PITC法氨基酸的测定
乳制品中L-羟脯氨酸的测定
乳制品中L-羟脯氨酸的测定1 引言皮革水解蛋白是由皮革废料或动物皮毛、脏器等水解生成的一种蛋白粉，将其掺入牛奶或奶粉中可提高蛋白质的含量。
对于乳与乳制品中皮革水解蛋白的鉴定，主要是通过对L-羟脯氨酸含量的测定。
L-羟脯氨酸是胶原蛋白（皮革水解蛋白）特有的氨基酸，在乳酷蛋白中则没有，所以一旦检出，则可认为含有皮革水解蛋白，即为“皮革奶”。
本实验提供两种L-羟脯氨酸衍生方法，利用氨基酸分析柱，对L-羟脯氨酸进行分析检测，可根据实际情况进行选择。
2 仪器与试剂2.1 仪器、器皿2.1.1 HPLC+紫外检测器2.1.2 Diamonsil AAA氨基酸分析柱（CAT#: 99751）。
2.1.3 11 mL水解瓶（CAT#: 55354）2.1.4 1.5 mL塑料离心管。
2.1.5 20 mL玻璃具塞刻度试管。
2.1.6 5 mL玻璃具塞刻度试管。
2.1.7 0.22 μm针式过滤器（CAT#:37177）。
2.1.8 2 mL样品瓶（瓶：CAT#:5323，盖CAT#:5325）2.2 试剂2.2.1 甲醇（CAT#:50102）。
2.2.2 乙腈（CAT#:50101）2.2.3 正己烷（CAT#:50115）2.2.3 三乙胺（CAT#:50131）2.2.4 冰醋酸（CAT#:50132）2.2.5 三乙胺（CAT#:50131）2.2.6 磷酸氢二钠（CAT#:50158）2.2.7 磷酸二氢钠（CAT#:50157）2.2.8 L-羟脯氨酸（CAT#:46587）2.2.9 蛋白水解试剂：称取0.1 g苯酚置于100 mL容量瓶，加入50 mL浓盐酸（36%-38%，摩尔浓度约为12 mol/L），然后加水定容至100 mL。
2.2.10 0.1 mol/L HCl水溶液：量取8.3 mL浓盐酸，然后用纯水定容至1000 mL。
2.2.11 衍生剂PITC溶液：将250 μL异硫氰酸苯酯（PITC）用乙腈定容至10 mL。
葡萄酒中游离氨基酸的测定 高效液相色谱法(编制说明)
《葡萄酒中游离氨基酸的测定高效液相色谱法》行业标准编制说明（征求意见稿）一、工作简况1、任务来源本项目是根据工业和信息化部2010年第二批行业标准制修订计划，《葡萄酒中氨基酸测定方法》(计划号：2010-2865T- QB)，列入轻工行业标准计划。
主要起草单位：中国食品发酵工业研究院等。
本标准由全国食品发酵标准化中心归口，计划应完成时间为2011年。
在标准起草阶段，起草工作组确定以高效液相色谱法作为葡萄酒中氨基酸的测定方法，且该方法适用于游离态的氨基酸。
根据相关起草专家建议，为更准确、完整的说明标准中所采用的标准方法以及方法的适用对象，将原标准计划名称进行调整。
标准名称由《葡萄酒中氨基酸测定方法》变更为《葡萄酒中游离氨基酸的测定高效液相色谱法》。
2、主要工作过程起草阶段：2011年1月-2013年12月计划下达后起草工作组查阅国内外上有关葡萄酒中氨基酸测定的文献的基础上，拟建立液相色谱测定葡萄酒氨基酸的方法的方案，该方法操作方便，仪器普及率高。
但是葡萄酒中氨基酸含量较低（脯氨酸除外），给方法的研究带来较大的困难。
起草组采用过异硫氰酸苯酯（PITC ）、6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸（AQC）和OPA 等不同的衍生剂开展了样品直接稀释，或氮吹浓缩、冷冻干燥等不同样品处理方法，以及比较外标、内标的等定量方法，测定方法的回收率或重复性都难以满足方法应用的要求。
2014年1月-2015年12月起草工作组重新考虑研究方案的思路通过查阅国际上有关葡萄酒中氨基酸测定的文献，结合葡萄酒中氨基酸含量较低的特点，决定采用柱前衍生-液相色谱-荧光检测器测定葡萄酒中氨基酸。
通过对不同衍生试剂的特点进行对比分析，结合葡萄酒中氨基酸的含量，选择丹黄酰氯-柱前衍生高效液相色谱法-荧光法进行葡萄酒中氨基酸测定。
对样品的处理方法、衍生反应条件、色谱分离条件等进行了优化，通过回收率、稳定性及精密度等一系列的研究，建立了高效液相色谱法-荧光法同时测定精氨酸(Arg)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、甘氨酸(Gly) 、丙氨酸(Ala)、酪氨酸(Tyr) 、脯氨酸(Pro)、γ-氨基丁酸（Gaba）、缬氨酸(Va1)、蛋氨酸(Met)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、色氨酸（Trp）、苯丙氨酸(Phe)等14种氨基酸分析方法, 2015年12月，起草工作组在前期工作基础上形成标准征求意见稿。
氨基酸含量分析法
新增附录附录XX 氨基酸分析法氨基酸分析法是指用于测定蛋白质、肽及其他药物制剂的氨基酸组成或含量的方法。
根据氨基酸组成分析可以对蛋白质及肽进行鉴别，氨基酸分析法可用于确定蛋白质、肽及氨基酸的含量，及测定可能存在于蛋白质及肽中的非典型氨基酸。
进行氨基酸分析前，必须将蛋白质及肽水解成单个氨基酸，具体水解方法由各品种项下规定。
蛋白质及肽水解后，其氨基酸分析过程与用于其他药物制剂中游离氨基酸的分析过程相同。
本法包括四种柱前衍生法，分别为异硫氰酸苯酯（PITC）法、6-氨基喹啉－N－羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯（AQC）法、邻苯二醛（OPA）和9-芴甲基氯甲酸甲酯（FMOC）法、2，4-二硝基氟苯（DNFB）法，以及一种茚三酮柱后衍生法。
不同的品种应针对自身所含的氨基酸种类及各氨基酸的含量选择适宜的氨基酸分析方法并做相应的方法学验证。
由于本法衍生过程中衍生溶液量较少，且容易挥发，外标法极易出现较大的误差，建议采用内标法进行测定，内标的确定由各品种项下规定。
在本法中，由于半胱氨酸或胱氨酸的衍生产物不稳定，因此对于含半胱氨酸或胱氨酸的样品衍生后应尽快测定，或者在衍生前对半胱氨酸或胱氨酸进行适当的处理，使其转化为稳定地产物（如磺基丙氨酸或半胱氨酸-硫代丙酸）后再衍生测定，具体方法由各品种项下规定。
在测定过程中，可根据所用的仪器、色谱柱品牌、色谱柱的长度及要分离的氨基酸种类，对流动相的有机溶剂和洗脱梯度作适当调整以获得较好的分离度。
第一法 PITC柱前衍生氨基酸分析法本法系根据氨基酸与异硫氰酸苯酯（PITC）反应，生成有紫外响应的氨基酸衍生物苯氨基硫甲酰氨基酸（PTC-氨基酸），PTC-氨基酸经反相高效液相色谱分离后用紫外检测，在一定的范围内其吸光值与氨基酸浓度成正比。
本方法的线性浓度范围为0.025～1.25µmol/ml。
试剂（1）流动相A 0.1mol/L醋酸钠溶液(取无水醋酸钠8.2g，加水900ml溶解，用冰醋酸调pH至6.5，然后加水至1000 ml)-乙腈(93:7)。
2010版药典氨基酸检测方法
附录XX 氨基酸分析法氨基酸分析法是指用于测定蛋白质、肽及其他药物制剂的氨基酸组成或含量的方法。
根据氨基酸组成分析可以对蛋白质及肽进行鉴别，氨基酸分析法可用于确定蛋白质、肽及氨基酸的含量，及测定可能存在于蛋白质及肽中的非典型氨基酸。
进行氨基酸分析前，必须将蛋白质及肽水解成单个氨基酸，具体水解方法由各品种项下规定。
蛋白质及肽水解后，其氨基酸分析过程与用于其他药物制剂中游离氨基酸的分析过程相同。
本法包括四种柱前衍生法，分别为异硫氰酸苯酯（PITC）法、6-氨基喹啉－N －羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯（AQC）法、邻苯二醛（OPA）和9-芴甲基氯甲酸甲酯（FMOC）法、2，4-二硝基氟苯（DNFB）法，以及一种茚三酮柱后衍生法。
不同的品种应针对自身所含的氨基酸种类及各氨基酸的含量选择适宜的氨基酸分析方法并做相应的方法学验证。
由于本法衍生过程中衍生溶液量较少，且容易挥发，外标法极易出现较大的误差，建议采用内标法进行测定，内标的确定由各品种项下规定。
在本法中，由于半胱氨酸或胱氨酸的衍生产物不稳定，因此对于含半胱氨酸或胱氨酸的样品衍生后应尽快测定，或者在衍生前对半胱氨酸或胱氨酸进行适当的处理，使其转化为稳定地产物（如磺基丙氨酸或半胱氨酸-硫代丙酸）后再衍生测定，具体方法由各品种项下规定。
在测定过程中，可根据所用的仪器、色谱柱品牌、色谱柱的长度及要分离的氨基酸种类，对流动相的有机溶剂和洗脱梯度作适当调整以获得较好的分离度。
第一法PITC柱前衍生氨基酸分析法本法系根据氨基酸与异硫氰酸苯酯（PITC）反应，生成有紫外响应的氨基酸衍生物苯氨基硫甲酰氨基酸（PTC-氨基酸），PTC-氨基酸经反相高效液相色谱分离后用紫外检测，在一定的范围内其吸光值与氨基酸浓度成正比。
本方法的线性浓度范围为0.025～1.25μmol/ml。
试剂（1）流动相A 0.1mol/L醋酸钠溶液(取无水醋酸钠8.2g，加水900ml溶解，用冰醋酸调pH至6.5，然后加水至1000 ml)-乙腈(93:7)。
氨基酸分析原理与方法
• 离子树脂分离柱。
（二）离子交换树脂：
• 用作氨基酸分离柱的固定相一般都是固体的合 成离子交换剂。作为理想的离子交换剂应符合 下列要求：
• 1.机械强度好 • 2.不溶解且具有很好的化学稳定性 • 3.均匀球状颗粒 • 4.当装入柱子后应有良好的透通性 • 5.交换容量大 • 6.离子交换基应是单一的官能性的
酸性氨基酸：天门冬氨酸、天门冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺。 碱性氨基酸：赖氨酸、羟赖氨酸、组氨酸、精氨酸。
2.按人体营养的需要又可分为必需氨基酸、半必 需氨基酸及非必需氨基酸（见下表）。
必需氨基酸 赖氨酸
色氨酸 苯丙氨酸 亮氨酸 异亮氨酸 苏氨酸 蛋氨酸 缬氨酸
半必需氨基酸 组氨酸 精氨酸 甘氨酸 胱氨酸 酪氨酸
（（二二））氨氨基基酸酸的的分分类类：：
有两种分类： 1.按氨基酸具有的酸性和碱性基团的多少分类：
中性氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨 酸、丝氨酸（以上七种又称脂肪族氨基酸）、苯丙氨酸、酪氨 酸、色氨酸（这三种又称芳香族氨基酸）、蛋氨酸、胱氨酸、半 胱氨酸（含硫氨基酸）、脯氨酸、羟脯氨酸（属亚氨基酸类）。
• 二军大、天津总医院多家医学单位利用氨基酸分析技术 叙述了人体血高半胱氨酸含量的升高可导致动脉硬化及血 栓的形成。为医疗诊断病因提供了可靠的依据。
（二）饲料上的应用
• 1.质量控制：
• 各种饲料均由不同种类原料按一定比例配置而成，其中必 需氨基酸的含量和它们之间的比例必须恰当，才能满足畜 禽身体合成蛋白质的需要。测定原料和产品中的氨基酸含 量，以达到保证质量的目的。同时氨基酸分析技术即可对 产品质量进行简单又防止伪劣产品进入市场。
氨基酸的分析方法综述
氨基酸的分析方法综述曾念辉(江西万安实验中学)摘 要:氨基酸电分析研究是生命科学中令人关注的课题。
本文就各种氨基酸的分析化学研究的最新进展进行了综述。
关键词:氨基酸 分析方法 综述0 前言氨基酸是生物体中重要的生命物质,是组成酶和蛋白质的基本单元。
作为小分子,氨基酸对生物大分子的活性及其生理功能起着极为重要的作用;作为配体,它可与多种金属离子配位,为研究抗肿瘤、抗癌药物提供信息。
各种氨基酸在生物体中具有不同的生物功能,如生物体中的色氨酸与脑的正常代谢有密切的关系,L一半胱氨酸能增强生物体的抗病能力,因此,准确灵敏地测定食物、药品和生物样品中氨基酸的含量具有十分重要的意义。
目前,对氨基酸的分析测定多采用离了交换色谱(IEC)、高效液相色谱(HPLC)或气相色谱(GC)等仪器,这些仪器所用的检测器包括紫外可见光谱吸收、荧光、化学发光等。
然而,由于多数氨基酸的紫外可见光谱的吸收极弱,自身又无荧光,因此不能直接检测。
通常需要衍生化处理来提高检测的灵敏度和选择性。
电化学方法以其简单、灵敏、无放射、无污染等特点越来越受到人们的关注。
本文对近年来各种化学方法分析氨基酸已获得的进展进行评述。
1 氨基酸的直接电化学分析对于胱氨酸、半胱氨酸、酪氨酸等电活性的氨基酸一般采用直接电分析法。
使用循环伏安法可以直接测定L-半胱氨酸,在pH值小于7的磷酸盐缓冲溶液中,在金电极上于0.96V处有一氧化峰,在-0.75V左右有一还原峰,氧化峰和还原峰的峰电流的大小与半胱氨酸的浓度成正比。
有研究报道,不经衍生化处理,可以直接检测色氨酸和酪氨酸的含量,分别置聚酰胺修饰的碳糊电极于以0.2mol/LHCl-C H3COONa(p H=3.0)为底液的色氨酸和酪氨酸溶液中,从0.5V- 1.50V进行循环伏安扫描,色氨酸和酪氨酸分别在0.94V和0.92V 呈现一个稳定的氧化峰,随扫描次数的增多,两个氧化峰的峰电流都减小,结合2.5次微分技术,色氨酸和酪氨酸的检测限可达到0.024mol/L和0.034mol/L,相对标准偏差分别为5.2%和7.%。
HPLC—PITC衍生法测定新疆葡萄树伤流液氨基酸含量的研究
２ Ｏ １ ３年 １ １月
新 疆 医 科 大 学 学 报 Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ｘ ｉ ｎ ｊ ｉ ａ ｎ ｇ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ
Hale Waihona Puke Ｖｏ ｌ ｜ ３ ６ Ｎｏ． １１
ＮＯＶ ２ Ｏ１ ３
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氨基酸分析解决方案及原理
氨基酸分析解决方案序列号：L009 作者：孔维超，顾春艳摘要氨基酸组成测定是蛋白质组学、食品质量检测以及药品质量检测中的重要分析项目。
由于该分析项目涉及的化合物种类繁多，且需要柱前或柱后衍生技术，对分析方法和分析产品具有较高要求。
迪马科技应用实验室分别以异硫氰酸苯酯、2,4-二硝基氟苯作为衍生剂对蛋白质水解液和游离氨基酸注射液进行衍生，然后使用Diamonsil AAA柱进行分离，能够满足19种天然氨基酸的分析，各组分分离度较高、定量结果准确而稳定。
引言从化学角度讲，同时含有一个或多个氨基和羧基的脂肪酸均可称为氨基酸。
自然界存在300多种氨基酸，但构成天然蛋白质的氨基酸只有20种，这20种氨基酸又称为天然氨基酸。
氨基酸通过氨基和羧基形成肽键(酰胺键)相互联结成多肽和蛋白质。
天然氨基酸上的氨基与羧基连在同一个C上，所以这些氨基酸均为α-氨基酸。
天然氨基酸分析是食品、饲料和药品分析的重要项目。
目前氨基酸分析常常采用这样两种方式：离子交换色谱分离-柱后衍生和柱前衍生-反相色谱法分离。
后者以操作灵活、费用低廉而被广泛应用。
在柱前衍生-反相色谱法分离中，异硫氰酸苯酯(PITC)和2,4-二硝基氟苯(DNFB)均可与一级胺、二级胺反应，是理想的柱前衍生剂。
尽管天然氨基酸多达20种，但由于蛋白质水解过程中天冬酰胺和谷氨酰胺分别转化为天冬氨酸和谷氨酸，半胱氨酸则以胱氨酸形式存在，因而对于含蛋白食品、饲料等样品的氨基酸分析时，只需分析Asp(天冬氨酸)、Glu(谷氨酸)、Ser(丝氨酸)、Gly(甘氨酸)、His(组氨酸)、Arg(精氨酸)、Thr(苏氨酸)、Ala(丙氨酸)、Pro(脯氨酸)、Tyr(酪氨酸)、Val(缬氨酸)、Met(甲硫氨酸)、Cys-Cys(胱氨酸)、Ile(异亮氨酸)、Leu(亮氨酸)、Phe(苯丙氨酸)、Trp(色氨酸)、Lys(赖氨酸)等18种氨基酸，PITC和DNFB均能与这些氨基酸生成稳定的衍生物。
氨基酸分析指导原则
附件：氨基酸分析指导原则草案公示稿氨基酸分析指导原则氨基酸分析系指采用适宜的方法测定蛋白质、多肽或其他药物制剂中氨基酸组成和/或含量。
药品中氨基酸分析通常采用基于高效液相色谱法分离的衍生化法，涉及样品的水解、衍生化反应、分离检测和数据处理等操作。
本指导原则概述了药品中氨基酸分析的基本要求、蛋白质和多肽样品的水解、常用测定方法及其数据分析，为药品中氨基酸的分析提供指导。
1 基本要求1.1仪器氨基酸分析使用的仪器通常是高效液相色谱仪或氨基酸分析仪。
高效液相色谱仪适用于柱前衍生化产物的分离检测；对于柱后衍生化法，由于离子交换分离过程的复杂性和对柱后衍生化反应装置的特殊要求等，一般使用商品化的氨基酸分析仪。
1.2内标物氨基酸分析常采用内标法，内标物应是非天然存在的一级氨基酸，易于获取且价格便宜，在水解过程保持稳定，其色谱响应应与浓度成线性关系，具有独特的保留时间且与待测氨基酸能有效分离。
常用的内标物包括正亮氨酸、α-氨基丁酸、正缬氨酸、肌氨酸和硝基酪氨酸等。
内标物应在水解前或衍生化反应前添加到氨基酸混合物中，以消除由于水解、衍生化、取样、进样、溶液稳定性和色谱条件变化所导致的差异。
1. 3方法验证用于品种项下的氨基酸分析方法，包括样品水解，应参照分析方法验证指导原则（通则9101）进行方法学验证。
1.4水解管的清洗与要求为避免如手套粉末和指纹残留物等对分析结果的影响，水解管应清洗干净。
或使用一次性的水解管。
清洗方法：将水解管用1mol/L盐酸溶液中煮沸1小时，或将其浸泡在浓硝酸或浓盐酸-浓硝酸（1：1）混合液中1小时，再依次用高纯水、HPLC级甲醇冲洗，烘干并密封保存，以免再次污染。
2 蛋白质和多肽样品的水解蛋白质或多肽样品中的氨基酸是以结合形式存在，必须经过水解处理，形成游离氨基酸后才能进行氨基酸分析。
水解方法主要有酸水解，同时辅以碱水解。
酸水解中使用最广泛的是盐酸水解，所得氨基酸不消旋，但该方法引起一些氨基酸的破坏或部分破坏，如色氨酸被破坏，丝氨酸、苏氨酸和半胱氨酸被部分破坏，门冬酰胺和谷氨酰胺脱酰胺分别转化为门冬氨酸和谷氨酸。
多肽类药物的氨基酸检测方法
多肽类药物的氨基酸检测方法多肽类药物的氨基酸组分测定步骤：多肽的水解方法→衍生→HPLC检测。
简述多肽药物的水解方式及衍生方法。
标签：氨基酸组分；柱前衍生法；多肽药物多肽类药物是由20种氨基酸按照一定的顺序通过肽键、二硫键连接成一长链或环状结构，常具备α螺旋、β折叠或不规则卷曲的二级结构。
多肽的一级结构决定了药物的高级结构及功能。
分析多肽类药物的氨基酸组成是进行多肽类药物结构确证不可缺少的部分。
氨基酸组成分析的步骤：多肽的水解方法→衍生→HPLC检测。
1 多肽的水解方法虽然多肽的氨基酸组成分析方法较多，且趋向更灵敏、更精确、更简便、更快速，但还没有一种方法可以单独适用于所有氨基酸残基的检测，并且很多因素如温度、时间、水解试剂、水解方法及多肽样品中添加剂等对水解程度均有影响。
常用的水解方法作简要介绍如下：1.1 酸性水解[1]酸性水解是应用最为广泛水解方法，可以使大多数氨基酸残基完全水解，最通用的水解剂是6 mol/L HCl。
条件：6 mol/L HCl、真空、110℃，水解时间为20～24h。
即可用于液相水解模式也可用于气相水解模式。
但在该条件下，天冬酰胺和谷氨酰胺分别被完全水解为天冬氨酸和谷氨酸，色氨酸则被完全破坏，半胱氨酸先用二硫代二丙酸、4-乙烯吡啶或碘代乙酸保护后水解方可测定，酪氨酸部分被水解液所破坏，丝氨酸和苏氨酸被部分水解。
有些脂肪族氨基酸残基间的肽键难于裂解，可以通过延长水解时间如水解92h甚至120h来解决。
1.2 碱性水解碱性水解一般选用NaOH和KOH作为水解剂。
该水解方法是HCl水解的互补法。
因为碱水解时，多数氨基酸遭到破坏或外消旋化，仅色氨酸是稳定的。
所以此法仅限于测定色氨酸。
1.3 酶水解用一组蛋白酶水解肽链，特别适用于对化学水解敏感的氨基酸如天冬酰胺和谷氨酰胺的测定。
水解过程中氨基酸不发生消旋化，几乎可以保持所有的组成氨基酸不被破坏。
但是因为酶水解条件温和，对天冬酰胺、谷氨酰胺等皆无破坏作用，且反应需要较长的时间，水解不完全，酶本身也是蛋白质，对样品的测定结果可能会有干扰。
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氨基酸的测定（）
检验标准：□ GB/T 5009.124-2003 □其他
检验日期：年月日温度：℃湿度： %
仪器名称和编号：电子天平（编号：）
高效液相色谱仪（编号：）
氨基酸对照品溶液和供试品溶液的配制：
正亮氨酸内标溶液：称取正亮氨酸 mg，加0.02mol/L盐酸溶液100ml溶解。
（每1ml 相当于 1.0 mg）
对照品溶液：取氨基酸贮备溶液（含各种氨基酸µmol/ml，公司、批号） 0.6 ml，加色氨酸对照品溶液〔取色氨酸（中检所，批号）mg置50ml量瓶中，加0.02 mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀〕 0.2 ml，加正亮氨酸内标溶液加 0.1 ml，再加 0.1 ml0.02 mol/L盐酸溶液, 混匀，得对照品溶液。
供试品溶液：取本品，按下述方法试验：□方法1 □方法2。
取样量（单位：□g□ml）
□方法1：置顶空瓶中，加入6mol/L盐酸溶液 ml，抽真空或充氮气，封管，放入110℃烘箱中，水解24小时，冷却，打开封口，将水解液转移到 ml量瓶中，用水洗涤顶空瓶，合并洗涤液至量瓶，用水稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液 ml，置蒸发皿中，水浴蒸干，残渣用0.02 mol/L盐酸溶液溶解并定容至 ml。
□方法2：置 ml量瓶中，再加正亮氨酸内标溶液 ml，用0.02 mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，得供试品溶液。
溶液配制：
（1）三乙胺乙腈溶液：取三乙胺1.4ml，加乙腈（色谱纯）8.6ml，混匀（1mol/L三乙胺乙腈溶液）。
（2）异硫氰酸苯酯乙腈溶液：取异硫氰酸苯酯25µl，加乙腈（色谱纯）2ml，混匀（0.1mmol/L 异硫氰酸苯酯乙腈溶液）。
氨基酸对照品溶液和供试品溶液的衍生：
精密量取氨基酸对照品溶液及供试品溶液各200µl，分别置1ml离心管中，每个离心管中加入三乙胺乙腈溶液100µl，异硫氰酸苯酯乙腈溶液100µl，混匀，室温放置1小时，然后加入正己烷400µl，振摇后放置10分钟，取下层溶液（PTC－AA），用0.45µm微孔滤膜滤过。
色谱柱（分析柱）：Venusil XBP-C18柱（）
柱温：40℃
检测器：紫外、检测波长：254nm
流动相配制：
流动相A：称取25.2g三水醋酸钠，加水1850ml，溶解后用冰醋酸调pH至6.5，然后加乙腈140ml，混匀，用0.45µm滤膜滤过。
流动相B： 80％乙腈溶液
流速：1.0 ml/min 进样量：2µl
梯度程序：
含量=平均f×供试品峰面积/内标峰面积/供试品浓度
结论判断依据：□企业标准□其他
检验结论：□符合规定□不符合规定。