.968使用origin 8.5 绘制散点图并进行线性拟合，结果如下图所示0.00.20.40.60.81.0O D 565氨基酸浓度（μg/mL ）注意事项：1. 茚三酮比色受测定环境中的pH 影响很大，故每次测定前需要将样品溶液的pH 值调整到中性（pH7左右），2. 茚三酮不光可以与氨基酸反应，与蛋白质同样可以反应，因此需要在测定前去除溶液中的蛋白质，因此正确做法是：向样品溶液中加入等体积等0.6 mol/L 三氯乙酸，斡旋震荡，静置10 min 后，3000 rpm 离心10 min，取上清调整pH 值至中性pH7左右，再进行测定，3. 稀释倍数的确定：因为标准曲线的测定范围为20-70 μg/mL，即20-70 mg/L，所以在不清楚你所要检测样品中氨基酸的浓度时，最好取部分样品稀释10倍和100倍，分别检测原液、十倍稀释液和100倍稀释液的OD565，发现哪个水平下OD565落在标准曲线的范围内，从而判断需要对样品稀释多少倍4. 标准曲线测定时最好选择密封性较好的试管（螺旋盖硅胶内垫），同时需要检查气密性，防止水浴蒸发导致计量误差或者使用10 mL 具塞比色管，以方便在水浴之后可以准确补水。
8第六章 氨基酸定量测定
1.原理： 强离子交换树脂－二乙烯苯树脂： 交联度大，8-12％。 树脂的结构紧密，孔隙度小，适用于分子较小的氨 基酸的分离。选用Na型的树脂。
吸附：一般在pH2.2溶解样品，由于pH比较低，氨 基酸的H＋解离被抑制，氨基酸带正电荷，可以与阳 离子交换树脂发生交换。
样品 液
分离 柱
M
Na+
pK1
COOCH2(CH2)4+NH3
+NH 3
pK2 9.0
COO CH2(CH2)4+NH3 NNH2 NH2
赖氨酸的等当电＝（ pK1＋pK2）/ 2 = 9.75
洗脱：当pH2.2，3.3，4.9等缓冲液相继流经树脂时， 随着pH逐渐升高，氨基酸失去正电荷，与树脂结合 减弱，从树脂上脱落下来。由于氨基酸的氨基不同， 因此与柱子的结合能力不同。 酸性氨基酸带的正电荷少，等电点比较低，碱性氨 基酸带的正电荷多，被置换下来的pH比较高。
吹数分钟(或置于70～80℃烘
箱中烘干)即可观察到紫红色
的氨基酸斑点，脯氨酸例外，
为黄色斑点。
用铅笔圈出氨基酸斑点，量出溶剂前沿的距离及 各斑点中心与起点之间的距离，并计算各氨基酸 的Rf值。
原点到层析点中心的距离
Rf＝ 原点到溶剂前沿的距离
标准氨基酸薄层层析色谱
氨基酸的性质与Rf之间的关系
层析的分离是基于氨基酸的非极性性质。 物质的极性越小（即非极性越大）,在有机溶剂中分 配就越多，迁移率Rf就越大；
混合样
加样
洗脱剂
分离结果
影响电离的基团：氨基、羧基、胍基、咪唑基、酚基。
洗脱顺序： 酸性氨基酸，中性氨基酸，芳香族氨基 酸，碱性氨基酸 日立832型氨基酸分析仪的洗脱顺序： 天门冬，苏，丝，谷，脯，甘，丙，半胱，缬，蛋， 异亮，亮，酪，苯丙，赖，氨，组，精
氨基酸的测定方法
食物中氨基酸的测定方法测定食物中的胱氨酸使用过甲酸氧化-氨基酸自动分析仪法，测定色氨酸使用荧光分光光度法，测定其它氨基酸使用氨基酸自动分析仪法。
一、氨基酸自动分析仪法1.原理食物蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后，与茚三酮溶液产生颜色反应，再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。
一份水解液可同时测定天冬，苏，丝，谷，脯，甘，丙，缬，蛋，异亮，亮，酪，苯丙，组，赖和精氨酸等16种氨基酸，其最低检出限为10pmol。
2.适用范围GB/T14965-1994食物中氨基酸的测定方法。
本法适用于食物中的16种氨基酸的测定。
其最低检出限为10pmol。
本方法不适用于蛋白质含量低的水果、蔬菜、饮料和淀粉类食物的测定3.仪器和设备3.1真空泵3.2恒温干燥箱3.3水解管：耐压螺盖玻璃管或硬质玻璃管，体积20～30ml。
用去离子水冲洗干净并烘干。
3.4真空干燥器（温度可调节）3.5氨基酸自动分析仪。
4.试剂全部试剂除注明外均为分析纯，实验用水为去离子水。
4.1浓盐酸：优级纯4.26mol/L盐酸：浓盐酸与水1：1混合而成。
4.3苯酚：需重蒸馏。
4.4混合氨基酸标准液（仪器制造公司出售）：0.0025mol/L4.5缓冲液：4.5.1 pH2.2的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠（Na3C6H5O7.2H2O）和16.5ml浓盐酸加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至2.24.5.2 pH3.3的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和12ml浓盐酸加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节至pH至3.3。
4.5.3 pH4.0的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和9ml浓盐酸加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至4.0。
4.5.4 pH6.4的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和46.8g氯化钠（优级纯）加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至6.4。
高效液相色谱化学发光检测法测定氨基酸
高效液相色谱化学发光检测法测定氨基酸1氨基酸氨基酸是类似于蛋白质的有机化合物，也是人体代谢过程中不可或缺的物质，具有重要的生理功能，人们发现它对人体健康有重要作用。
氨基酸分为线粒体氨基酸和细胞质氨基酸，它们可以通过液相色谱（HPLC）和其他技术进行测定。
2高效液相色谱化学发光检测法高效液相色谱化学发光检测法(HPLC-FLD)是一种非常常用的检测方法，是在液相色谱的基础上添加了化学发光探测器。
它具有高灵敏度、高分离度和快速分析等优势，得到了广泛应用。
在研究氨基酸中，HPLC-FLD可以较为准确地检测和分离氨基酸，从而实现对氨基酸浓度的准确测定及调整。
3工作原理HPLC-FLD工作过程是：在分析柱内，将水，乙腈，乙醇等溶剂混合，氨基酸将在柱中混有不同的动力学行为。
当氨基酸离开柱时，经测量氨基酸在化学发光探测器上发出的发光信号，可以计算出它们的相对浓度，从而判断氨基酸含量。
4检测步骤（1）样品准备：样品中含有氨基酸的各种溶液，需经过提取，稀释或洗脱处理等，以便于之后的检测。
（2）色谱层析：把样品按照一定的色谱层析方式，分离不同的成分，从而使不同的成分分离出来。
（3）发光测定：在这一步，人们可以利用HPLC-FLD测定氨基酸。
首先，样品将通过有机溶剂组合作用，激活发光反应，然后将样品通过化学发光探头的发光状态记录下来，并计算概率密度，最终得出样品中氨基酸的含量和比例。
5优势HPLC-FLD在检测氨基酸中有很多优势：（1）可以快速准确地检测氨基酸；（2）可实现高灵敏度和高分离度；（3）化学发光探头具有长寿命、可靠以及易于操作等优势；（4）可克服外界因素对分析结果的影响；（5）可以长时间连续检测，勤奋节约成本。
6结论HPLC-FLD是一种高效的技术，在检测氨基酸方面具有较高的准确性和效率，它不但能够用于氨基酸的检测，还可用于其他有机物分离和测定，在生物和药物领域都有广泛应用。
氨基酸测定方法
氨基酸测定方法一、引言氨基酸是构成蛋白质的基本单位，因此对于蛋白质的研究和分析，氨基酸的测定是非常重要的。
目前，常用的氨基酸测定方法主要有色氨酸法、二硫化物法、硫酸铜法、乙醇胺法、二甲基乙二胺法等。
本文将从样品处理、试剂配制、实验步骤和数据处理等方面详细介绍氨基酸测定方法。
二、样品处理1. 样品收集：选择适当的组织或液体样品进行采集，如血清、尿液等。
2. 样品预处理：根据不同样品特点进行预处理，如尿液中可加入少量硝酸使其变为无色透明状态。
3. 样品保存：在低温条件下保存样品以避免其蛋白质降解。
三、试剂配制1. 氢氧化钠溶液：取固体氢氧化钠加入去离子水中搅拌至完全溶解。
2. 硫代乙酰胺溶液：取固体硫代乙酰胺加入去离子水中搅拌至完全溶解。
3. 氨基酸标准溶液：将各种氨基酸按照一定比例加入去离子水中，调节pH值至7.0左右。
4. 还原剂：取固体羟肟酸钠加入去离子水中搅拌至完全溶解。
四、实验步骤1. 样品处理：取适量的样品加入硫代乙酰胺溶液中，混合均匀后放置于60℃恒温水浴中反应20分钟。
2. 加入还原剂：将还原剂加入反应体系中，混合均匀后再次放置于60℃恒温水浴中反应20分钟。
3. 加入氢氧化钠溶液：将氢氧化钠溶液加入反应体系中，混合均匀后放置于60℃恒温水浴中反应30分钟。
4. 加入试剂：取适量的氨基酸标准溶液和待测样品分别加入反应体系中，混合均匀后放置于室温下静置10分钟。
5. 测定吸光度：使用分光光度计在570nm波长下测定反应体系的吸光度值。
五、数据处理1. 绘制标准曲线：将不同浓度的氨基酸标准溶液分别测定吸光度值，绘制标准曲线。
2. 计算待测样品中氨基酸含量：根据待测样品的吸光度值和标准曲线计算其中氨基酸含量。
3. 数据统计分析：对实验数据进行统计分析，如平均值、方差等。
六、注意事项1. 实验过程中要注意卫生和安全，避免试剂进入眼睛和口腔。
2. 样品处理时要避免过度稀释或过度浓缩，以保证实验结果的准确性。
氨基酸含量的测定-茚三酮比色法
实验九 氨基酸含量的测定 （茚三酮比色法）
1. 实验原理
凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、 氨基酸（脯氨酸除外）在碱性溶液中与水合茚三 酮共热时，产生紫色化合物，最大吸收波长在 570nm处，在一定浓度范围内，颜色深浅与氨基 酸含量成正比，可用比色法进行测定。
氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤：
（3）通常采用的样品处理方法为：准确称取粉碎 后的样品5g～10g或吸取液体样品5mL～10mL， 置于烧杯中，加入50mL蒸馏水和5g左右的活性炭， 加热煮沸，过滤。用30mL～40mL热水洗涤活性 炭，收集滤液于100mL容量瓶中，加水至刻度线， 摇匀备用。
6. 思考题 （1）茚三酮法测定氨基酸的原理是什么？ （2）试比较三种方法测定氨基酸含量的优缺点
2. 实验材料、仪器与试剂 材料：酱油 仪器：可见分光光度计，分析天平，容量 瓶，移液管，具塞刻度试管。 试剂：茚三酮、氯化亚锡、磷酸二氢钾、 磷酸氢二钠、标准氨基酸（异亮氨酸）。
（3）样品测定
管号
8 9 10 11
样品溶液/mL 0 0.5 0.5 0.5
水/mL
1.6 1.1 1.1 1.1
磷酸盐缓冲液/mL 0.4 0.4 0.4 0.4
茚三酮/mL
0.4 0.4 0.4 0.4
按上表加样后混匀，按标准曲线的步骤进行 实验，在相同条件下测定样品的吸光度，并在标 准曲线上查（1）该法是微量法，对氨基酸的最低检出量可 达0.5μg，其其灵敏度高，重现性好。 （2）脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色， 最大吸收波长在440nm处。
氨基酸的测定实验报告
一、实验目的1. 了解氨基酸的基本性质和分类。
2. 掌握氨基酸的测定方法，包括茚三酮比色法和纸层析法。
3. 通过实验，学会运用化学分析方法测定氨基酸的含量。
二、实验原理氨基酸是构成蛋白质的基本单位，具有酸碱两性。
在酸性条件下，氨基酸可以与茚三酮反应生成紫色产物，通过比色法测定氨基酸含量。
纸层析法是一种分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，通过分析氨基酸在层析纸上的迁移距离，可以判断氨基酸的种类。
三、实验材料与仪器1. 试剂：茚三酮、氨基酸标准品、盐酸、无水乙醇等。
2. 仪器：分光光度计、电子天平、移液器、层析缸、层析滤纸等。
四、实验步骤1. 茚三酮比色法测定氨基酸含量（1）配制标准溶液：准确称取一定量的氨基酸标准品，用无水乙醇溶解，配制成一定浓度的标准溶液。
（2）样品处理：准确称取一定量的待测样品，用盐酸溶解，配制成一定浓度的样品溶液。
（3）反应：将标准溶液和样品溶液分别加入反应管中，加入等量的茚三酮，置于沸水浴中加热5分钟。
（4）比色：用分光光度计在570nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。
（5）计算：根据样品溶液的吸光度，从标准曲线上查得氨基酸含量。
2. 纸层析法分离氨基酸（1）点样：将标准氨基酸和待测样品分别点在层析滤纸的原点处。
（2）层析：将点样的滤纸放入层析缸中，加入适量层析溶剂，使溶剂前沿距离滤纸底部约2cm。
（3）观察：待溶剂前沿到达滤纸底部后，取出滤纸，晾干，观察氨基酸在滤纸上的迁移距离。
（4）分析：根据氨基酸在滤纸上的迁移距离，判断氨基酸的种类。
五、实验结果与分析1. 茚三酮比色法测定氨基酸含量通过实验，得到了标准曲线，根据样品溶液的吸光度，从标准曲线上查得氨基酸含量。
2. 纸层析法分离氨基酸通过实验，得到了标准氨基酸和待测样品在层析滤纸上的迁移距离，分析了氨基酸的种类。
六、实验总结1. 本实验成功掌握了氨基酸的测定方法，包括茚三酮比色法和纸层析法。
2. 通过实验，加深了对氨基酸性质和分类的认识。
氨基酸测定
茚三酮显色法测定氨基酸的含量一．原理：凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、氨基酸的溶液与水合茚三酮共热时，能产生紫色化合物，可用比色法进行测定。
氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤。
第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛、茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮与另一个茚三酮分子和NH3缩合生成有色物质。
二．仪器：721型分光光度计台天平减压蒸馏器干燥容量瓶移液枪烧杯试管架试管水浴锅。
三．药品：（1）标准氨基酸溶液：配制成0.3 mmol/L 溶液（2）pH5.4，2mol/L 醋酸缓冲液：量取86mL 2mol/L 醋酸钠溶液，加入14mL 2mol/L 乙酸混合而成。
用pH 检查校正。
（3）茚三酮显色液：称取170mg 茚三酮和30mg 还原茚三酮，用20mL 乙二醇甲醚溶解（4）60％乙醇。
（5）样品液：每毫升含0.5～50μg 氨基酸。
茚三酮若变为微红色，则需按下法重结晶：称取5g 茚三酮溶于15～25mL 热蒸馏水中，加入0.25g 活性炭，轻轻搅拌。
加热30min 后趁热过滤，滤液放入冰箱过夜。
次日析出黄白色结晶，抽滤，用1mL 冷水洗涤结晶，置干燥器干燥后，装入棕色玻璃瓶保存。
还原型茚三酮按下法制备：称取0.5g 茚三酮，用12.5mL 沸蒸馏水溶解，得黄色溶液。
将0.5g 维生素C 用25mL 温蒸馏水溶解，一边搅拌一边将维生素C 溶液滴加到茚三酮溶液中，不断出现沉淀。
滴定后继续搅拌15min，然后在冰箱内冷却到4℃，过滤、沉淀用冷水洗涤3 次，置五氧化二磷真空干燥器中干燥保存，备用。
乙二醇甲醚若放置太久，需用下法除去过氧化物：在500mL 乙二醇甲醚中加入5g 硫酸亚铁，振荡1～2h，过滤除去硫酸亚铁，再经蒸馏，收集沸点为121～125℃的馏分，为无色透明的乙二醇甲醚。
四、操作步骤1．标准曲线的制作分别取0.3mmol/L 的标准氨基酸溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL 于试管中，用水补足至1mL。
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食物中氨基酸的测定方法测定食物中的胱氨酸使用过甲酸氧化-氨基酸自动分析仪法，测定色氨酸使用荧光分光光度法，测定其它氨基酸使用氨基酸自动分析仪法。
一、氨基酸自动分析仪法1.原理食物蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后，与茚三酮溶液产生颜色反应，再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。
一份水解液可同时测定天冬，苏，丝，谷，脯，甘，丙，缬，蛋，异亮，亮，酪，苯丙，组，赖和精氨酸等16种氨基酸，其最低检出限为10pmol。
2.适用范围GB/T14965-1994食物中氨基酸的测定方法。
本法适用于食物中的16种氨基酸的测定。
其最低检出限为10pmol。
本方法不适用于蛋白质含量低的水果、蔬菜、饮料和淀粉类食物的测定3.仪器和设备3.1真空泵3.2恒温干燥箱3.3水解管：耐压螺盖玻璃管或硬质玻璃管，体积20～30ml。
用去离子水冲洗干净并烘干。
3.4真空干燥器（温度可调节）3.5氨基酸自动分析仪。
4.试剂全部试剂除注明外均为分析纯，实验用水为去离子水。
4.1浓盐酸：优级纯4.26mol/L盐酸：浓盐酸与水1：1混合而成。
4.3苯酚：需重蒸馏。
4.4混合氨基酸标准液（仪器制造公司出售）：0.0025mol/L4.5缓冲液：4.5.1 pH2.2的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠（Na3C6H5O7.2H2O）和16.5ml浓盐酸加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至2.24.5.2 pH3.3的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和12ml浓盐酸加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节至pH至3.3。
4.5.3 pH4.0的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和9ml浓盐酸加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至4.0。
4.5.4 pH6.4的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和46.8g氯化钠（优级纯）加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至6.4。
4.6茚三酮溶液4.6.1 pH5.2的乙酸锂溶液：称取氢氧化锂（LiOH.H2O）168g，加入冰乙酸（优级纯）279ml，加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠调节pH至5.2。
4.6.2茚三酮溶液：取150ml二甲基亚砜（C2H6OS）和乙酸锂溶液（2.6.1）50ml加入4g水合茚三酮（C9H4O3.H2O）和0.12g还原茚三酮（C18H10O6.2H2O）搅拌至完全溶解。
4.7高纯氮气：纯度99.99%。
4.8 冷冻剂：市售食盐与冰按1：3混合5.操作步骤5.1样品处理：样品采集后用匀浆机打成匀浆（或者将样品尽量粉碎）于低温冰箱中冷冻保存，分析用时将其解冻后使用。
5.2称样：准确称取一定量样品，精确到0.0001g。
均匀性好的样品如奶粉等，使样品蛋白质含量在10～20mg范围内；均匀性差的样品如鲜肉等，为减少误差可适当增大称样量，测定前再稀释。
将称好的样品防于水解管中。
5.3水解：在水解管内加6mol/L盐酸10～15ml（视样品蛋白质含量而定），含水量高的样品（如牛奶）可加入等体积的浓盐酸，加入新蒸馏的苯酚3～4滴，再将水解管放入冷冻剂中，冷冻3～5min，再接到真空泵的抽气管上，抽真空（接近0psi），然后充入高纯氮气；再抽真空充氮气，重复三次后，在充氮气状态下封口或拧紧螺丝盖将已封口的水解管放在110±1℃的恒温干燥箱内，水解22h后，取出冷却。
打开水解管，将水解液过滤后，用去离子水多次冲洗水解管，将水解液全部转移到50ml容量瓶内，用去离子水定容。
吸取滤液1ml于5ml容量瓶内，用真空干燥器在40～50℃干燥，残留物用1～2ml水溶解，再干燥，反复进行两次，最后蒸干，用1mlpH2.2的缓冲液溶解，供仪器测定用。
5.4测定：准确吸取0.200ml混合氨基酸标准，用pH2.2的缓冲液稀释到5ml，此标准稀释浓度为5.00nmol/50μL，作为上机测定用的氨基酸标准，用氨基酸自动分析仪以外标法测定样品测定液的氨基酸含量。
6.计算上机样品液（50mL）中氨基酸量（nmol）=上机标准液（50mL）中氨基酸量（nmol）×样品峰面积/氨基酸标准峰面积所以，100g样品中氨基酸的mg 数=上机样品液中氨基酸量（nmol）×f ×Mr×100/（m×V×106）式中f--样品的稀释倍数Mr--氨基酸的相对分子量m--样品质量（g）V--上机时的进样量（此处为50mL）7.其他7.1测定条件（以Beckman-6300型氨基酸自动分析仪为例）缓冲液流量：20mL/h；茚三酮流量：10mL/h；柱温：50、60和70℃；色谱柱：20cm；分析时间：42min。
7.2标准出峰顺序和保留时间序号出峰顺序保留时间/min 序号出峰顺序保留时间/min1 天冬氨酸 5.55 9 蛋氨酸19.632 苏氨酸 6.60 10 异亮氨酸21.243 丝氨酸7.09 11 亮氨酸22.064 谷氨酸8.72 12 酪氨酸24.525 脯氨酸9.63 13 苯丙氨酸25.766 甘氨酸12.24 14 组氨酸30.417 丙氨酸13.10 15 赖氨酸32.578 缬氨茇16.65 16 精氨酸40.757.3允许差：同实验室平行测定或连续两次测定结果相对偏差绝对值≤12%。
二、食物中胱氨酸的测定方法---氨基酸自动分析仪法（过甲酸氧化）1.原理在用盐酸水解蛋白质的过程中，胱氨酸易被破坏，现多采用过甲酸氧化法将蛋白质中的胱氨酸及半胱氨酸氧化成半胱磺酸，其反应如下：SH NH2 O SO3H NH2 OCH2 CH COOH+3H C OOH CH2 CH COOH+3H C OH半胱氨酸过甲酸半胱磺酸甲酸生成的半胱磺酸可在氨基酸自动分析仪上进行测定，与标准半胱磺酸比较，计算其含量。
2.适用范围参照中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所编写的食物营养成分测定法第三版。
适用于食物中胱氨酸的测定。
3.仪器水解瓶：耐压螺盖玻璃管或硬质试管，体积20～30mL，用去离子水冲净并烘干，电热减压蒸发器。
4.试剂过甲酸：取9mL分析纯甲酸加入1mL30%过氧化氢混合，在室温放置2小时以上。
5.操作步骤5.1过甲酸氧化：称取一定量的食物样品置于水解瓶中，使样品含蛋白质在5～10mg，加入1mL过甲酸试剂，在室温放置3小时。
加1mL乙醇终止氧化。
将样品瓶置于电热减压器中，于45℃减压蒸干，用1mL去离子水淋洗瓶壁，再蒸干，反复3次，以除去过甲酸。
5.2盐酸水解：同食物中氨基酸（16种）测定方法5.3在Bekman6300氨基酸自动分析仪上，在注文50℃时用pH3.25柠檬酸缓冲液洗脱，半胱磺酸的出峰时间约在1.78分钟。
6.计算上机样品液（50μl）中半胱磺酸量=上机标准液中半胱磺酸量（nmol）×样品峰面积/半胱磺酸标准峰面积100g样品中胱氨酸mg数=上机样品中半胱磺酸量（nmol）×D×M×100/（W×E×106×2）式中D：样品稀释倍数M：胱氨酸分子量（ng）W：称样量（g）E：上机时的进样量（此处为50μl）三、食物中色氨酸的测定--荧光分光光度法1.原理食物中蛋白质在酸水解过程中，其色氨酸极易被分解，本法用碱水解蛋白质，直接测定色氨酸的天然荧光。
在蛋白质水解液中，只有色氨酸和酪氨酸可以检测到荧光。
在pH为11时，色氨酸的荧光强度比酪氨酸大100倍，且两种氨基酸的荧光峰相差40多nm，利用此特点，可在有大量酪氨酸的存在下，检测色氨酸的含量。
2.适用范围参照中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所编写的食物营养成分测定法第三版。
适用于食物中色氨酸的测定。
3.仪器3.1荧光分光光度计3.2减压蒸发器3.3螺旋盖大口瓶（瓶盖要有橡皮垫）3.4聚四氟乙烯管3.5小玻璃球3.6烘箱4.试剂（1）5mol/L NaOH：内含0.5%可溶性淀粉，临用前配制。
（2）4mol/L 尿素（pH=11）（3）6mol/L盐酸（4）溴百里酚蓝指示剂：称取0.1g溴百里酚蓝加0.1mol/L氢氧化钠1.6ml，配成0.05%水溶液。
（5）高纯氮（含量99.999%）（6）辛醇甲苯溶液：内含1%辛醇（7）色氨酸标准液：（1mg/ml）：称取色氨酸标准，用0.005mol/L的氢氧化钠溶液溶解，贮存于冰箱保存。
5.操作步骤5.1称取含粗蛋白质约5mg的食物样品，置于聚四氟乙烯管中，加含可溶性淀粉的5mol/L氢氧化钠1ml，加入1滴辛醇。
5.2将各管分别盖上小玻璃球，放入1只带螺旋盖的大口玻璃瓶中，将瓶置于减压蒸发装置中，加冰和盐降温，减压至真空度 1.3Kpa10mmHg以下，继续保持15min，充氮气再减压，如此反复3次，迅速旋紧大口瓶的螺旋盖。
5.3将充氮气的大口瓶置于烤箱内，在110℃水解样品22小时。
5.4冷却大口瓶，用重蒸馏水将样品分别洗至25ml容量瓶中，（内含6N Hcl 0.7ml）用溴百里酚蓝为指示剂调pH至中性，用重蒸水定容至刻度。
5.5吸取样品液1ml，于10ml带盖试管内，用pH11的4mol/L尿素溶液稀释至刻度，在激发波长为280nm，发射波长为360mm下测定荧光强度，根据标准色氨酸的荧光强度曲线，计算样品中色氨酸含量。
5.6色氨酸标准曲线：用前将标准贮备液稀释成每ml含100，200，300，400μg 的色氨酸标准系列。
取每种浓度的标准液各1ml（双份）与样品管同样加试剂，同时水解，以色氨酸标准浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标绘制标准曲线。
6.计算每100g样品中的色氨酸含量（mg）=（A×D×100）/1000×W式中A：根据标准曲线得到的每ml测定液中色氨酸的含量（mg）D：稀释倍数W：取样量（克）。